CN108740818A - 一种发酵鸭腿的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵鸭腿的制备方法，特点是包括将在处理好的鸭腿中添加食盐、亚硝酸钠、抗坏血酸、蔗糖、葡萄糖、味精、白胡椒粉、料酒、花椒、洋葱粉、茶多酚和生抽腌制的步骤；将植物乳杆菌、酿酒酵母菌、汉逊氏德巴利酵母和木糖葡萄球菌按体积比(1‑3)：(2‑3)：(1‑2)：(1‑2)的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%‑2%的接种量添加到腌制好的鸭腿中，将鸭腿放到20‑25℃恒温恒湿箱中持续发酵32‑35h的步骤；最后将发酵好的鸭腿煮制30min‑35min，即得到发酵鸭腿成品的步骤，优点是产品风味独特，无土腥味，亚硝酸盐和生物胺残留量低，具有抗氧化功能。
Description
技术领域
本发明涉及鸭腿的制备方法，尤其是涉及一种具有特殊风味发酵鸭腿的制备方法。
背景技术
发酵肉制品是指畜禽肉在自然或人工控制条件下，经特定有益微生物发酵或酶的作用，产生一系列生物化学变化和物理变化后加工制成的一类肉制品。对于有益微生物，人们更是将其单一菌种或复配菌种制剂（即发酵肉制品发酵剂，简称肉品发酵剂）人工接入原料肉中进行发酵，人工接种发酵已成为传统发酵肉制品实现工业化生产的一种普遍做法。然而，发酵肉制品在实现工业化生产的同时也面临一些挑战，如工业化产品在风味上很难与传统发酵肉制品媲美，安全上仍面临单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌的高风险性以及生物胺的潜在风险。作为应对上述挑战的一种可行的非化学添加生物性方式，功能性发酵剂，即具备产良好风味、促进安全以及益生性等优势的肉品发酵剂，受到了国内外研究者的广泛关注。
鸭肉具有低脂肪、低胆固醇、高蛋白等优点，在许多地方深受消费者欢迎。鸭的营养价值很高，可食部分鸭肉中的蛋白质含量约16％－25％，比畜肉含量高得多。鸭肉中的脂肪含量适中，约为7.5％，比鸡高，比猪肉低，并较均匀地分布于全身组织中。脂肪酸主要是不饱和脂肪酸和低碳饱和脂肪酸，易于消化。鸭肉含B族维生素和维生素E较多。它们与碳水化合物、脂肪和蛋白质能量的释放有关，还参与脂肪酸、蛋白质和脱氧核糖核酸的合成。对心肌梗塞等心脏病人有保护作用。核黄素在细胞氧化过程中起着重要作用。硫胺素是抗脚气病、抗神经炎和抗多种炎症的维生素，在生长期、妊娠期及哺乳期的人比一般人需要量更大。维生素E是一种脂溶性维生素，因其重要的抗氧化功能，是人体多余自由基的清除剂，在抗衰老过程中起着重要的作用。
细菌（乳酸菌、葡萄球菌和微球菌）、酵母菌和霉菌等微生物是目前研制发酵肉制品常用的发酵剂，可以被单独或复合使用。选用优良发酵剂，在改善产品的质地及色泽的同时，也提高了产品的营养性和安全性。此外，向肉制品中添加优良发酵剂能够促进其产生芳香化合物，使人产生品尝欲望；产生一些小分子物质，易于人体消化吸收；还可产生细菌素及其他抗菌成分等，一定程度上减少了生物胺、毒素等不利成分，增添了一定的功能性。
乳酸菌是一类可以利用碳水化合物产生大量乳酸的细菌，是从发酵肉制品中最早分离出来的微生物，也是在自然发酵时的主要微生物，一般在整个发酵过程中占有主导优势。乳酸杆菌属、链球菌属和片球菌属等乳酸菌常作为发酵剂，其代谢产物有的能使肉中蛋白发生特异性变化，为发酵肉制品提供了独特风味；有的可抑制腐败菌生长，为产品提高了食用安全性，从而储藏更久。而酵母菌具有好氧、较弱的代谢能力、耐盐性较高。该酵母菌可为发酵肉制品带来一种特征性的酵母味，从而提高发酵香肠等发酵肉制品的风味，对稳定发色过程也有一定帮助。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种色泽鲜艳、无粘液、无霉点；香味浓郁，无鸭肉土腥味；亚硝酸盐及生物胺残留量低；游离氨基酸含量高；具有抗氧化功能；肉质紧密，咸淡适中，咀嚼性好的发酵鸭腿的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种发酵鸭腿的制备方法，包括下述步骤：
（1）腌制
挑选新鲜鸭腿，鸭腿洗净血水，以鸭腿为基准，在处理好的鸭腿中按质量百分比添加食盐1.5%~2%，亚硝酸钠0.013%~0.015%，抗坏血酸0.05%~0.08%，蔗糖1.3%~1.8%，葡萄糖0.8%~1.2%，味精0.1%~0.3%，白胡椒粉0.05%~0.1%，料酒3.7%~4.0%，花椒0.13%~0.15%，洋葱粉0.17%~0.2%，茶多酚0.05~0.10%，生抽6.5%~7%，搅拌均匀后4℃冷藏腌制，24h后取出；
（2）接种发酵
