CN111925972B - 一种希氏乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业微生物领域,本发明提供了一种希氏乳杆菌及其应用。本发明提供的希氏乳杆菌RX,拉丁文为Lactobacillus hilgardii,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为:2020年4月10日,保藏编号为:CGMCC No.19559。本发明提供的希氏乳杆菌RX生长速度快、产酸能力强、可降解亚硝态氮,不仅能调节水质,而且可以用于发酵饲料,促进水产养殖的健康发展。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域,尤其涉及一种希氏乳杆菌RX及其应用。
背景技术
乳酸菌在生长过程中能分泌乳酸、乙酸等有机酸及细菌素、抗菌肽、生长因子等代谢产物,该类物质具有很好的抑菌、促生效果,作为益生菌广泛使用于养殖业中,水产养殖中常用的乳酸菌有植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等。希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)是乳酸菌的一种,是GRAS(GenerallyRecognized as Safe公认的安全级)菌株,以希氏乳杆菌研制的农用微生物菌剂,广泛应用于各种经济作物种植,有效防治土传病害的发生,解决了重茬、死棵、土壤恶化等问题。此外,希氏乳杆菌也被应用于黄酒酿造和葡萄酒酿造,但鲜见希氏乳杆菌用于水产养殖的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种希氏乳杆菌及其应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种希氏乳杆菌RX,拉丁文为Lactobacillus hilgardii,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为:2020年4月10日,保藏编号为:CGMCC No.19559。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用于降解氨氮、亚硝态氮的应用。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用于调节水质的应用。
本发明还提供了一种水质调节剂,由所述的希氏乳杆菌RX制备得到。
本发明还提供了所述水质调节剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)将希氏乳杆菌RX接种到MRS液体培养基中,在25~32℃下培养20~26h,得到一级菌种;
(2)将一级菌种接种到MRS液体培养基中,在25~32℃下培养20~26h,得到二级菌种;
(3)将二级菌种接种到固体物料中,调整固体物料的含水率为28~32%,在25~30℃下发酵48~72h,得到三级菌种;
(4)在三级菌种中加入红糖和水,置于25~35℃的条件下发酵3~5d,所得发酵产物即为水质调节剂。
优选的,所述固体物料为麸皮、豆粕、玉米粉、番茄匀浆、葡萄糖、磷酸二氢钾按照质量比15~25:15~25:15~25:15~25:3~7:0.5~2混合得到。
优选的,所述三级菌种、红糖和水的质量比为1:2.5~5:90~100。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用作饲料发酵剂的应用。
本发明还提供了一种复合发酵剂,所述复合发酵剂中包括希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母。
优选的,所述希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母的体积比为1:1~3:4~8。
本发明主要为水产养殖提供了一株希氏乳杆菌RX,解决了水产养殖中后期控制亚硝态氮和pH的技术难题。本发明提供的希氏乳杆菌RX还可用于饲料发酵。与现有技术相比,本发明具有以下优势:
