CN109468286A

CN109468286A - 新型多铜氧化酶及其在降解生物胺中的应用

Info

Publication number: CN109468286A
Application number: CN201811383747.4A
Authority: CN
Inventors: 方芳; 徐洁; 陈坚; 曾伟主
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2019-03-15

Abstract

本发明公开了新型多铜氧化酶及其在降解生物胺中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供的多铜氧化酶的最适pH为3.5，最适温度为50℃，铜离子能够促进酶活，使酶活提高2倍；且该酶能够耐受18％的NaCl，显著优于现有的多铜氧化酶。本发明提供的多铜氧化酶重组酶具有较强的降解生物胺的性能，降解谱广，能够在24h内降解色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺，在生物胺模拟体系中对总胺的降解率达39％，其中，对组胺的降解效果最好；该酶在酱油中对总胺的降解率达到13％，对腐胺、苯乙胺具有较明显的降解作用。本发明提供的多铜氧化酶有助于提高发酵食品的安全性。

Description

新型多铜氧化酶及其在降解生物胺中的应用

技术领域

本发明涉及新型多铜氧化酶及其在降解生物胺中的应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

生物胺是一类具有生物活性的小分子量含氮有机物的总称，是生物体内正常的生理活性物质，微量生物胺在机体细胞活动中发挥着重要作用，当人体摄入过量的生物胺，尤其是同时摄入多种生物胺时，会引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命。食品中常见的生物胺主要包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺和组胺等。

目前主要从三个方面控制食品中的生物胺，1、从源头控制：控制游离氨基酸的含量，局限性在于会影响某些高蛋白食品的风味；采用无氨基酸脱羧酶活性的菌株代替原生产菌种，局限性在于仅适用于封闭的单菌发酵体系。2、过程控制：通过对生产过程中的原料、温度和盐度进行合理选择，抑制生物胺产生菌的生长，以达到抑制生物胺产生的目的，局限性在于加工温度和盐度等因素多由食物特性决定，而低温贮藏会提高设备和能耗费用，且有些微生物低温下也能产生生物胺；添加降解生物胺的菌株，局限性在于人们担心添加菌株的安全性以及可能会影响食物风味。3、末端消除：通过向发酵食品中添加生物胺降解酶，不损害食品营养，不产生新的毒性物质，局限性在于现有生物胺降解酶降解效果差，降解类型少，最适pH偏中性，不适用酱油等酸性发酵食品。

目前，利用生物胺降解酶降低酱油中的生物胺主要有三个方面的难点：第一，酱油中的环境偏酸性，添加进酱油的生物胺降解酶需要具有耐酸特性；第二、酱油中的环境是高盐环境，添加进酱油的生物胺降解酶需要具有耐盐特性；第三，酱油中生物胺种类多，添加进酱油的生物胺降解酶若专一降某种生物胺，则无法满足酱油中应用的需要。鉴于以上背景，急需找到一种降解效果好，最适pH偏酸性的生物胺降解酶来降低酱油中生物胺的含量。

多铜氧化酶是一类含铜氧化酶家族，少数多铜氧化酶能将生物胺催化氧化成对应的醛、氨和水，且能降解的生物胺的类型少(仅能降解组胺、酪胺、腐胺中的一种或多种)。现有技术中还没有报道过在pH4.5左右、18％NaCl的环境中具有降解生物胺的作用的多铜氧化酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种可降解生物胺的多铜氧化酶，以及表达所述多铜氧化酶的重组菌，本发明制备的多铜氧化酶可用于降解生物胺，尤其是酱油中的生物胺。

本发明提供了多铜氧化酶，所述多铜氧化酶来源于食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria)，来源于W.cibaria的多铜氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，相应地，基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了表达多铜氧化酶的重组大肠杆菌，是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为表达载体，例如以pET-28a为表达载体。

本发明还提供了应用所述重组大肠杆菌生产多铜氧化酶的方法，是将重组大肠杆菌接种至培养基中，培养后收集菌体细胞，破碎细胞，从细胞破碎液中收集多铜氧化酶。例如，将所述重组大肠杆菌接种至TB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG以及铜离子诱导多铜氧化酶的表达。

本发明还提供了所述重组大肠杆菌在降解生物胺方面的应用，尤其是在食品领域降低生物胺方面的应用。例如，降解酱油中的生物胺。可以将多铜氧化酶添加至酱油中，降解酱油中的生物胺。所述生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺中的至少一种。