将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌、保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌、汉逊氏德巴利酵母GIM2.184和木糖葡萄球菌CICC10145按体积比(1~3)：(2~3)：(1~2)：(1~2)的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%~2%的接种量添加到腌制好的鸭腿中，将鸭腿放到20-30℃恒温恒湿箱中持续发酵28-35h；
（3）煮制
将发酵好的鸭腿煮制30min~35min，即得到发酵鸭腿成品。
将步骤（1）中鸭腿洗净血水，用刀背轻敲并且在腿上割开几个小口，方便后续腌制步骤的调料入味。
步骤（2）中所述的植物乳杆菌和所述的木糖葡萄球菌的分离纯化过程如下：
（1）活化：将装有MRS固体培养基的锥形瓶121℃，15min灭菌，冷却至40℃，以0.5%~1%的接种量于MRS固体培养基中接入植物乳杆菌或木糖葡萄球菌，于37℃活化4~6h后，再以0.5%~1%的接种量转接于MRS液体培养基中，扩大培养12~16h后取出待用；
（2）分离纯化：在超净工作台中将培养好的菌液倒入离心管中，然后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层液体后，在离心管中加入与一开始加入的菌液等体积的生理盐水，均质后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层清液，再加入等体积的生理盐水重复操作，取沉淀，即得到纯化后的植物乳杆菌或木糖葡萄糖球菌。
所述的MRS 固体培养基的配制方法如下：蛋白胨l0 g，牛肉膏l0g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾 2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5g，葡萄糖10 g，七水硫酸镁 0.5g、七水硫酸锰0.25g和琼脂200g溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH至6.8，121℃灭菌15min；所述的MRS 液体培养基的配制方法如下：蛋白胨l0 g，牛肉膏l0g，酵母提取物5 g，磷酸氢二钾 2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5g，葡萄糖10 g，，七水硫酸镁 0.5g和七水硫酸锰0.25g溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH至6.8，121℃灭菌15min。
步骤（2）中所述的酿酒酵母菌和所述的汉逊氏德巴利酵母的分离纯化过程如下：
（1）活化：将装有YPD液体培养基的锥形瓶121℃，15min灭菌，冷却至40℃，用灭菌的接种环从保藏的酿酒酵母菌或者汉逊氏德巴利酵母斜面中挑出菌落接入至YPD液体培养基中，于30℃活化24h后去出待用；
（2）分离纯化：在超净工作台中将培养好的菌液倒入离心管中，然后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层液体后，在离心管中加入与一开始加入的菌液等体积的生理盐水，均质后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层清液，再加入等体积的生理盐水重复操作，取沉淀，即得到纯化后的酿酒酵母菌或汉逊氏德巴利酵母。
所述的YPD固体培养基的配制方法如下：溶解10g 酵母膏，20g 蛋白胨于900ml水中，加入20g琼脂粉后高压121℃，灭菌20min，最后加入100ml 浓度为0.2g/mL 经灭菌的葡萄糖溶液；所述的YPD液体培养基的配制方法如下：溶解10g 酵母膏，20g 蛋白胨于900ml水中，高压121℃，灭菌20min后，加入100ml 浓度为0.2g/mL 经灭菌的葡萄糖溶液。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种发酵鸭腿的制备方法，对制备得到的发酵鸭腿进行感官和理化指标测评及功能和风味的测定，其结果显示：色泽鲜艳、无粘液、无霉点；香味浓郁，无鸭肉土腥味；亚硝酸盐及生物胺残留量低；游离氨基酸含量高；具有抗氧化功能；肉质紧密，咸淡适中，咀嚼性好。接菌发酵鸭腿感官评分测定为82.75；根据GB2726—2016《食品安全国家标准熟肉制品》和DB 31/2004—2012《食品安全地方标准发酵肉制品》，大肠杆菌等致病菌未检出，低于标准限量的100CFU/mL；亚硝酸盐含量为21.7613-21.7832mg/kg，低于标准限量的30mg/kg；TBA测定为0.2219-0.2304mg/kg，低于标准限量的1mg/kg，游离氨基酸含量为0.7411g/100g。而未接菌的鸭腿感官评分为68.5；大肠杆菌测定量为4×104CFU/mL；亚硝酸盐测定含量为96.75mg/kg，TBA测定为2.9mg/kg，游离氨基酸含量为0.4093g/100g。说明接菌发酵能够很好的抑制大肠杆菌的产生，也可以很好的抑制亚硝酸盐的产生和抑制脂肪的氧化及生物胺的形成。