(1)本发明的希氏乳杆菌繁殖速度快,液体发酵24h有效活菌浓度达到每毫升30亿以上,固体发酵72h每克湿培养基达到500亿以上。
(2)本发明的希氏乳杆菌RX能有效降低水体中亚硝态氮、氨氮含量和pH,改善养殖水质。
(3)本发明的希氏乳杆菌RX与枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母复合用于发酵饲料,活菌含量高,提高饲料的利用率和营养成分的含量。
附图说明
图1为希氏乳杆菌RX基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树;
图2为实验例1中希氏乳杆菌RX对模拟水体中亚硝态氮的去除效果;
图3为实验例2中由希氏乳杆菌RX制备的水质调节剂对氨氮的去除效果;
图4为实验例2中由希氏乳杆菌RX制备的水质调节剂对亚硝态氮去除效果;
图5为实验例2中由希氏乳杆菌RX制备的水质调节剂对水体pH值的影响。
保藏说明
希氏乳杆菌RX,拉丁文为Lactobacillus hilgardii,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为:2020年4月10日,保藏编号为:CGMCC No.19559。
具体实施方式
本发明提供了一种希氏乳杆菌RX,具有生长速率快、产酸能力强、降解亚硝态氮的特点,可用来调节水质、发酵饲料,可促进水产养殖的健康发展。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用于降解氨氮、亚硝态氮的应用。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用于调节水质的应用。
在本发明中,所述希氏乳杆菌RX优选用于调节水产养殖水质。
本发明还提供了一种水质调节剂,由所述的希氏乳杆菌RX制备得到。
在本发明中,所述水质调节剂用于调节水产养殖水质。
本发明还提供了所述水质调节剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)将希氏乳杆菌RX接种到MRS液体培养基中,在25~32℃下培养20~26h,得到一级菌种;
(2)将一级菌种接种到MRS液体培养基中,在25~32℃下培养20~26h,得到二级菌种;
(3)将二级菌种接种到固体物料中,调整固体物料的含水率为28~32%,在25~30℃下发酵48~72h,得到三级菌种;
(4)在三级菌种中加入红糖和水,置于25~35℃的条件下发酵3~5d,所得发酵产物即为水质调节剂。
本发明在制备水质调节剂时,先将希氏乳杆菌RX接种到MRS液体培养基中培养,得到一级菌种。
在本发明中,所述希氏乳杆菌RX优选为穿刺培养保存的菌种。
在本发明中,一级菌种培养过程中,所述培养的温度优选为25~32℃,进一步优选为30℃;所述培养的时间优选为20~26h,进一步优选为24h。
制得一级菌种后,将一级菌种接种到MRS液体培养基中培养,得到二级菌种;
在本发明中,所述一级菌种的接种量优选为4~6%(v/v),再进一步优选为5%(v/v)。
在本发明中,二级菌种培养过程中,所述培养的温度优选为25~32℃,进一步优选为30℃;所述培养的时间优选为20~26h,进一步优选为24h。
在本发明中,所述二级菌种的有效活菌浓度优选为30~35×108CFU/mL,进一步优选为32.8×108CFU/mL,pH优选为3~4,进一步优选为3.62。
在本发明中,所述MRS液体培养基的配方优选为(g/L):牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,蛋白胨10.0g,葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,醋酸钠5.0g,七水硫酸镁0.2g,四水硫酸锰0.05g,1.0g吐温80,柠檬酸二铵2.0g,蒸馏水补至1L,pH为6.2~6.6,115℃高压灭菌20min。
制得二级菌种后,将二级菌种接种到固体物料中,调整固体物料的含水率为28~32%,在25~30℃下发酵48~72h,得到三级菌种;
