CN116769652B - 一株高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌fmes-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES‑1及其应用，属于微生物技术领域。本发明所述副干酪乳酪杆菌命名为副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）FMES‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023701。FMES‑1在MRS液体培养基中培养48h，其产酸率为2.11%；在含有150mg/L NaNO2的MRS液体培养基中培养48h，其对亚硝酸盐的降解率为96.74%；在含有0g/L~60g/L NaCl的MRS液体培养基中生长良好。说明该菌具有良好的生长及产酸能力，可高效降解亚硝酸盐、耐受氯化钠。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1及其应用。
背景技术
腌制蔬菜是一种典型的传统发酵食品，是将各种新鲜蔬菜浸泡在5％～8％的NaCl中通过乳酸菌发酵得到的。腌制蔬菜具有悠久的历史和丰富的内涵，自公元前三世纪就有发酵蔬菜的生产。我国的榨菜具有清脆爽口、酸甜适度和解腻开胃的特点，与法国酸黄瓜和德国甜酸甘蓝并称为“世界三大名腌菜”，深受广大消费者的喜爱。
蔬菜是人类饮食中硝酸盐摄入的主要来源，人体每天总摄入量75％～80％的硝酸盐来自蔬菜。蔬菜中的硝酸盐在腌制过程中会由硝酸盐还原细菌转化为亚硝酸盐。研究表明，亚硝酸盐的大量积累是蔬菜腌制生产中的一个常见问题。人体摄入的亚硝酸盐可与食品中的仲胺类物质相互反应，生成N-亚硝基化合物，可导致癌症和其他健康问题，因此，降低亚硝酸盐浓度对维持发酵食品的安全极为重要。我国食品安全国家标准对榨菜中亚硝酸盐含量的最高限量为20mg/kg。
目前，降解发酵食品中亚硝酸盐的方法主要有化学降解、物理降解和生物降解等。其中，生物降解法因具有安全和高效而备受人们的关注。乳酸菌是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏染色阳性细菌。许多研究人员已经证明，从泡菜中分离出来的乳酸菌在蔬菜腌制过程中可以有效地降解亚硝酸盐，这主要是通过降低硝酸盐还原酶的活性和产生的有机酸引起的酸降解。此外，乳酸菌有助于缩短发酵周期，改善蔬菜在腌制过程中易被杂菌污染和品质不稳定等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一株高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1及其应用，本发明提供的副干酪乳酪杆菌FMES-1的亚硝酸盐降解率≥96％，可耐受质量浓度≤60g/L的NaCl，产酸率≥2.1％，兼具产酸高和降解亚硝酸盐能力强的特点，同时对氯化钠具有一定的耐受能力。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一株高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1，所述副干酪乳酪杆菌命名为副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)FMES-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2023701。
优选地，所述副干酪乳酪杆菌FMES-1的16SrDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述副干酪乳酪杆菌FMES-1来源于传统自然发酵的榨菜。
优选地，所述副干酪乳酪杆菌FMES-1的亚硝酸盐降解率≥96％，可耐受质量浓度≤60g/L的NaCl，产酸率≥2.1％。
本发明还提供一种上述技术方案中所述高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1在制备降解亚硝酸盐产品中的应用。
本发明还提供一种上述技术方案中所述高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1在制备发酵产品中的应用。
本发明还提供一种上述技术方案中所述高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1在制备高盐发酵产品中的应用。
优选地，所述产品中包括副干酪乳酪杆菌FMES-1活菌株、副干酪乳酪杆菌FMES-1灭活菌株、副干酪乳酪杆菌FMES-1的代谢产物中的一种或多种。
有益技术效果：本发明提供了一株高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1及其应用，所述副干酪乳酪杆菌命名为副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)FMES-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2023701。FMES-1在MRS液体培养基中培养48h，其产酸率为2.11％；在含有150mg/LNaNO2的MRS液体培养基中培养48h，其对亚硝酸盐的降解率为96.74％；在含有0g/L～60g/LNaCl的MRS液体培养基中生长良好，对质量浓度≤60g/L的NaCl具有较好的耐受能力。说明该菌具有良好的生长及产酸能力，可高效降解亚硝酸盐、耐受氯化钠。
附图说明
图1为实施例1中从榨菜发酵液中分离得到的部分菌落在平板上的菌落形态；左图为L1菌株，右图为L3菌株；
图2为实施例2中不同乳酸菌的培养基中残留NaNO2的直接显色反应结果；
图3为实施例3中亚硝酸盐含量的标准曲线；
图4为实施例3中不同菌株培养48h的亚硝酸盐降解率；
图5为实施例4中不同菌株培养24h和48h的产酸率；
图6为实施例5中副干酪乳酪杆菌FMES-1的16SrDNA序列的BLAST比对结果；
图7为实施例6中副干酪乳酪杆菌FMES-1的生长曲线；
图8为实施例7中副干酪乳酪杆菌FMES-1在不同质量浓度NaCl中的生长情况。
具体实施方式
