CN114107113B - 一种合成发酵剂降低发酵食品中氨基甲酸乙酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成发酵剂降低发酵食品中氨基甲酸乙酯的方法，属于酒类酿造及食品安全领域。本发明提供了一株发酵乳杆菌d6，已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20211358。通过制备得到含有发酵乳杆菌、酿酒酵母、米根霉、异常维克汉姆酵母的合成发酵剂模拟黄酒发酵，结果表明，最终检测发酵结束后的黄酒中的尿素和氨基甲酸乙酯含量均比对照组有明显的降低，最大降低量分别为97.4和90.9％。

Description

一种合成发酵剂降低发酵食品中氨基甲酸乙酯的方法
技术领域
本发明涉及一种合成发酵剂降低发酵食品中氨基甲酸乙酯的方法，属于酒类酿造及食品安全领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)被归类为2A类致癌物，存在于醋、酱油、泡菜、奶酪、巧克力、酒精饮料等各种发酵食品中。由于酒精饮料中的EC对消费者的健康有很大的危害，因此，有必要降低这些发酵食品及酒精饮料中EC的浓度。
黄酒通常由大米、麦曲及酿酒酵母酿造而成。在黄酒的酿造过程中，真菌和酵母是黄酒发酵剂中重要的活性微生物，分别负责淀粉降解和酒精发酵。在酒精饮料中，尿素与乙醇的反应是最常见的EC生成途径。尿素既来源于发酵原料水稻，也来源于精氨酸分解代谢的积累。目前，降低尿素(EC的主要前体)的生物合成是控制黄酒发酵过程中EC的常用方法。
目前，主要是通过对酿酒酵母菌株的改造来调节尿素代谢，例如，酿酒酵母是许多发酵食品中尿素的主要生产者。尿素由精氨酸通过精氨酸酶(CAR1)产生，然后可以通过酿酒酵母中的尿素酰胺酶(DUR1,2)降解为氨和CO2。CAR1的敲除被用来降低葡萄酒和黄酒中的EC浓度。DUR1,2基因的过度表达，降低了黄酒中EC和尿素的浓度。然而，大多数发酵食品是通过涉及多种物种的自发发酵产生的。例如，在黄酒发酵中，不同的物种主要来自大米、麦曲、发酵剂等环境中，其中一些可能有助于尿素的生物合成。因此，仅通过对酿酒酵母菌株的改造来调节尿素代谢是困难的。
在自发食品发酵中通过酶促分解和减少尿素生物合成来降解EC是一个挑战。因此，应进一步探索更有效的策略来控制自发发酵食品中的EC。生物降解是降低多物种发酵中EC的更有效解决方案。
发明内容
本发明提供了一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6，已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20211358。
所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6是从来源于黄酒发酵醪样品中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示与乳杆菌属的核酸序列相似度高达99％，根据同源性搜索结果，使用MEGA 7.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及Neighbor－Joining方法构建系统发育树(具体可见图4B)，结果显示菌株属于乳杆菌属的发酵乳杆菌，将其命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6。
所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6在MRS固体培养基上的菌落呈凸起，边缘无色。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵乳杆菌具有产氨基甲酸乙酯降解酶的能力。
本发明还提供了一种合成发酵剂，含有上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)d6。
在本发明的一种实施方式中，所述合成发酵剂中还含有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、米根霉(Rhizopus oryzae)、异常维克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母CCTCC NO:M 20211359，已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)G2；所述酿酒酵母CCTCC NO:M 20211359具有降解尿素的能力。
所述米根霉为米根霉CCTCC NO:M 20211357，已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心；命名为，米根霉(Rhizopus oryzae)M5；所述米根霉CCTCC NO:M20211357具有糖化酶活性，可将发酵食品中的大分子物质分解，以供微生物生长所需。
所述异常维克汉姆酵母为：CCTCC NO：M 2020333，所述异常维克汉姆酵母具有产2-苯乙醇的能力，2-苯乙醇可改善食品的风味。所述异常维克汉姆酵母CCTCC NO：M2020333记载于公开号为CN112094764A的中国发明专利申请文件中，命名为异常维克汉姆酵母W.anomalus 1D6。