有益效果：与已报道的酶相比，本发明提供的多铜氧化酶重组酶在氨基酸序列以及核苷酸序列方面具有较大差异，在酶学性质以及降解生物胺的能力上也存在差异。本发明提供的多铜氧化酶的最适pH为3.5，最适温度为50℃，铜离子能够促进酶活，使酶活提高2倍；且该酶能够耐受18％的NaCl，其耐盐性显著优于现有的多铜氧化酶。本发明提供的多铜氧化酶重组酶具有较强的降解生物胺的性能，降解谱广，能够在24h内降解色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺，在生物胺模拟体系中对总胺的降解率达39％(总胺大约720mg/L)，其中，对组胺的降解效果最好；该酶在酱油中对总胺的降解率达到13％(酱油中总胺大约800mg/L)，对腐胺、苯乙胺具有较明显的降解作用。本发明提供的多铜氧化酶有助于提高发酵食品的安全性。

附图说明

图1 6个菌株的粗酶在酱油中降生物胺的能力；

图2温度对MCOW酶活性的影响；

图3温度对MCOW稳定性的影响；

图4 pH对MCOW酶活性的影响；

图5pH对MCOW稳定性的影响；

图6金属离子对MCOW酶活的影响；

图7MCOW的Lineweaver-Burk双倒数图；

图8MCOW对不同质量分数(W/V)NaCl的耐受性；

图9MCOW对不同体积分数(V/V)乙醇的耐受性。

具体实施方式

实施例1含多铜氧化酶基因的菌株的高通量筛选

初筛培养基(g/L)：酵母膏5、牛肉浸膏5、蛋白胨5、NaCl 10、葡萄糖20、Tween-801mL/L、MgSO₄ 0.2、MnSO₄·H₂O 0.5、FeSO₄ 0.4、柠檬酸三铵2.0、CaCO₃ 0.1、吡哆醛-5-磷酸0.05、K₂HPO₄ 2.0、氨基酸(组氨酸3、酪氨酸3、赖氨酸3、色氨酸3、精氨酸3、鸟氨酸3、苯丙氨酸3)、溴甲酚紫0.6，调pH至6.0±0.2。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10，pH 7.0±0.2。

MRS培养基(g/L)：酵母膏4、牛肉膏5、蛋白胨10、葡萄糖20吐温80 1mL/L、MgSO₄0.2、MnSO₄ 0.05、K₂HPO₄ 2、柠檬酸三铵2、乙酸钠5、吡哆醛-5-磷酸0.05，pH 6.0±0.2。

各种生物胺含量的检测方法：参考GB/T5009.208-2008食品中生物胺含量的测定方法。

采用可见光吸收测定法测定多铜氧化酶酶活：采用的底物为ABTS，利用反应动力学仪器检测酶与底物反应2min后的吸光度来计算多铜氧化酶酶活。反应体系包括100μL粗酶液、2.9mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液含0.5mmol/L的ABTS、1mmol/L的CuCl₂)。将每分钟催化1μmol底物氧化所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

式中：

ε：ABTS在420nm下的摩尔吸光系数，ε＝3.6×10⁴M^-1cm^-1

Δt：2min；

ΔOD：2min内，吸光度OD₄₂₀的变化值；

V₁：酶反应体系中，反应液的总体积，即3mL；

V₂：酶反应体系中，酶液的体积，即100μL。

利用高通量筛选的方法，将待筛选的菌株接种到添加了溴甲酚紫的初筛培养基中。根据颜色的变化，从大约8000个菌株中，初步筛选到不产生物胺的菌株70株。根据生物胺氧化酶降解生物胺生成的产物醛可以和新制Cu(OH)₂生成砖红色沉淀这一原理，从初筛获得的70株阴性菌中，筛选得到15株含生物胺氧化酶降生物胺的菌株。采用可见光吸收测定法进行多铜氧化酶酶活测定，排除9株含其他生物胺氧化酶的菌株，最终确定6株菌作为含多铜氧化酶基因的菌株进行后续实验。经16S rRNA鉴定这6株菌分别为Weissellacibaria、Weissella paramesenteroides、Weissella confusa、Bacillusamyloliquefaciens、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus plantarum。

将上述6株菌中的乳酸菌接种到MRS培养基中，其余到接种到LB培养基中，37℃静置培养约20h，8000rmp离心10min收集菌体，用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤菌体去除菌体中残存的发酵液，重复2次。用1/5体积的20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)重悬菌体，置于冰水浴中超声破碎，至溶液清透，离心后取上清液，将上清液作为粗酶液。取2mL粗酶液与2mL酱油进行混合，将混合物置于37℃培养箱中共培养24h后，于10000rmp的离心5min取上清液，利用HPLC测定生物胺的含量。将未添加粗酶液的酱油在37℃放置24h，作为对照。