上述植物乳杆菌（保藏编号为ATCC14917）与酿酒酵母菌（保藏编号为CGMCCNO.7277）具有很好的抑菌作用，将这两种菌添加到鸭肉中，对沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌等致病菌有很好的抑制作用；汉逊氏德巴利酵母GIM2.184与木糖葡萄球菌CICC10145具有促进发色、消除鸭肉土腥味及改善风味的作用。四个菌株按一定比例混合发酵，具有协同效应，可显著降低组胺含量，提高产品的抗氧化性，四个菌株混合发酵所得的产品其组胺含量、亚硝酸盐残留量以及TBA值比任何其中单一的菌株或2-3个菌株混合发酵相应降低10-13.2%、6.4-10%和10.0-19.0%，抗氧化性比任何其中单一的菌株或2-3个菌株混合发酵提高·OH清除率为30.49-75%，DPPH自由基清除率为35.8-69.7%，游离氨基酸中鲜味氨基酸含量提高了23.7-55.49%，鲜味氨基酸和含硫氨基酸是产品香气及风味的重要来源，这对改善肉制品的风味品质和营养价值具有重要作用。通过发酵的方法来加工腌制肉，不仅满足了人们食用的需要，而且也能保证其品质安全可靠。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，标准菌株，保藏号为ATCC14917，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该植物乳杆菌 ATCC 14917发酵液具有最强的超氧阴离子自由基清除能力。自由基清除能力是评价物质抗氧化能力的重要指标。
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，保藏号为CGMCCNO.7277，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）。
木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus），保藏号为CICC10145，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）（北京市朝阳区酒仙桥中路24号）。
汉逊氏德巴利酵母GIM2.184（Saccharomycesdabaryomyces hansenii），保藏号为GIM2.184，购于广东省微生物菌种保藏中心（广州市先烈中路100号广东省微生物所）。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一、实验测定方法
1、感官评价
挑选20名食品专业的学生对所制作出的鸭腿成品进行感官评价，分别从外观、滋味、气味、口感四个方面进行打分，打分的标准如下表：
2、大肠杆菌的检测
采用平板计数法。试验程序如下所示：检样：25g（mL）样品+225mL稀释液（10倍系列稀释），选择2~3个适宜连续稀释度的样品均液，接种VRBA~MUG平板（36 ℃±1 ℃的条件下培养18 h～24 h），紫外灯照射，计数发荧光菌落。
3、亚硝酸盐含量的测定
采用离子色谱法测定。鸭腿肉上清液的制备：用四分法取适量的鸭腿肉的制备成品，用食物粉碎机制成匀浆，称取鸭腿肉匀浆2 g（精确至0.01 g），以80 mL 水洗入100 mL 容量瓶中，超声提取30 min，每5 min 振摇一次，保持固相完全分散。于75 ℃水浴中放置5 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10 000 转/分钟离心15 min，分离得到鸭腿肉的上清液。色谱柱是Dionex IonPac AS11~HC 4 mm×250 mm（带IonPac AG11~HC 型保护柱4 mm×50 mm）；淋洗液为氢氧化钾溶液，浓度为 6 mmol/L～70mmol/L，洗脱梯度为6 mmol/L 30 min，70mmol/L 5 min，6 mmol/L 5 min，流速 1.0 mL/min；抑制器是连续自动再生膜阴离子抑制器。检测器是电导检测器，检测池温度为 35 ℃，进样体积达50μL的色谱条件下进行测定。首先移取亚硝酸盐和硝酸盐混合标准使用液，加水稀释，制成系列标准溶液，然后分别吸取空白和咸腊肉溶液50μL，在相同工作条件下，依次注入离子色谱仪中，记录色谱图。根据保留时间定性，分别测量空白和样品的峰高（μS）或峰面积。亚硝酸盐（以NO2~计）的含量测定公式如下：
X=[(c~c0)×V×f×1000]/(m×1000)
式中：
X~~测定样品中亚硝酸根离子的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
c ~~测定用样品溶液中的亚硝酸根离子浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