在本发明的一种实施方式中，所述合成发酵剂中，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、米根霉(Rhizopus oryzae)、异常维克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)是按照活菌数为(1.0×107～108CFU/mL)：(1.0×108～1010CFU/mL)：(2×109～1010孢子/mL)：(1.0×106～108CFU/mL)的比例制备得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述合成发酵剂中，活菌数含量至少为：1.0×1028CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂可在食品技术领域应用，尤其是发酵食品方面的应用。
本发明还提供了一种含有上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6的微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)d6的含量至少为：107CFU/mL。
本发明还提供了一种产品，其特征在于，所述产品中含有上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6，或上述合成发酵剂，或上述微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或化学品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)d6的含量至少为：107CFU/mL。
本发明还提供了一种降解氨基甲酸乙酯的方法，所述方法为，将上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6，或上述合成发酵剂，或上述微生物菌剂，或上述产品，添加至含有氨基甲酸乙酯的环境中进行降解。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6添加量至少为：107CFU/mL。
本发明还提供了一种降解尿素的方法，所述方法为，所述方法为，将上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6，或上述合成发酵剂，或上述微生物菌剂，或上述产品，添加至含有尿素的环境中进行降解。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6添加量至少为：107CFU/mL。
本发明还提供了一种氨基甲酸乙酯水解酶的制备方法，所述方法为，采用上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6发酵制备得到。
本发明还提供了一种酿造酒或蒸馏酒的制备方法，其特征在于，向原料中上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6，或上述合成发酵剂，或上述微生物菌剂，或上述产品，进行发酵制备得到酿造酒或蒸馏酒。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体为：将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)G2、米根霉(Rhizopus oryzae)M5、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6和异常维克汉姆酵母W.anomalus 1D6按一定比例进行混合，添加到黄酒发酵醪中进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述酿造酒或蒸馏酒包括黄酒、白酒、葡萄酒或果酒。
本发明还提供了将上述发酵乳杆菌，或上述合成发酵剂，或上述微生物菌剂，或上述产品在降低酿造酒或蒸馏酒中尿素和氨基甲酸乙酯积累中的应用。
在本发明的一种实施方式中，将上述发酵乳杆菌，或上述合成发酵剂，或上述微生物菌剂，或上述产品添加至酿造酒或蒸馏酒的酿造过程中。
在本发明的一种实施方式中，所述酿造酒或蒸馏酒包括黄酒、白酒、葡萄酒或果酒。
本发明还提供了上述发酵乳杆菌，或上述合成发酵剂，或上述微生物菌剂，或上述产品在模拟黄酒发酵中降低尿素和EC含量中的应用。
本发明还提供了上述发酵乳杆菌，或上述合成发酵剂，或上述微生物菌剂，或上述产品在黄酒发酵中调控氨(胺)类有害物的应用。
有益效果
本发明提供了一种合成发酵剂(包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)G2、米根霉(Rhizopus oryzae)M5、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)d6和异常维克汉姆酵母W.anomalus 1D6)，将此发酵剂(包括Lactobacillus fermentum,Saccharomycescerevisiae,Rhizopus oryzae,Wickerhamomyces anomalus)添加到黄酒发酵过程中，在经过前酵和后酵阶段，最终检测发酵结束后的黄酒中的尿素和氨基甲酸乙酯含量均比对照组有明显的降低，最大降低量分别为97.4和90.9％。