如图1所示，在酱油中，W.cibaria的粗酶液能够降解苯乙胺、组胺、酪胺、精胺，且在6株菌中，W.cibaria的粗酶液对总胺的降解率最高，能够达到11.3％。

实施例2多铜氧化酶基因的克隆表达

1、获得目的片段：根据NCBI中的Weissella cibaria strain AB3b(GenBank登录号为:NZ_JWHT01000002.1)中的多铜氧化酶的基因序列设计引物，引物如下(5’-3’)：

上游CCGGAATTCATGAAAAACTATACGGACTATTTCTT

下游CCCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGATGATGCATTTTCATTCCCATTTTT

以W.cibaria的基因组为模板，PCR扩增编码多铜氧化酶的基因。PCR扩增结束后，PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中的结果显示有1500bp左右的目的条带。用DNA胶回收试剂盒将PCR产物纯化，回收得到目的片段，经过测序，W.cibaria来源的多铜氧化酶MCO的基因序列如SEQ ID NO.1所示，相应地，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2所示。

W.cibaria来源的多铜氧化酶的氨基酸序列与几种已报道的细菌(Lactobacillusplantarum、Lactobacillus paracasei、Pediococcus pentosaceus)的多铜氧化酶的氨基酸序列相比，均有四个铜结合保守结构域。W.cibaria来源的多铜氧化酶的氨基酸序列与Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei、Pediococcus pentosaceus来源的多铜氧化酶氨基酸序列相似度分别为65.64％、97.86％、95.92％。

2、获得载体：将含有质粒pET-28a的大肠杆菌划线到含卡那霉素的LB平板上，培养12h后，挑单菌落到20mL/250mL摇瓶LB培养基中(含卡那霉素)，37℃下200r·min^-1过夜培养，使用质粒提取试剂盒提质粒。

3、酶切连接：根据多铜氧化酶基因序列和质粒pET-28a的序列选择合适的限制性内切酶EcoRI、HindIII，将多铜氧化酶基因序列和载体都用限制性内切酶EcoRI、HindIII处理。然后将酶切后的目的片段与质粒pET-28a按摩尔比4～10：1的比例混合，通过SolutionI连接酶进行连接反应，于16℃金属浴中连接过夜得到连接产物。

4、转化：向感受态细胞大肠杆菌JM109(克隆宿主)中加入5μL连接产物，均匀混合后于冰中静置30min。42℃水浴90s后立即取出于冰中放置2-5min。加入700μL LB培养基，于摇床(37℃，200r·min^-1)振荡培养1h。将培养液于4000r·min^-1离心2min，弃去大部分上清液，留100μL左右上清液重悬菌体。将重悬得到的菌液均匀涂布于含有卡那霉素的平板，置于37℃培养箱中培养，挑取单菌落，通过菌落PCR筛选阳性转化子。

5、筛选出含重组质粒的阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，对所得质粒用EcoRI、HindIII酶切处理，通过凝胶电泳验证是否产生相应的酶切片段。

6、选2～3个酶切验证结果正确的重组质粒送至上海生工测序，挑选测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得重组菌，命名为pET-28a-MCOW/BL21。

7、将重组菌pET-28a-MCOW/BL21接种到LB培养基中，于37℃、220r/min条件下过夜培养。将种子液按1％的接种量转接到TB培养基中，于37℃、220r/min条件下培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度为1mM的Cu²⁺并且加入终浓度为0.1mM的IPTG，20℃振荡培养20h。将所得发酵液于4℃、8000r/min离心15min，收集菌体沉淀物，用20mmol·L^-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液将菌体洗涤2遍，之后用磷酸盐缓冲液将菌体重悬。将菌体悬液置于冰水浴上，利用超声波破碎菌体细胞，超声波功率为35％、振2s停4s，直至溶液清亮为止。将破碎液于4℃、10000r·min^-1离心30min收集上清即为所需粗酶液，粗酶液的酶活为140.6U/L，与野生菌相比提高了41倍左右。

实施例3多铜氧化酶的酶学性质(温度、pH、K_m、V_max)