本发明提供了一株高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1，所述副干酪乳酪杆菌命名为副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)FMES-1，保藏编号为CCTCCNO：M2023701，保藏日期为2023年05月08日；保藏于中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心；邮编：430072。
在本发明中，所述副干酪乳酪杆菌FMES-1的16SrDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示；所述副干酪乳酪杆菌FMES-1来源于传统自然发酵的榨菜，亚硝酸盐降解率≥96％，可耐受质量浓度≤60g/L的NaCl，产酸率≥2.1％。
本发明还提供一种上述技术方案中所述高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1在制备降解亚硝酸盐产品中的应用。
在本发明中，所述应用中优选包括副干酪乳酪杆菌FMES-1活菌株、副干酪乳酪杆菌FMES-1灭活菌株、副干酪乳酪杆菌FMES-1的代谢产物中的一种或多种，更优选包括副干酪乳酪杆菌FMES-1活菌株。本发明对所述产品的类型没有特殊限定，采用副干酪乳酪杆菌FMES-1可接受的产品类型即可。本发明对所述产品的制备方法和副干酪乳酪杆菌FMES-1的含量没有特殊限定，采用相应产品的制备方法和含量即可。
本发明还提供一种上述技术方案中所述高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1在制备发酵产品中的应用。
在本发明中，所述产品的类型、制备方法和成分含量与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供一种上述技术方案中所述高效降解亚硝酸盐和高产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1在制备高盐发酵产品中的应用。
在本发明中，所述产品的类型、制备方法和成分含量与上述相同，在此不再赘述。
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本发明实施例及试验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；本发明实施例及试验例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
菌株培养基：
MRS平板培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉粉5g/L，酵母粉4g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三胺2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温80 1mL，琼脂粉15g/L，pH＝6.2。
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉粉5g/L，酵母粉4g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三胺2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温80 1mL，pH＝6.2。
实施例1乳酸菌的分离纯化
(1)取1mL榨菜发酵液置于含有9mL无菌生理盐水(0.9％NaCl)的试管中，充分混匀后得到10-1的稀释液，依次梯度稀释得到10-2，10-3，10-4和10-5的样品稀释液。吸取100μL的样品稀释液涂布到MRS平板培养基中，于37℃恒温厌氧培养48h。
(2)从培养好的MRS平板上挑取形态、大小和颜色不同的单菌落，采用平板划线进行纯化。反复划线培养3次，直至出现单一菌落。刮取最终培养好的菌苔接入MRS液体培养基中，37℃恒温厌氧静置培养24h至OD600＝0.8～1.0。依次对获得的疑似乳酸菌的6株菌株进行编号，并置于33％的甘油中于-80℃冰箱保存。部分菌落形态如图1所示，由图1可以看出，L1菌株的菌落形态特征为乳白色、呈光滑圆形状；L3菌株的菌落形态特征呈半透明、扁圆状、表面光滑且凸起。
实施例2降解亚硝酸盐乳酸菌的初筛
(1)将上述分离得到的6株保藏于甘油中的乳酸接种至MRS平板培养基进行活化，倒置平板于37℃恒温厌氧培养24h。用接种环从平板上挑取2环活化好的菌，接种于5mLMRS液体培养基中再次活化，置于37℃恒温厌氧静置培养24h。将活化好的菌液以体积分数为3％的添加量接种于含有150mg/LNaNO2的MRS液体培养基中，37℃恒温厌氧静置培养48h。
(2)向培养好的菌液中加入1mL对氨基苯磺酸溶液(4g/L)，混匀后静置3min，再加入0.5mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，混匀后静置15min，观察各菌株培养基的颜色，与添加150mg/LNaNO2的MRS液体培养基以及不添加NaNO2的MRS培养基进行颜色对比。如图2所示，选出颜色浅的5株乳酸菌L1、L2、L3、L4和L5，说明其培养基中残留的NaNO2含量较少、降解亚硝酸盐能力较强，因此选择这5株菌进行后续的筛选。
实施例3降解亚硝酸盐能力强的乳酸菌的复筛
(1)将初筛得到的5株菌分别接种于5mLMRS液体培养基中，置于37℃恒温厌氧静置培养24h。将活化好的菌液以体积分数为3％的添加量接种于含有150mg/LNaNO2的MRS液体培养基中，37℃恒温厌氧静置培养48h。将150mg/LNaNO2添加至已灭菌的MRS液体培养基作为空白对照，重复试验3次。
(2)按照GB5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法测定并绘制亚硝酸盐含量标准曲线，根据标准曲线得到亚硝酸盐含量。取离心去菌体后发酵液1mL，依次加入2.5mL硼砂(50g/L)、1mL亚铁氰化钾(106g/L)和1mL乙酸锌(220g/L)，而后用超纯水定容至50mL，混匀后静置30min，除去上层脂肪，用滤纸过滤得到滤液备用。