c0~~试剂空白液中亚硝酸根离子的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V~~测定样品溶液体积，单位为毫升（mL）；
F ~~测定样品溶液稀释倍数；
m~~测定样品的取样量，单位为克（g）。
说明：试样中测得的亚硝酸根离子含量乘以换算系数1.5，即得亚硝酸盐（按亚硝酸钠计）含量。
4、硫代巴比妥酸(TBA)值的测定
按硫代巴比妥酸实验法测定。称取10.00g绞碎置于凯氏蒸馏瓶中，加入20mL蒸馏水搅拌均匀，然后加2mL盐酸溶液(1:2)及2mL液体石蜡。采用水蒸气蒸馏，收集50mL蒸馏液。取5mL蒸馏液与5mL TBA醋酸溶液充分混合，再水浴(100℃)加热35min后冷却，在535nm波长处测吸光度A。以蒸馏水为空白样。
5、游离氨基酸的测定
应用日立L-8800氨基酸分析仪测定
样品前处理：准确称取粉碎瘦肉0.0800g，放入试管，加入15mL 16M的盐酸，混匀，在酒精灯上加热拉细至4-6mm，冷却抽真空10min封管。把封闭试管置110℃士1℃的恒温烘箱中沙浴22h水解。水解样品拿出冷却到室温,准确转移到50ml容量瓶中并定容,摇匀过滤,取滤液1ml到50ml的烧杯中置70℃恒温水浴蒸干待用。
氨基酸分析仪运行条件：分离柱长15cm。泵压80-90kg/cm2；缓冲液流速0.225ml/min；分离柱温度51℃；进样量林样品分析周期30min。
6、抗氧化性测定
（1）DPPH自由基清除率的测定
取待测样品提取液各2mL，分别与2×10-4mol/L的DPPH自由基无水乙醇溶液混合，摇匀后放置30min。以相对应的溶剂(2mL蒸馏水与2mL无水乙醇的混合溶液)为对照，分别测定上述溶液在517nm波长处的吸光度A 1。取待测样品
各2mL，分别与2mL蒸馏水混合均匀后，以蒸馏水为对照，分别测定各混合液于波长517nm波长处的吸光度A 2。取2×10-4mol/L的DPPH自由基无水乙醇溶液2mL与水混合均匀后，以相对应的溶剂(2mL蒸馏水与2mL无水乙醇的混合溶液)为对照，测定上述溶液于517nm波长处的吸光度A 0，清除率(I/%)按以下公式计算：
I（%）=[1-(A1-A2)/A0]×100%
（2）羟自由基(•OH)清除率的测定
取1mL 0.75mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液于试管中，依次加入2mL 0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.40)和1mL蒸馏水，混匀；加入1mL 0.75mmol/L FeSO4·7H2O溶液，混匀，加入1mL 0.01%的H2O2，于37℃水浴反应60min，在536nm波长处测定吸光度A损（A 1），未损伤管以蒸馏水代替损伤管中H2O2，同等操作条件下测吸光度A未(A 2)，样品管分别以样品提取液代替损伤管中的蒸馏水，同等操作条件下测吸光度A，每个样品做3个平行取平均值，清除率计算见下式：
清除率（%）=[(A-A 1)/(A 2-A 1)] ×100%。
二、具体实施例
一种发酵鸭腿的制备方法，包括下述步骤：
（1）鸭腿处理
挑选新鲜鸭腿，新鲜的肉类表面有光泽，并有一种固有的香味，指压时富有弹性，瘦肉鲜红，肥肉洁白，颜色均匀，外表微干或微湿润，不粘手。鸭腿洗净血水，用刀背轻敲并且在腿上割开几个小口，方便调料入味；
（2）腌制
以鸭腿为基准，按质量百分比在处理好的鸭腿中添加食盐1.5%~2%，亚硝酸钠0.013%~0.015%，抗坏血酸0.05%~0.08%，蔗糖1.3%~1.8%，葡萄糖0.8%~1.2%，味精0.1%~0.3%，白胡椒粉0.05%~0.1%，料酒3.7%~4.0%，花椒0.13%~0.15%，洋葱粉0.17%~0.2%，茶多酚0.05~0.10%，生抽6.5%~7%，搅拌均匀后4℃冷藏腌制，24h后取出；
（3）接种发酵
将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌、保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌、汉逊氏德巴利酵母GIM2.184和木糖葡萄球菌CICC10145按体积比1：2：1：1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比2%的接种量添加到腌制好的鸭腿中，将鸭腿放到20℃恒温恒湿箱中持续发酵35h；
上述植物乳杆菌和所述的木糖葡萄球菌的分离纯化过程如下：
A活化：将装有MRS固体培养基的锥形瓶121℃，15min灭菌，冷却至40℃，以0.5%~1%的接种量于50mLMRS固体培养基中接入植物乳杆菌或木糖葡萄球菌，于37℃活化4~6h后，再以0.5%~1%的接种量转接于100mLMRS液体培养基中，扩大培养12~16h后取出待用；