TB培养基(g/L)：蛋白胨12、酵母粉24、甘油5、K₂HPO₄·3H₂O 16.43、KH₂PO₄·12H₂O2.32，pH 7.0±0.2。

粗酶液的制备：按照实例2中第7步诱导重组菌表达，经超声波破碎后得粗酶液，过0.45μL滤膜备用。

蛋白的纯化：在5mL/min的流速下用5～10倍柱体积的去离子水清洗镍柱；在5mL/min的流速下加入约8～10倍柱体积的Binding buffer，使镍柱平衡；在1mL/min的流速下上样；在5mL/min的流速下加入约8～10倍柱体积的Binding buffer，使镍柱平衡；在5mL/min的流速下用不同浓度含咪唑的磷酸缓冲液洗脱镍柱，洗脱液用离心管收集，经SDA-PAGE检测确定洗脱条件，得到纯蛋白。

(1)温度对酶活性及稳定性的影响

采用可见光吸收测定法，将纯化得到的多铜氧化酶与底物分别在25、35、40、45、50、55、60、70、80℃温度条件下测定酶活，以最高的酶活为100％，计算各温度下的相对酶活，以此确定酶的最适反应温度。

将纯化后的多铜氧化酶酶液在25、35、40、45、50、55、60、70、80℃温度条件下温浴，每隔3h取适量酶液，采用可见光吸收测定法在最适温度下测定酶活，以0h测得的酶活为100％，测定不同温度条件对酶活稳定性的影响。

如图2～3所示，MCOW的最适温度为55℃，在40～60℃之内，相对酶活保持40％以上。在55℃下保温3h以后，酶活能保持30％以上。

(2)pH对酶活性及稳定性的影响

在各酶的最适温度条件下，采用可见光吸收测定法测定酶在不同pH条件下的酶活，以最高的酶活为100％，计算各pH条件下的相对酶活，确定最适反应pH。所述不同pH条件分别是指①50mmol/LHAc－NaAc缓冲液、pH 2.5～5.0，②50mmol/L磷酸盐缓冲液pH 5.5～7.0，③50mmol/LTris-HCl缓冲液，pH7.5～8.5。

将纯化后的多铜氧化酶分别保存在上述三种pH件下，每隔3h取适量酶液，与底物在最适温度下反应，以0h测得的酶活为100％，测定不同pH条件对酶活稳定性的影响。

如图4～5所示，MCOW的最适pH为3.5，在pH2.5～4.5，酶活保持50％以上。在pH3下放置3h，酶活保持40％以上，在pH 4～5下放置3h，酶活保持70％以上。

(3)金属离子对酶活的影响

将纯化后的多铜氧化酶与终浓度为1mmol/L的金属离子缓冲液混合，在最适温度、最适pH条件下保温10min，测定酶活力。以未添加金属离子时测得的酶活为100％，测定各酶在不同金属离子环境中的相对酶活，以确定不同金属离子对酶的活力的影响。如图6所示，Cu²⁺能够明显的促进酶活，使酶活提高2倍左右，Fe²⁺对酶活的抑制作用明显，使酶活降低50％，其余金属离子对酶活性的抑制、激活效果不明显。

(4)酶反应动力学常数

在最适的pH条件下，加入不同浓度的ABTS(0.05～0.5mM)，并在最适反应温度下，420nm处分别测定酶活，然后根据计算公式，计算得到K_m、V_max。

横截距＝-1/K_m，纵截距＝1/V_max

如图7所示，依据Lineweaver-Burk双倒数作图法计算得到该酶的K_m、V_max分别为0.17mmol/L，3.67×10^-2mmol/(L·min)。

实施例4多铜氧化酶的特殊酶学性质(耐盐性、耐乙醇)

(1)NaCl对酶稳定性的影响

将纯化后的多铜氧化酶在含不同质量分数NaCl的PBS缓冲液中保温1h，测定酶活；对照组是将酶在不含NaCl的PBS缓冲液中温浴1h，测定酶活；以对照组的酶活为100％，计算酶在含不同质量分数的NaCl的PBS缓冲液中的相对酶活，确定NaCl含量对酶活稳定性的影响。如图8所示，不同质量分数的NaCl对酶的稳定性均有影响，其中18％的NaCl对酶的稳定性影响最小，在含18％的NaCl的缓冲液中放置1h，酶活依然能够保持70％以上。

(2)乙醇对酶稳定性的影响

将纯化后的多铜氧化酶在含不同体积分数乙醇的PBS缓冲液中保温1h，测定酶活；对照组是将酶在不含乙醇的PBS缓冲液中保温1h，测定酶活；以对照组测得酶活为100％，计算酶在含不同体积分数的乙醇的PBS缓冲液中的相对酶活，确定乙醇对酶活稳定性的影响。