因此本发明中的合成发酵剂实现了对发酵食品体系内氨(胺)类有害物的有效减控，在传统发酵食品中具有重要应用前景。
生物材料保藏
一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，分类学命名为Saccharomycescerevisiae G2，已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 20211359，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，分类学命名为Lactobacillusfermentum d6，已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 20211358，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
一株米根霉(Rhizopus oryzae)，分类学命名为Rhizopus oryzae M5，已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20211357，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：酿酒酵母、发酵乳杆菌及米根霉菌株的功能特性；其中，A为L.fermentum d6产生的EC水解酶活性图；B为R.oryzae M5生产糖化酶的活性图；C为W.anomalus 1D6生产2-PE的产量图。
图2：：酿酒酵母、发酵乳杆菌、米根霉菌株及异常维克汉姆酵母菌落形态特征；其中，A为S.cerevisiae G2菌落形态特征；B为L.fermentum d6菌落形态特征；C为W.anomalus1D6菌落形态特征；D为R.oryzae M5菌落形态特征。
图3：筛选酿酒酵母、发酵乳杆菌、米根霉菌株及异常维克汉姆酵母菌株的PCR鉴定电泳结果；其中，A为S.cerevisiae G2的PCR鉴定电泳结果；B为L.fermentum d6的PCR鉴定电泳结果；C为W.anomalus 1D6的PCR鉴定电泳结果；D为R.oryzae M5的PCR鉴定电泳结果。
图4：基于ITS2和16S序列及Neighbor－Joining法构建的系统发育树其中，A为S.cerevisiae G2；B为L.fermentum d6；C为W.anomalus 1D6；D为R.oryzae M5。
图5：合成发酵剂模拟黄酒发酵中尿素和EC含量。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的黄酒酿造过程当中的酒母由湖州老恒和公司提供，下述实施例中所涉及的异常维克汉姆酵母CCTCC NO：M 2020333记载于公开号为CN112094764A的中国发明专利申请文件中，在下述实施例中以Wickerhamomyces anomalus 1D6表示。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
YPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基额外添加2％琼脂；
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基加2％琼脂，链霉素50mg/mL；
初筛培养基：葡萄糖20g/L，YNB(无氨基酸和硫酸铵)1.74g/L，硫酸铵5g/L，尿素5g/L；
复筛培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，尿素5g/L；
检测培养基：YNB合成培养基(无氨基酸和硫酸铵)1.74g/L，尿素0.6g/L，葡萄糖20g/L，用于检测尿素利用性能；
MRS分离培养基：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，三水乙酸钠5g/L，柠檬酸铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁七水0.2g/L，硫酸锰一水0.04g/L，吐温80 1mL/L，筛选时添加0.4g/L纳他霉素，固体培养基额外添加2％琼脂；
LB分离培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Na Cl 10g/L，纳他霉素100mg/L，121℃灭菌20min；
筛选培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Na Cl 10g/L，5g/L尿素或5g/L氨基甲酸乙酯，5mg/L溴甲酚紫。
上述培养基的灭菌条件均为115℃，15min。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
尿素和EC检测方法
尿素检测方法采用柱前衍生高效液相色谱荧光检测器(HPLC-FLD)对发酵液中尿素含量进行检测。具体操作：400μL样品，600μL 0.02mol/L占吨氢醇，100μL 1.5mol/L盐酸溶液，避光反应30min。
EC的浓度通过气相色谱质谱联用(GS/MS)测定。具体操作：取2mL样品，加入100μLd5-氨基甲酸乙酯(内标)，混匀，与GC-MS检测。