B分离纯化：在超净工作台中将培养好的菌液倒入离心管中，然后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层液体后，在离心管中加入与一开始加入的菌液等体积的生理盐水，均质后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层清液，再加入等体积的生理盐水重复操作，取沉淀，即得到纯化后的植物乳杆菌或木糖葡萄糖球菌。
其中MRS 固体培养基的配制方法如下：蛋白胨l0 g，牛肉膏l0g，酵母提取物5 g，磷酸氢二钾 2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5g，葡萄糖10 g，七水硫酸镁 0.5g、七水硫酸锰0.25g和琼脂200g溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH至6.8，121℃灭菌15min；所述的MRS 液体培养基的配制方法如下：蛋白胨l0 g，牛肉膏l0g，酵母提取物5 g，磷酸氢二钾 2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5g，葡萄糖10 g，，七水硫酸镁 0.5g和七水硫酸锰0.25g溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH至6.8，121℃灭菌15min。
上述酿酒酵母菌和所述的汉逊氏德巴利酵母的分离纯化过程如下：
A活化：将装有YPD液体培养基的锥形瓶121℃，15min灭菌，冷却至40℃，用灭菌的接种环从保藏的酿酒酵母菌或者汉逊氏德巴利酵母斜面中挑出菌落接入至50mLYPD液体培养基中，于30℃活化24h后去出待用；
B分离纯化：在超净工作台中将培养好的菌液倒入离心管中，然后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层液体后，在离心管中加入与一开始加入的菌液等体积的生理盐水，均质后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层清液，再加入等体积的生理盐水重复操作，取沉淀，即得到纯化后的酿酒酵母菌或汉逊氏德巴利酵母。
其中YPD固体培养基的配制方法如下：溶解10g 酵母膏，20g 蛋白胨于900ml水中，加入20g琼脂粉后高压121℃，灭菌20min，最后加入100ml 浓度为0.2g/mL 经灭菌的葡萄糖溶液；所述的YPD液体培养基的配制方法如下：溶解10g 酵母膏，20g 蛋白胨于900ml水中，高压121℃，灭菌20min后，加入100ml 浓度为0.2g/mL 经灭菌的葡萄糖溶液；
（4）煮制
将发酵好的鸭腿煮制30min~35min，即得到发酵鸭腿成品。
实施例2
同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌与保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌及汉逊氏德巴利酵母GIM2.184与木糖葡萄球菌CICC10145按体积比2:3:1:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中，将鸭腿放到30℃恒温恒湿箱中持续发酵28h。
实施例3
同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌与保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌及汉逊氏德巴利酵母GIM2.184与木糖葡萄球菌CICC10145按体积比1:2:1:2的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.8%的接种量添加到腌制好的鸭腿中，将鸭腿放到27℃恒温恒湿箱中持续发酵30h。
实施例4
同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌与保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌及汉逊氏德巴利酵母GIM2.184与木糖葡萄球菌CICC10145按体积比3:2:2: 2的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中，将鸭腿放到25℃恒温恒湿箱中持续发酵32h。
三、对比试验