在本发明中,所述二级菌种的接种量优选为质量比8~12%,进一步优选为质量比10%。
在本发明中,所述固体物料优选为麸皮、豆粕、玉米粉、番茄匀浆、葡萄糖、磷酸二氢钾;所述固体物料中麸皮、豆粕、玉米粉、番茄匀浆、葡萄糖、磷酸二氢钾优选按照质量比15~25:15~25:15~25:15~25:3~7:0.5~2混合,进一步优选为18~22:18~22:18~22:18~22:4~6:0.8~1.5,再进一步优选为20:20:20:20:5:1。
在本发明中,用水调整固体物料的含水率。
在本发明中,所述含水量优选为28~32%,进一步优选为30%。
在本发明中,所述发酵的温度优选为25~30℃,进一步优选为26~28℃,再进一步优选为27℃;所述发酵的时间优选为48~72h,进一步优选为72h。
在本发明中,所述发酵优选在带呼吸阀塑料袋中进行密封发酵。
发酵好三级菌种后,在三级菌种中加入红糖和水,置于25~35℃的条件下发酵3~5d,所得发酵产物即为水质调节剂。
在本发明中,优选将发酵好的三级菌种置于干净的发酵容器中,再加入红糖和水。
在本发明中,所述三级菌种、红糖和水的质量比优选为1:2.5~5:90~100,进一步优选为1:4~5:95~100,再进一步优选为1:5:100。
在本发明中,所述发酵的温度优选为25~35℃,进一步优选为30℃;所述发酵的时间优选为3~5d,进一步优选为4d。
在本发明中,检测所述水质调节剂的pH低于4.0,即为合格产品,可用于全池泼洒。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用作饲料发酵剂的应用。
本发明还提供了一种复合发酵剂,所述复合发酵剂中包括希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母。
在本发明中,所述希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母的体积比优选为1:1~3:4~8,进一步优选为1:2~3:4~6,再进一步优选为1:2:5。
在本发明中,所述枯草芽胞杆菌K8分类为Bacillus subtilis,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为:2020年4月10日,保藏编号为:CGMCC No.19558。
在本发明中,所述热带假丝酵母为市场购买所得。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种希氏乳杆菌RX,分离自天津市北辰区南美白对虾养殖池中。希氏乳杆菌RX的分离鉴定:
1)RX分离、纯化:取南美白对虾养殖池底质活性污泥,用MRS液体培养基富集培养5d,将富集培养液梯度稀释,在含碳酸钙的培养基上涂布,挑选水解圈大的菌落,继代4~5次后得到纯种。
2)RX的鉴定:将RX纯菌株进行形态观察、革兰氏染色观察,提取DNA,将PCR扩增产物纯化后进行测序,所得序列进行Blast分析,并采用MEGA 7.0的Neighbor-Joining建立系统发育树。
结果显示:RX为单细胞,短杆状,细胞直径0.5~0.8×2.0~4.0μm,革兰氏染色阳性,不产芽胞,菌落表面湿润光滑,乳白色,兼性厌氧。RX核酸序列长度为1516bp,在NCBI数据库Blast分析表明,RX与Lactobacillus hilgardii的相似性为100%。从系统发育树(图1)可知,RX与Lactobacillus hilgardii LMG 07934和菌株YIT 0269处在同一分支中,证明RX为希氏乳杆菌。
实验例1
本实验例为希氏乳杆菌RX对亚硝态氮的降解实验,实验步骤如下:
1)菌液的制备:无菌条件下挑取保存的希氏乳杆菌RX单菌落到灭菌的细菌培养基中,30℃静置培养24h;测得菌液中有效活菌数为32.8×108CFU/mL;
2)接种:取菌液1mL接种至含100mL模拟污水的三角瓶中,模拟污水中亚硝态氮含量为10mg/L;