脲酶或EC水解酶活性检测
取经适当稀释后的酶液200μL，添加到含有800μL，340mM EC(或500mM尿素)的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中(50mM，pH 4.5),混匀后，在37℃条件下反应20min。立即加入1mL终止剂，振荡混匀后，再依次加入1mL显色剂I，1mL显色剂II。再次混匀后，于37℃继续反应20min。于625nm下检测吸光度值。而后根据所绘制的氨离子标准曲线，计算反应体系所生成的氨的量，以此来计算酶活。其中，显色剂I为：15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠，超纯水溶解并定容至250mL，显色剂II为：13.125g NaOH和7.5mL次氯酸钠，超纯水溶解并定容至250mL。
酶活定义为在常压、37℃及pH 4.5条件下，每分钟分解1μmol EC或尿素所需要的酶量做为一个酶活力单位。
糖化酶酶活的检测方法：
(1)取一定的带塞试管(其中每个样品3个平行，1个对照)，分别吸取2％可溶性淀粉液5mL，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5mL，混匀后于40℃水域中预热10min。
(2)加入酶液0.5mL(空白对照组以煮沸失活的酶液代替)于40℃反应10min，反应结束时，立即与沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的塞子打开)。
(3)取上述反应液5mL于三角瓶中，加入0.1mol/L的碘液5mL，缓慢加入0.1mol/L的NaOH溶液5mL(注意：加碱速度不能过快，否则过量NaIO来不及氧化葡萄糖而歧化为不与葡萄糖反应的NaIO3和NaI，使测定结果偏低)，摇匀后在暗处放置15min后加入2mol/L硫酸2mL。
(4)以0.5％可溶性淀粉为指示剂(4-5滴即可)，用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1mol/L硫代硫酸钠消耗的体积：酶液样品(A)：空白对照(B)。
在上述条件下，1mL酶液每小时催化2％淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位。
下述实施例中所涉及的分子生物学鉴定方法如下：
ITS2和16S rDNA基因的PCR扩增与序列测定:以提取的基因组DNA为模板扩增ITS2rDNA，以ITS2通用PCR引物F:(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')和R:(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增ITS2区域序列350bp，以16S通用引物27F：(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，扩增16S rDNA基因1500bp。PCR扩增条件:94℃预变性3min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃再延伸10min。反应体系(50μL):10umol/L上下游引物各1μL，100-200ng/μL DNA模板1μL,2x Pfu PCR Master Mix 25μL，双蒸水22μL。PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外成像系统上拍照分析，结果如图3A～D所示，其中，S.cerevisiae G2(A),L.fermentum d6(B),W.anomalus 1D6(C),R.oryzae M5(D)；分子量大小与预测大小一致。将验证后的PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析。
下述实施例中所涉及的苯乙醇含量的检测方法
苯乙醇标准液制备：准确称取50mg 2-苯乙醇，以流动相溶解，定容至50mL，配制1.0mg/mL的标准储备液。分别取标准液50μl、100μl、200μl、500μl、1mL和2mL于容量瓶中，定容10mL，分别得浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200ug/mL的工作液。使用配备二极管阵列检测器的HPLC，以甲醇:水为1:1为流动相，柱温35℃，进样体积10μl，流速为0.8mL/min。
下述实施例中所涉及的挥发性物质含量的检测方法：
将黄酒酒精度稀释至6％vol，取6mL稀释后黄酒液，加入到20mL顶空瓶中，加2.0gNaCl，7.4uL内标(10mg/L叔戊醇)。使用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头(使用前250℃老化30min)，50℃下吸附40min，250℃解吸7min，用于GC-MS测定。
色谱条件：色谱柱TG-WAXMS(60m×0.25μm×0.25mm)，进样口温度250℃。程序升温：50℃保持2min，3℃/min升温至145℃，15℃/min升温至230℃，保持15min。载气：高纯氦气(>99.999％)，分流，流速为1.0mL/min。