对照例1：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例2：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例3：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将汉逊氏德巴利酵母GIM2.184按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例4：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将木糖葡萄球菌CICC10145按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例5：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌与保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌按体积比1:2的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例6：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌与汉逊氏德巴利酵母GIM2.184按体积比1:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例7：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌与木糖葡萄球菌CICC10145按体积比1:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例8：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌与汉逊氏德巴利酵母GIM2.184按体积比2:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例9：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌与木糖葡萄球菌CICC10145按体积比2:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例10：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将汉逊氏德巴利酵母GIM2.184与木糖葡萄球菌CICC10145按体积比1:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中，将鸭腿放到25℃恒温恒湿箱中持续发酵32h。
对照例11：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌与保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌及汉逊氏德巴利酵母GIM2.184按体积比1:2:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例12：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌与保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌及木糖葡萄球菌CICC10145按体积比1:2:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例13：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌、汉逊氏德巴利酵母GIM2.184与木糖葡萄球菌CICC10145按体积比2:1:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
对照例14：制备方法同上述实施例1，其区别在于：将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌、汉逊氏德巴利酵母GIM2.184和木糖葡萄球菌CICC10145按体积比1:1:1的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%的接种量添加到腌制好的鸭腿中。
将实施例1-4以及对照例子1-14制备的鸭腿性能对比如下：
由上述表中结果可知，四个菌株按一定比例混合发酵，具有协同效应，可显著降低组胺含量，提高产品的抗氧化性，四个菌株混合发酵所得的产品其组胺含量、亚硝酸盐残留量以及TBA值比任何其中单一的菌株或2-3个菌株混合发酵相应降低10-13.2%、6.4-10%和10.0-19.0%，抗氧化性比任何其中单一的菌株或2-3个菌株混合发酵提高·OH清除率为30.49-75%，DPPH自由基清除率为35.8-69.7%，游离氨基酸中鲜味氨基酸含量提高了23.7-55.49%，这对改善肉制品的风味品质和营养价值具有重要作用。通过发酵的方法来加工腌制肉，不仅满足了人们食用的需要，而且也能保证其品质安全可靠。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范畴。