3)处理及指标测定:将三角瓶在30℃静置培养24h后取样,测氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量。结果如图2。从图2可知,希氏乳杆菌RX对模拟污水中亚硝态氮的去除率为96.5%,且不产生硝态氮和氨氮,说明希氏乳杆菌RX能将亚硝态氮彻底从水体中去除。
实施例2
本实施例提供了一种水质调节剂,由希氏乳杆菌RX制备得到。
将穿刺培养保存的希氏乳杆菌RX菌种接种到MRS液体培养基中,30℃静置培养24h,作为一级菌种;将制得的一级菌种按5%(v/v)的接种量接种到MRS液体培养基中,30℃静置培养24h,测得菌液的有效活菌浓度为32.8×108CFU/mL,检测pH降至3.62,作为二级菌种;将二级菌种按10%(质量比)接种量接种到固体物料(麸皮:豆粕:玉米粉:番茄匀浆:葡萄糖:磷酸二氢钾=20:20:20:20:5:1)中,在固体物料加一定比例的水,使最终的含水率为30%,用带呼吸阀塑料袋装好后,热耦合密封,30℃发酵72h,测得有效活菌浓度为532.8×108CFU/g,作为三级菌种;准备好干净的容量为1吨发酵容器,将三级菌种10kg置于发酵容器中,容器中加红糖50kg,清洁水1吨,置于30℃的环境中密封发酵4d,测定菌液的pH值为3.6,即发酵完成,得到合格的水质调节剂。
实施例3
本实施例提供了一种水质调节剂,由希氏乳杆菌RX制备得到。
将穿刺培养保存的希氏乳杆菌RX菌种接种到MRS液体培养基中,25℃静置培养26h,作为一级菌种;将制得的一级菌种按4%(v/v)的接种量接种到MRS液体培养基中,32℃静置培养26h,测得菌液的有效活菌浓度为30.5×108CFU/mL,检测pH降至3.50,作为二级菌种;将二级菌种按8%(质量比)接种量接种到固体物料(麸皮:豆粕:玉米粉:番茄匀浆:葡萄糖:磷酸二氢钾=20:20:20:20:6:1)中,在固体物料加一定比例的水,使最终的含水率为28%,用带呼吸阀塑料袋装好后,热耦合密封,25℃发酵60h,测得有效活菌浓度为521.8×108CFU/g,作为三级菌种;准备好干净的容量为1吨发酵容器,将三级菌种10kg置于发酵容器中,容器中加红糖40kg,清洁水1吨,置于35℃的环境中密封发酵3d,测定菌液的pH值为3.3,即发酵完成,得到合格的水质调节剂。
实施例4
本实施例提供了一种水质调节剂,由希氏乳杆菌RX制备得到。
将穿刺培养保存的希氏乳杆菌RX菌种接种到MRS液体培养基中,32℃静置培养20h,作为一级菌种;将制得的一级菌种按6%(v/v)的接种量接种到MRS液体培养基中,25℃静置培养20h,测得菌液的有效活菌浓度为34.2×108CFU/mL,检测pH降至3.81,作为二级菌种;将二级菌种按12%(质量比)接种量接种到固体物料(麸皮:豆粕:玉米粉:番茄匀浆:葡萄糖:磷酸二氢钾=20:20:20:20:5:2)中,在固体物料加一定比例的水,使最终的含水率为32%,用带呼吸阀塑料袋装好后,热耦合密封,27℃发酵48h,测得有效活菌浓度为505.2×108CFU/g,作为三级菌种;准备好干净的容量为1吨发酵容器,将三级菌种10kg置于发酵容器中,容器中加红糖25kg,清洁水1吨,置于20℃的环境中密封发酵5d,测定菌液的pH值为3.5,即发酵完成,得到合格的水质调节剂。
实验例2
本实验例在西青区选择两个相邻面积为10亩的养殖池进行试验,一个作为对照池,另一个为处理池,每个池塘均有独立的进、排水系统。放苗前蓄水1.5m,选择一代体质健壮的南美白对虾虾苗,虾苗规格为体长1.0cm~1.5cm,在2018年5月9日左右水温稳定在18℃以上投放,投放量为20000尾/亩,投虑食性鱼类白鲢10尾/亩。处理池使用实施例2制备的水质调节剂,选择晴天上午全池泼洒,15天使用1次,每次用量为20kg,每次泼洒过调节剂后开增氧机3.5h;对照池按照常规方法管理。定期取处理池和对照池的水样,检测亚硝态氮、氨氮和pH。
对取样数据进行处理,结果如图3~5。由图3可知,对照池的氨氮变化较小,而处理池的氨氮逐渐降低,到8月25日仅为0.55mg/L,明显低于对照池;由图4可知,使用本发明实施例2制备的水质调节剂的池塘亚硝态氮一直保持在较低的水平,低于0.1mg/L,而对照池亚硝态氮含量逐渐升高,到后期最后一次测定达到0.38mg/L;由图5可知,处理池的pH呈现逐渐降低的趋势,低于对照池;上述结果说明由希氏乳杆菌RX制备的水质调节剂的使用对氨氮、亚硝态氮具有较好的去除作用且能降低水体pH,有效防止了高浓度氨氮、亚硝态氮和高pH对养殖生物的伤害。