MS条件：离子化方式EI，发射电流25μA，电子能量70eV，离子源温度为260℃传输线温度230℃，扫描范围29～350amu。
实施例1：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)G2的筛选和分离
预筛：称取1g黄酒发酵醪样品与无菌EP管中，用1mL无菌生理盐水充分混匀，稀释至合适倍数后取100μL，涂布于含有尿素为唯一氮源的YNB固体培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养，直至平板上长出单菌落，采用QPix420生物筛选系统挑取或手动挑取。
初筛：用微生物筛选系统QPix420或手动挑选将预筛平板上单菌落转接至含有初筛培养基的48孔板中，然后于孔板摇床中，在30℃，220r/min条件下培养48h，将48孔板3500r/min离心5min，取80μL上清液于96PCR板中，加入20μL二乙酰一肟硫胺脲和100μL磷酸高铁铵溶液，100℃反应10min，反应结束冷却至室温用酶标仪检测吸光度值OD525。选择吸光度值低的进行摇瓶复筛。
最终得到一株酵母G2。
实施例2：米根霉(Rhizopus oryzae)M5的筛选和分离
称取1g黄酒发酵醪与无菌EP管中，取1mL无菌生理盐水充分混匀，稀释至合适倍数后取100μL涂布于PDA培养中，于28℃恒温培养箱中培养2-3天。通过测定PDA中的糖化酶活力，从而筛选出产糖化酶活力高的菌株，4℃下斜面保藏。
最终得到一株霉菌M5。
实施例3：产脲酶和EC水解酶菌株乳酸菌d6的筛选
初筛：称取1g黄酒发酵醪与无菌EP管中，取1mL无菌生理盐水充分混匀，稀释至合适倍数后取100μL涂布于分离培养中，于37℃恒温培养箱中培养数天直至长出单菌落。利用QPix420筛选系统进行筛菌，将单菌落挑取至装有筛选培养基的48孔板中，于37℃厌氧培养数小时。由于脲酶或EC水解酶可与相应的底物反应产生氨，使溴甲酚紫由紫色变为黄色，根据颜色反应，选取初筛目的菌株。
复筛：选取初筛的目的菌株接种于MRS培养基中培养72h，取菌液于冷冻离心机中，4℃，10000rpm，离心10min，收集上清，获取粗酶。
脲酶和EC水解酶活性测定：采用比色法。在比色管中加入200μL粗酶液(以灭活的酶液为对照)，再加入800μL 500mM尿素或340mM EC溶液，37℃反应20min后加入1.0mL终止剂，振荡混匀后加入1.0mL显色剂I和1.0mL显色剂II，混匀后37℃保温20min。反应液用超纯水定容至10mL，在625nm处检测吸光值。
最终得到一株乳酸菌d6。
同时，按照实施例1、实施例2和实施例3的方法，分别筛选得到编号为A1，d6，d1，d7，d9，2C7，1E5，2B6，2B4，M5，WQ5，WQ10，WQ11的菌株。
筛选得到的菌株的形态特征如图2A～D所示。
实施例4：系统发育树的构建
使用BLAST将酵母G2的ITS2(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，霉菌M5的ITS2(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)和乳酸菌d6的16S rDNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)测序结果在NCBI上比对，根据同源性搜索结果，使用MEGA 7.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及Neighbor－Joining方法构建系统发育树。结果见图4A～D。
结果表明，酵母G2与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ITS2 rRNA序列同源性最高，相似度达到99％。
细菌d6与发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的16S rRNA序列同源性最高，相似度达到99％。
霉菌M5与米根霉(Rhizopus oryzae)的ITS2 rRNA序列同源性最高，相似度达到98％。
使用分子软件MEGA7.0与酵母G2和1D6、乳酸菌d6和霉菌M5相似度较高的10株菌株进行多序列比对分析，并利用Neighbor-Joining方法构建系统发育树。
由图4可以看出，酵母G2与酿酒酵母同源性最高，鉴定为酿酒酵母(S.cerevisiae)，乳酸菌d6与发酵乳杆菌同源性最高，鉴定为发酵乳杆菌(L.fermentum)，霉菌M5与米根霉同源性最高，鉴定为米根霉R.oryzae，并分别送至保藏单位进行保藏。