(3)吸取4mL上述滤液于5mL离心管中，另吸取0μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL、150μL和200μL亚硝酸钠标准使用液(5μg/mL)，加入离心管中，当作标准管。于标准管和试样管中各加入200μL对氨基苯磺酸溶液(4g/L)，震荡混匀，静置5min，加入100μL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，加水至5mL，混匀后静置15min，以零管调零，在538nm处测定吸光度，同时做试剂空白。亚硝酸盐含量标准曲线如图3所示，回归方程为y＝0.0827x+0.0441，相关系数R2＝0.9978。
(4)亚硝酸盐降解率计算公式：
亚硝酸盐降解率＝(C0-C1)/C0×100％，
其中C0为对照组培养基中NaNO2初始含量，mg/L；C1为培养48h后培养基中NaNO2含量，mg/L。初筛得到的菌株对亚硝酸盐的降解率如图4所示。经过48h的培养，筛选出来的5株菌的亚硝酸盐降解率均在93％以上，其中L3的亚硝酸盐降解率最高，为96.74±0.62％。
实施例4高产酸的乳酸菌的筛选
(1)将初筛得到的5株菌分别接种于5mLMRS液体培养基中，置于37℃恒温厌氧静置培养24h。将活化好的菌液以体积分数为3％的添加量接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧静置培养，在24h和48h测定发酵液的产酸率。
(2)按照GB5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中的酸碱滴定法测定产酸率。取4mL菌液于250mL锥形瓶中，加入96mL蒸馏水充分混匀后滴加4滴酚酞指示剂，以0.1mol/L的NaOH溶液进行滴定，直至出现微红色，静止30s若无褪色现象，记录消耗NaOH的体积并计算产酸率，重复试验3次。产酸率＝(NNaOH×VNaOH×0.09/V样品)×100％，其中NNaOH为滴定酸所用NaOH的浓度，mol/L；VNaOH为滴定酸所用NaOH的体积，L；V样品为样品体积，L。
(3)产酸率是筛选优良乳酸菌的关键指标之一，5株菌培养24和48h的发酵产酸率如图5所示。经过48h的培养，L3、L4和L5的产酸率较高，均在2.01％以上，其中L3的产酸率最高，为2.12±0.01％。
实施例5乳酸菌的分子生物学鉴定
(1)将上述保藏于甘油中的产酸高且降解亚硝酸盐能力强的L3菌株接种至MRS平板培养基进行活化，倒置平板于37℃恒温厌氧培养24h。用接种环从平板上挑取2环活化好的菌，接种于5mLMRS液体培养基中再次活化，置于37℃恒温厌氧静置培养24h。取培养好的菌液2mL于离心管中，在10000rpm条件下离心1min，尽量吸净上清，收集菌体。
(2)使用细菌DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)提取细菌总DNA。利用PCR技术对菌株的16SrDNA基因进行扩增。细菌测序引物序列如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：3所示，SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：3的具体核苷酸序列为：
SEQ ID NO：2(27F)：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；
SEQ ID NO：3(1492R)：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共35次循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。
PCR反应体系(50μL)：5μL10×buffer、5μLdNTP、0.5μL27F、0.5μL1492R、0.5μLTaq酶、0.5μL模板、38μL双蒸水。
(3)测序结果如SEQ ID NO：1所示：
SEQ ID NO：1：
GCGGCTGCTTACCATGCAGTCGCACGAACCTTTCGGGGTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAGGGATCTGTCCATGGGTGGGGGATAACTTTGGGAAACTGAAGCTAATACCGCATGACACCTGAGGGTCAAAGGCGCAAGCCGCCTGTGGAGGAACCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGATGATCGATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTTTTCGGATTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGACGATGATGACGGTACCCGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCAAGCGTTGCTCGGAATGACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGTTGACACAGTCAGATGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGGGCTGCATTTGATACGTGGCGACTAGAGTGTGAGAGAGGGTTGTGGAATTCCCAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTGGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCAACCTGGCTCATGACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTGTGCTGGATGTTGGGTGACTTTGTCATTCAGTGTCGTAGTTAACGCGATAAGCACACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGGGCTTGACATGCGGAGGCCGTGTCCAGAGATGGGCATTTCTCGCAAGAGACCTCCAGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCTTCGCCTTTAGTTGCATTCCGTTTGGGTGGGCCTCTAAAGAACTGCCGGGGACAACCCGAGGAAAGGGGAAT；