Claims (6)
1.一种发酵鸭腿的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
（1）腌制
挑选新鲜鸭腿，鸭腿洗净血水，以鸭腿为基准，在处理好的鸭腿中按质量百分比添加食盐1.5%~2%，亚硝酸钠0.013%~0.015%，抗坏血酸0.05%~0.08%，蔗糖1.3%~1.8%，葡萄糖0.8%~1.2%，味精0.1%~0.3%，白胡椒粉0.05%~0.1%，料酒3.7%~4.0%，花椒0.13%~0.15%，洋葱粉0.17%~0.2%，茶多酚0.05~0.10%，生抽6.5%~7%，搅拌均匀后4℃冷藏腌制，24h后取出；
（2）接种发酵
将保藏编号为ATCC14917的植物乳杆菌、保藏编号为CGMCCNO.7277的酿酒酵母菌、汉逊氏德巴利酵母GIM2.184和木糖葡萄球菌CICC10145按体积比(1~3)：(2~3)：(1~2)：(1~2)的比例混合后得到混合发酵剂，将混合发酵剂按体积比1.5%~2%的接种量添加到腌制好的鸭腿中，将鸭腿放到20-30℃恒温恒湿箱中持续发酵28-35h；
（3）煮制
将发酵好的鸭腿煮制30min~35min，即得到发酵鸭腿成品。
2.根据权利要求1所述的一种发酵鸭腿的制备方法，其特征在于：将步骤（1）中鸭腿洗净血水，用刀背轻敲并且在腿上割开几个小口，方便后续腌制步骤的调料入味。
3.根据权利要求1所述的一种发酵鸭腿的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的植物乳杆菌和所述的木糖葡萄球菌的分离纯化过程如下：
（1）活化：将装有MRS固体培养基的锥形瓶121℃，15min灭菌，冷却至40℃，以0.5%~1%的接种量于MRS固体培养基中接入植物乳杆菌或木糖葡萄球菌，于37℃活化4~6h后，再以0.5%~1%的接种量转接于MRS液体培养基中，扩大培养12~16h后取出待用；
（2）分离纯化：在超净工作台中将培养好的菌液倒入离心管中，然后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层液体后，在离心管中加入与一开始加入的菌液等体积的生理盐水，均质后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层清液，再加入等体积的生理盐水重复操作，取沉淀，即得到纯化后的植物乳杆菌或木糖葡萄糖球菌。
4.根据权利要求3所述的一种发酵鸭腿的制备方法，其特征在于：所述的MRS 固体培养基的配制方法如下：蛋白胨l0 g，牛肉膏l0g，酵母提取物5 g，磷酸氢二钾 2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5g，葡萄糖10 g，七水硫酸镁 0.5g、七水硫酸锰0.25g和琼脂200g溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH至6.8，121℃灭菌15min；所述的MRS 液体培养基的配制方法如下：蛋白胨l0 g，牛肉膏l0g，酵母提取物5 g，磷酸氢二钾 2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5g，葡萄糖10g，，七水硫酸镁 0.5g和七水硫酸锰0.25g溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH至6.8，121℃灭菌15min。
5.根据权利要求1所述的一种发酵鸭腿的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的酿酒酵母菌和所述的汉逊氏德巴利酵母的分离纯化过程如下：
（1）活化：将装有YPD液体培养基的锥形瓶121℃，15min灭菌，冷却至40℃，用灭菌的接种环从保藏的酿酒酵母菌或者汉逊氏德巴利酵母斜面中挑出菌落接入至YPD液体培养基中，于30℃活化24h后去出待用；
（2）分离纯化：在超净工作台中将培养好的菌液倒入离心管中，然后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层液体后，在离心管中加入与一开始加入的菌液等体积的生理盐水，均质后放入离心机中，于8000 r/min，离心10min，弃去上层清液，再加入等体积的生理盐水重复操作，取沉淀，即得到纯化后的酿酒酵母菌或汉逊氏德巴利酵母。
6.根据权利要求5所述的一种发酵鸭腿的制备方法，其特征在于：所述的YPD液体培养基的配制方法如下：溶解10g 酵母膏，20g 蛋白胨于900ml水中，高压121℃，灭菌20min后，加入100ml 浓度为0.2g/mL 经灭菌的葡萄糖溶液。
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