按照上述方法，对菌株A1，d1，d7，d9进行鉴定，结果显示，菌株A1为：Lactobacillus paracasei，命名为Lactobacillus paracasei A1；菌株d1为：Lactobacillus paracasei，命名为Lactobacillus paracasei d1；菌株d7为：Lactobacillus fermentum，命名为Lactobacillus fermentum d7；菌株d9为：Lactobacillus paracasei，命名为Lactobacillus paracasei d9；菌株1C7为：Kluyveromyces marxianus，命名为Kluyveromyces marxianus 1C7；菌株1E5为：Pichiaanomala，命名为Pichia anomala 1E5；菌株2B6为：Wickerhamomyces anomalus，命名为Wickerhamomyces anomalus 2B6；菌株2B4为：Wickerhamomyces anomalus，命名为Wickerhamomyces anomalus 2B4；菌株M5为：Rhizopus oryzae，命名为Rhizopus oryzaeM5；菌株WQ5为：Rhizopus oryzae，命名为Rhizopus oryzae WQ5；菌株WQ10为：Rhizopusoryzae，命名为Rhizopus oryzae WQ10；菌株WQ11为：Rhizopus oryzae，命名为Rhizopusoryzae WQ11。
实施例5：EC水解酶的制备及酶活的检测
具体方法如下：
(1)分别将实施例1～4得到的发酵乳杆菌(L.fermentum)d6、Lactobacillusparacasei A1
Lactobacillus paracasei d1、Lactobacillus fermentum d7、Lactobacillusparacasei d9挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中，培养12～16h，得到种子液；
将制备得到的种子液以1％(v/v)的接种量接至新鲜的MRS培养基中，在37℃条件下培养2～3天，制备得到发酵液，将发酵液于4℃，12000rpm条件下离心10min，收集上清，获取粗酶液。
(2)分别检测上述粗酶液中的EC水解酶的活性，结果如表1和图1A所示。
表1：不同菌株发酵液中的EC水解酶的活性
结果显示，发酵乳杆菌(L.fermentum)d6在其发酵液中可以分析到EC水解酶，并且其酶活可高达59.47±6.59U/mg，证明其具有高效的制备EC水解酶的能力。
实施例6：糖化酶的制备及酶活的检测
具体方法如下：
(1)分别将实施例1～4得到的霉菌Rhizopus oryzae M5，Rhizopus oryzae WQ5，Rhizopus oryzae WQ10，Rhizopus oryzae WQ11从PDA平板上挑取接种于PDA液体培养基中，培养12h后，制备得到种子液，分别将制备得到的种子液以2％(v/v)的接种量接至新鲜的PDA培养基中，在28℃条件下连续培养2～6天，得到发酵液，将发酵液于4℃，10000rpm下离心5min，收集上清，获取粗酶液。
(2)分别检测上述粗酶液中的糖化酶的活性，结果如表2和图1B所示。
表2：不同菌株发酵液中的糖化酶的活性
结果显示，霉菌Rhizopus oryzae M5的糖化酶活性最高，在120h时，其酶活可高达125.50±9.19U/mg。
实施例7：2-苯乙醇的制备及含量的检测
具体方法如下：
(1)分别挑取实验室保藏的Wickerhamomyces anomalus 1D6，实施例1～4制备得到的Kluyveromyces marxianus 1C7，Pichia anomala 1E5，Wickerhamomyces anomalus2B6，Wickerhamomyces anomalus 2B4的单菌落在YPD液体培养基中活化后制备得到种子液，将制备得到的种子液，以初始OD600值为0.1、30mL/250mL的接种量接种于YPD培养基中，于30℃，转速为220r/min下，培养48h，制备得到发酵液；
(2)将制备得到的发酵液于4℃，12000r/min离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。结果如图1C所示。结果显示，本发明采用的Wickerhamomyces anomalus1D6的苯乙醇合成能力最好。
实施例8：发酵菌剂的制备
具体步骤如下：
(1)酿酒酵母的培养
将酿酒酵母S.cerevisiae G2接种至YPD培养基中，在30℃条件下进行培养，培养12h，于10000rpm下离心5min，收集菌体，无菌水洗两次，备用。
(2)发酵乳杆菌的培养
将发酵乳杆菌L.fermentum d6接种至MRS培养基中培养，在37℃条件下进行培养24～48h，于10000rpm下离心5min，然后收集菌体，无菌水洗两次，备用。
(3)米根霉的培养
将米根霉Rhizopus oryzae M5接种至PDA固体培养基中，在28℃条件下进行培养2～3天，用无菌水将孢子洗下，备用。
(4)异常维克汉姆酵母的培养
将异常维克汉姆酵母W.anomalus 1D6接种至YPD培养基中，在30℃条件下进行培养，培养12h，于10000rpm下离心5min，收集菌体，无菌水洗两次，以进一步使用。
(5)合成发酵剂中各个菌株的制备
将步骤(3)收集到的米根霉Rhizopus oryzae M5接种于PDA平板上进行活化，28℃培养72h，然后将无菌水溶液倒在平板上，刮去孢子，分散，血细胞计计数后，调整至1010孢子/mL。
分别将步骤(1)收集到的S.cerevisiae G2和将步骤(4)收集到的W.anomalus D6接种于活化的YPD板上，28℃培养48-72h，然后分别挑取单菌落接种于相应液体培养基上，将细胞处于对数期时收取，用无菌水洗两次，然后用血球计数板计数后，分别将S.cerevisiae G2调整至1010CFU/mL；将W.anomalus 1D6调整至108CFU/mL。