将其在NCBI上进行BLAST，序列比对结果如图6所示，结果表明该菌与乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)的多个物种的16SrDNA序列相似性达99％以上，与Lacticaseibacillusparacasei的16SrDNA序列相似性为99.48％。鉴于此，可以确定该菌株属于副干酪乳酪杆菌，故将其命名为副干酪乳酪杆菌FMES-1。
实施例6副干酪乳酪杆菌FMES-1生长曲线的测定
(1)将保藏于甘油中的副干酪乳酪杆菌FMES-1接种至MRS平板培养基进行活化，倒置平板于37℃恒温厌氧培养24h。用接种环从平板上挑取2环活化好的菌，接种于5mLMRS液体培养基中再次活化，置于37℃恒温厌氧静置培养24h。
(2)将活化好的菌液以体积分数为3％的添加量接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧静置培养48h，分别在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h和48h取样测定发酵液的OD600吸光值，用空白培养基作为对照组，绘制菌株的生长曲线(图7)。由图7可知，副干酪乳酪杆菌FMES-1的对数生长期为4h～20h，20h后进入稳定期，因此活化时培养至20h最优。
实施例7副干酪乳酪杆菌FMES-1耐氯化钠能力的测定
(1)将实施例6中活化好的副干酪乳酪杆菌FMES-1菌液以体积分数为3％的添加量接种于含有20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L、120g/L和140g/LNaCl的MRS液体培养基中，以不添加NaCl的MRS液体培养基作为对照，置于37℃恒温厌氧静置培养48h，取样测定发酵液的OD600吸光值。
(2)副干酪乳酪杆菌FMES-1对耐氯化钠的耐受能力如图8所示。由图8可知，经过48h的培养，副干酪乳酪杆菌FMES-1在含有0g/L～60g/LNaCl的MRS液体培养基中可以良好生长。当NaCl的质量浓度为0g/L时，菌株生长最好，其OD600为1.36±0.02；当NaCl的质量浓度增加至60g/L时，副干酪乳酪杆菌FMES-1菌液的OD600有一定的下降，但仍然具有一定程度的耐受性；当NaCl的质量浓度增加至80g/L及以上时，菌液的OD600低于0.20，说明副干酪乳酪杆菌FMES-1在含有80g/L～140g/LNaCl的MRS液体培养基中几乎不能生长。结果表明，副干酪乳酪杆菌FMES-1对质量浓度≤60g/L的NaCl有较好的耐受能力。
综上所述，本发明的副干酪乳酪杆菌FMES-1的产酸率可达2.11％；对亚硝酸盐的降解率可达96.74％；对质量浓度≤60g/L的NaCl具有较好的耐受能力，且该菌具有良好的产酸能力，可用于制备降解亚硝酸盐产品、发酵产品、高盐发酵产品，尤其是发酵蔬菜类产品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一株降解亚硝酸盐和产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌命名为副干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus paracasei FMES-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023701。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌FMES-1，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌FMES-1的16S-rDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌FMES-1，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌FMES-1来源于传统自然发酵的榨菜。
4.根据权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌FMES-1，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌FMES-1的亚硝酸盐降解率≥96％，可耐受质量浓度≤60g/L的NaCl，产酸率≥2.1％。
5.一种权利要求1-4任一所述降解亚硝酸盐和产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1在制备降解亚硝酸盐产品中的应用。
6.一种权利要求1-4任一所述降解亚硝酸盐和产酸的副干酪乳酪杆菌FMES-1在制备发酵产品中的应用。
7.根据权利要求5-6任一所述的应用，其特征在于，所述产品中包括副干酪乳酪杆菌FMES-1活菌株。
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| Impact of Lactobacillus paracasei HD1.7 as a Starter Culture on Characteristics of Fermented Chinese Cabbage (Brassica rapa var. pekinensis);Dan Zhao et al.;《Food Science and Technology Research》;第22卷(第3期);第325-330页 * |
| Improvement of Fermented Chinese Cabbage Characteristics by Selected Starter Cultures;Xue Han et al.;《Journal of Food Science》;第79卷(第7期);第M1378-M1391页 * |
| 西北地区泡菜中乳酸杆菌的生物学特性;王笋等;《中国调味品》;第39卷(第3期);第15-18页 * |
| 高产 L － 乳酸副干酪乳杆菌对酸菜品质及安全性的影响;刘晓辉等;《食品与发酵工业》;第46卷(第17期);第114-118页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116769652A (zh) | 2023-09-19 |
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