实施例5
本实施例提供了希氏乳杆菌RX作为发酵剂用于发酵饲料的小试实验:将分离保存的希氏乳杆菌RX与枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母复合用于发酵饲料。将5mL枯草芽胞杆菌K8与10mL热带假丝酵母、25mL希氏乳杆菌RX加入到118mL水中,混合均匀加入到500g商品料中,搅拌均匀装入呼吸袋中,呼吸袋热耦合封口,30℃发酵48h,然后检测商品料的菌含量和总酚、总蛋白及氨基酸含量。经检测发酵后商品料中总酚、总蛋白及氨基酸含量分别较发酵前提高6.20%、4.91%、6.15%,枯草芽胞杆菌、热带假丝酵母菌和希氏乳杆菌的有效活菌浓度分别达到1.6×106CFU/mL、2.5×108CFU/mL、2.0×109CFU/mL,说明有益菌发酵不仅增加了有益菌含量,还提高了饲料的营养成分。
实施例6
本实施例提供了希氏乳杆菌RX作为发酵剂用于发酵饲料的规模发酵:5L枯草芽胞杆菌K8与10L热带假丝酵母、25L希氏乳杆菌RX加入到118L水中,混合均匀加入到500kg商品料中,搅拌均匀后分装到25kg呼吸袋中,呼吸袋热耦合封口,30℃发酵5d,饲料由暗褐色变成黄褐色,散发出酸香味,经检测总酚、总蛋白及氨基酸含量分别较发酵前提高了6.58%、5.12%、6.63%,枯草芽胞杆菌、热带假丝酵母菌和希氏乳杆菌的有效活菌浓度分别达到2.0×106CFU/mL、4.19×108CFU/mL、3.3×109CFU/mL。投喂后具有明显的诱食效果。
由以上实施例可知,本发明提供的希氏乳杆菌RX生长速率快、产酸能力强,30℃培养24h的菌液中有效活菌浓度能够达到32.8×108CFU/mL,pH降至3.62;本发明提供的希氏乳杆菌RX能够降解亚硝态氮,且不积累硝态氮和氨氮,能明显降低水体中pH、氨氮和亚硝态氮的含量;本发明提供的希氏乳杆菌RX与酵母菌、芽孢杆菌复合可用于发酵饲料,活菌含量高,提高饲料的营养价值和利用率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)RX,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为:2020年4月10日,保藏编号为:CGMCC No.19559。
2.权利要求1所述的希氏乳杆菌RX用于降解氨氮、亚硝态氮的应用。
3.权利要求1所述的希氏乳杆菌RX用于调节水质的应用。
4.一种水质调节剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将权利要求1所述的希氏乳杆菌RX接种到MRS液体培养基中,在25~32℃下培养20~26 h,得到一级菌种;
(2)将一级菌种接种到MRS液体培养基中,在25~32℃下培养20~26 h,得到二级菌种;
(3)将二级菌种接种到固体物料中,调整固体物料的含水率为28~32%,在25~30℃下发酵48~72 h,得到三级菌种;
(4)在三级菌种中加入红糖和水,置于25~35℃的条件下发酵3~5 d,所得发酵产物即为水质调节剂。
5.如权利要求4所述的水质调节剂的制备方法,其特征在于,所述固体物料为麸皮、豆粕、玉米粉、番茄匀浆、葡萄糖、磷酸二氢钾按照质量比15~25:15~25:15~25:15~25:3~7:0.5~2混合得到。
6.如权利要求4所述的水质调节剂的制备方法,其特征在于,所述三级菌种、红糖和水的质量比为1:2.5~5:90~100。
7.权利要求4~6任一项所述的制备方法得到的水质调节剂。
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GR01 | Patent grant | ||
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