将步骤(2)收集到的L.fermentum d6接种于MRS平板上，37℃培养72h，然后挑取单菌落接种于相应液体培养基上，将细胞处于对数期时收取，并用无菌水洗两次，然后用血球计数板计数后，调整至108CFU/mL。
实施例9：合成发酵剂及其在黄酒发酵中的应用
具体步骤如下：
(1)取100g大米，在室温中浸渍2-3d，经常压蒸煮冷却后，分装至500mL的三角瓶中，添加170g水，制备得到熟米饭；
(2)微生物接种
实验具体分为3组：
(I)对照组：取1～2g的药曲(购自湖州老恒和酿造有限公司)+10g的麦曲(购自湖州老恒和酿造有限公司)；
(II)R.oryzae M5+S.cerevisiae G2+L.fermentum d6+W.anomalus 1D6(同时接种发酵)即：将按照实施例8的方法制备得到的合成发酵剂添加至步骤(1)制备得到的熟米饭中，在28℃条件下，发酵5天。
其中，合成发酵剂中，Rhizopus oryzae M5的活菌数为：2×1010孢子/mL；W.anomalus 1D6的活菌数为：1.0×108CFU/mL；S.cerevisiae G2的活菌数为：1.0×1010CFU/mL；L.fermentum d6的活菌数为：1.0×108CFU/mL；
(III)R.oryzae M5+S.cerevisiae G2+L.fermentum d6+W.anomalus 1D6(连续接种发酵)，即：分别按照上述顺序接种菌株，具体为：
1)将实施例8制备得到的米根霉R.oryzae M5种子液按照终浓度为2×1010孢子/mL的接种量接种至步骤(1)制备得到的熟米饭中，在28℃条件下，发酵24h；
2)步骤1)发酵结束后，将实施例8制备得到的酿酒酵母菌S.cerevisiae G2种子液按照终浓度为1.0×1010CFU/mL的接种量接种至步骤1)得到的发酵物中，在28℃条件下，发酵4天；
3)步骤2)发酵结束后，将实施例8制备得到的发酵乳杆菌L.fermentum d6种子液按照终浓度为1.0×108CFU/mL的接种量接种至步骤2)得到的发酵物中，在28℃条件下，发酵4天；
4)步骤3)发酵结束后，将实施例8制备得到的异常维克汉姆酵母W.anomalus 1D6种子液按照终浓度为1.0×108CFU/mL的接种量接种至步骤3)得到的发酵物中，在28℃条件下，发酵4天。
(3)发酵：
前发酵：分别将步骤(2)制备得到的3组发酵物置于28～30℃下静置发酵5d；
后发酵：前发酵结束后，分别将各组发酵物的温度降低至15℃，并且在15℃左右条件下25d后结束后酵。
发酵结束后，过滤发酵醪，分别将各组制备得到的滤液(黄酒)在4℃下保存以便进一步分析。所有这些程序一式三份。
(4)分别检测制备得到的黄酒当中的尿素和EC的含量，结果如表3及图5所示：
表3：不同组的黄酒当中的尿素和EC的含量
结果显示与对照组相比，混合发酵剂发酵的黄酒中尿素和EC含量都得到有效控制，尿素含量都在3mg/L以下，EC含量均在10μg/L以下。
其中I组和II组的尿素降解率分别为96.9％和97.4％，I组和II组的EC含量分别降低了90.9％和88.5％，结果表明，合成发酵剂的共同发酵对尿素和EC的调控起到重要作用。
综上所述，利用混合发酵剂模拟发酵是可以很好地控制黄酒发酵过程中尿素和EC含量的。
实施例10：合成发酵剂模拟发酵中挥发性化合物检测
具体实施方式同实施例9，分别将各组制备得到的滤液(黄酒)进行挥发性物质检测，挥发性化合物采用HS-SPME-GC-MS联用技术鉴定，对黄酒中的主要的挥发性化合物的进行定量分析，如下表4所示。
表4：不同组制备得到的黄酒中的挥发性化合物的含量
/>
主要挥发性化合物包括19种酯类、17种醇类、3种酮类、4种酸类、4种醛类、1种酚类和5种烷类。结果分析知，与对照组相比，合成发酵剂模拟发酵中的挥发性化合物的含量没有显著变化，多数香气化合物的数量和含量无明显变化。由此可知，黄酒的香气成分是多种不同风味成分微妙平衡的结果，而不是单一物质组成。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种合成发酵剂降低发酵食品中氨基甲酸乙酯的方法
<130> BAA211490A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1475
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaggggggg gggctatact gcagtcgacg cgttggccca attgattgat ggtgcttgca 60
cctgattgat tttggtcgcc aacgagtggc ggacgggtga gtaacacgta ggtaacctgc 120
ccagaagcgg gggacaacat ttggaaacag atgctaatac cgcataacag cgttgttcgc 180
atgaacaacg cttaaaagat ggcttctcgc tatcacttct ggatggacct gcggtgcatt 240
agcttgttgg tggggtaacg gcctaccaag gcgatgatgc atagccgagt tgagagactg 300
atcggccaca atgggactga gacacggccc atactcctac gggaggcagc agtagggaat 360