如图9所示，乙醇浓度越高，对酶的影响越大，在2.5％乙醇下(日式酱油中的乙醇浓度在2.5％左右)放置1h，酶活依然能够保持70％以上。

实施例5多铜氧化酶对生物胺单胺体系中生物胺的降解

将多铜氧化酶酶液以终浓100U/L分别加到各生物胺单胺体系，37℃反应48h，生物胺单胺体系中单胺终浓为50mg/L；对照用磷酸盐缓冲液取代多铜氧化酶酶液。在生物胺单胺体系中，MCOW对生物胺的降解率如下所示：

MCOW：腐胺>苯乙胺>色胺>亚精胺>酪氨>组胺>尸胺>精胺

表1 MCOW对生物胺单胺体系中的生物胺的降解作用

实施例6多铜氧化酶对混合生物胺体系中生物胺的降解

将多铜氧化酶酶液以终浓500U/L分别加到生物胺混合体系37℃反应24h，生物胺混合体系中生物胺的比例接近于酱油中的生物胺，其中，色胺20mg/L、苯乙胺150mg/L、腐胺50mg/L、尸胺50mg/L、亚精胺50mg/L、组胺200mg/L、酪氨200mg/L。对照用磷酸盐缓冲液取代多铜氧化酶酶液。生物胺降解结果如表2所示。

表2 MCOW在生物胺混合体系中对生物胺的降解作用

实施例7多铜氧化酶在酱油中的应用效果

将多铜氧化酶酶液以终浓500U/L加到酱油中，37℃反应24h，对照用PBS缓冲液取代多铜氧化酶酶液，生物胺降解结果如下表3所示。

表3MCOW在酱油中的降解作用

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 新型多铜氧化酶及其在降解生物胺中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 1548

<212> DNA

<213> Weissella cibaria

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<212> PRT

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65 70 75 80

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Ser Gly Pro Tyr Val Asp Gly Gly Cys His Ala Pro Val Tyr Pro Gly

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Glu Ser Lys His Ile Asp Phe Thr Leu Glu Gln Pro Ala Thr Thr Leu

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Trp Leu His Ala His Pro Cys Pro Ser Thr Ala Glu Gln Val Trp His

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Gly Leu Ala Ala Met Val Ile Val Lys Asp Asp His Glu Ala Ser Leu

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Pro Leu Pro Arg Asn Tyr Gly Val Asp Asp Ile Pro Val Ile Leu Gln

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Asp Arg Arg Phe His Glu Asn Asn Gln Trp Asp Tyr Arg Ala Asp Tyr

195 200 205

Asp Pro Asp Gly Val Ala Gly Pro Thr Ala Met Ile Asn Gly Thr Ile

210 215 220

Asn Pro Tyr Phe Asp Val Thr Thr Gln Lys Ala Arg Leu Arg Phe Leu

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Asp Gly Ala Asn Arg Arg Glu Trp Arg Leu His Phe Ser Asp Asp Leu

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Gly Val Ala Ile Asp Gly Lys Lys Phe Ala Met Gln Arg Ile Asp Ala

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Met Ser Leu Ala Lys Glu Arg Gly Val Lys Pro Ser Glu Ile Trp Met

485 490 495

Gly Gly Met Gln Ser Tyr Glu Lys Met Gly Met Lys Met His His His

500 505 510

His His His

515

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaattca tgaaaaacta tacggactat ttctt 35

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagcttt tagtggtggt ggtgatgatg cattttcatt cccattttt 49

Claims

1.一种多铜氧化酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码多铜氧化酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.携带权利要求2所述基因的细胞或者载体。

4.表达权利要求2所述基因的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌或者酵母菌或者枯草芽孢杆菌或者其他真核细胞为宿主，通过载体表达所述基因或者将所述基因整合到宿主的基因组上进行表达。

5.一种重组表达权利要求1所述多铜氧化酶的重组大肠杆菌，其特征在于，是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为表达载体。

6.应用权利要求5所述重组大肠杆菌生产多铜氧化酶的方法，其特征在于，是将重组大肠杆菌接种至培养基中培养后收集菌体细胞，破碎细胞，从细胞破碎液中获得多铜氧化酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种至TB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG以及铜离子诱导多铜氧化酶的表达。

8.权利要求1所述多铜氧化酶在降解去除食品中的生物胺中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述食品包括酱油，将多铜氧化酶添加至酱油中，降解酱油中的生物胺。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺中的至少一种。