cttccacaat gggcgcaagc ctgatggagc aacaccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc 420
tcgtaaagct ctgttgttaa agaagaacac gtatgagagt aactgttcat acgttgacgg 480
tatttaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 540
aagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag agagtgcagg cggttttcta agtctgatgt 600
gaaagccttc ggcttaaccg gagaagtgca tcggaaactg gataacttga gtgcagaaga 660
gggtagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 720
cgaaggcggc tacctggtct gcaactgacg ctgagactcg aaagcatggg tagcgaacag 780
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agctacgcga agaaccttac caggtcttga catcttgcgc caaccctaga gatagggcgt 1020
ttccttcggg aacgcaatga caggtggtgc atggtcgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgttactag ttgccagcat taagttgggc 1140
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<211> 818
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtcttgctag gcctgtaagt ttctttcttg ctattccaaa cggtgagaga tttctgtgct 180
tttgttatag gacaattaaa accgtttcaa tacaacacac tgtggagttt tcatatcttt 240
gcaacttttt ctttgggcat tcgagcaatc ggggcccaga ggtaacaaac acaaacaatt 300
ttatttattc attaaatttt tgtcaaaaac aagaattttc gtaactggaa attttaaaat 360
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aactatgatc tgaagtcagg tgggattacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag 600
ga 602

Claims (5)

1.一种合成发酵剂，其特征在于，含有发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、米根霉（Rhizopus oryzae）、异常维克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）；所述发酵乳杆菌已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 20211358；所述酿酒酵母为酿酒酵母CCTCC NO: M20211359，已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心；
所述米根霉为米根霉CCTCC NO: M 20211357，已于2021年11月02日保藏于中国典型培养物保藏中心；
所述异常维克汉姆酵母为：异常维克汉姆酵母CCTCC NO：M 2020333。
2.一种化学品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的合成发酵剂。
3.一种同时降解尿素和降解氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的合成发酵剂含有氨基甲酸乙酯和尿素的环境中进行降解。
4.一种酿造酒或蒸馏酒的制备方法，其特征在于，向原料中添加将权利要求1所述的合成发酵剂或权利要求2所述的化学品，进行发酵制备得到酿造酒或蒸馏酒。
5.将权利要求1所述的合成发酵剂，或权利要求2所述的化学品在降低酿造酒或蒸馏酒中尿素和氨基甲酸乙酯积累中的应用。
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CN109294933A (zh) * 2018-11-20 2019-02-01 北京工商大学 一株酿酒酵母及其与产酯酵母共培养提高传统发酵食品品质的方法
CN112592839A (zh) * 2021-01-08 2021-04-02 浙江工业大学 一株降解氨基甲酸乙酯的米根霉及其应用

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