CN111534456B - 一种复合乳酸菌剂及其在甘蔗尾叶青贮中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合乳酸菌剂及其在甘蔗尾叶青贮中的应用。本发明提供的用于甘蔗尾叶青贮的复合乳酸菌剂的活性成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WQ‑01和希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)60TS‑2，该复合乳酸菌剂可维持甘蔗尾叶青贮的有氧稳定性、pH和温度，保持乳杆菌属在微生物菌群中的相对丰度，减少有氧暴露后干物质的损失。本发明的复合乳酸菌剂包含同型发酵和异型发酵两种类型的乳酸菌，不仅可以促使甘蔗尾叶在青贮初期快速发酵，还能够在接触空气后延长有氧稳定时间，从而提高甘蔗尾叶青贮的营养价值和延长甘蔗尾叶青贮的保存期。

Description

一种复合乳酸菌剂及其在甘蔗尾叶青贮中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其应用，特别涉及一种复合乳酸菌剂及其在甘蔗尾叶青贮中的应用。
背景技术
甘蔗属于碳四(C4)植物，光合利用率高。我国甘蔗种植面积居世界第三，年产甘蔗总量1.17亿吨，甘蔗尾叶占全株甘蔗鲜重20％，我国年产甘蔗梢2300万吨。传统处理甘蔗尾叶的方法是丢弃或者焚烧，不仅造成资源浪费而且污染环境。甘蔗尾叶可作为牛羊冬春季节的粗饲料，青贮可延长贮藏时间，提高甘蔗尾叶的适口性，从而提高饲用效率。
广西属亚热带地区，常年多雨，尤其是甘蔗尾叶收获的11月份至来年4月份，高水分甘蔗尾叶不仅难以青贮，其本底酵母菌数量高达105CFU/g鲜重，在发酵初期容易造成营养损失，且高湿环境容易滋生霉菌，有氧暴露后易发生二次发酵，霉变损失极其严重。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合乳酸菌剂及其在甘蔗尾叶青贮中的应用。
第一方面，本发明保护植物乳杆菌Lactobacillus plantarum和希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii的新用途。
本发明保护植物乳杆菌Lactobacillus plantarum和希氏乳杆菌Lactobacillushilgardii在制备甘蔗青贮饲料或甘蔗青贮添加剂中的应用。
第二方面，本发明保护一种菌剂。
本发明保护的菌剂的活性成分为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum和希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii。
进一步的，每毫升所述菌剂中至少含1.5×107CFU植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；每毫升所述菌剂中至少含1.5×107CFU希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii。在本发明的具体实施例中，每毫升所述菌剂中含1.5×107CFU植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；每毫升所述菌剂中含1.5×107CFU希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii。
更进一步的，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum和所述希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii的CFU之比为1：(1-10)。在本发明的具体实施例中，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum和所述希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii的CFU之比为1：1。
第三方面，本发明保护上述菌剂的制备方法。
本发明保护的上述菌剂的制备方法包括将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌剂和希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii菌剂与溶剂混匀的步骤。
进一步的，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌剂的制备方法包括如下步骤：将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum接种于培养基中，培养，离心，收集菌体沉淀，将菌体沉淀稀释到OD600＝1，得到植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌剂。
所述希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii菌剂的制备方法包括如下步骤：将希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii接种于培养基中，培养，离心，收集菌体沉淀，将菌体沉淀稀释到OD600＝1，得到希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii菌剂。
更进一步的，所述培养基具体可为MRS液体培养基。
所述培养条件具体可为37℃静置培养48h。
所述离心条件具体可为4℃、8500rpm离心10min。
将所述菌体沉淀用无菌生理盐水稀释到OD600＝1。所述无菌生理盐水的配方具体如下：将8.5g氯化钠溶解于1L无菌水中，得到所述无菌生理盐水。
所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌剂中植物乳杆菌Lactobacillusplantarum浓度具体为1×109CFU/mL。
所述希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii菌剂中希氏乳杆菌Lactobacillushilgardii浓度具体为5×108CFU/mL。
所述溶剂具体可为无菌生理盐水。
所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌剂与所述希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii菌剂的体积比具体可为1:2。
在本发明的具体实施例中，将0.75mL的所述植物乳杆菌Lactobacillusplantarum菌剂、1.5mL的所述希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii菌剂与无菌生理盐水混匀至总体积为50mL，得到所述菌剂，即本发明的复合乳酸菌剂。
第四方面，本发明保护上述菌剂或按照上述方法制备的菌剂的新用途。
本发明保护上述菌剂或按照上述方法制备的菌剂在如下A1)-A10)中任一种中的应用：
A1)制备甘蔗青贮饲料；
A2)作为甘蔗青贮添加剂；
A3)减少甘蔗青贮饲料中干物质的损失；
A4)维持甘蔗青贮饲料中有机酸(如乳酸、乙酸)含量的稳定；
A5)抑制甘蔗青贮饲料中氨态氮含量的增加；
A6)维持甘蔗青贮饲料的有氧稳定性；
A7)维持甘蔗青贮饲料中乳杆菌属的丰度；
A8)抑制甘蔗青贮饲料中有氧腐败菌(如醋酸杆菌属)的增殖；
A9)提高甘蔗青贮饲料的营养价值；
A10)延长甘蔗青贮饲料的保存期。
第四方面，本发明保护一种甘蔗青贮饲料的制备方法。
本发明保护的甘蔗青贮饲料的制备方法为如下方法甲或方法乙：
所述方法甲包括如下步骤：将上述菌剂或按照上述方法制备的菌剂施加到甘蔗上，进行青贮，得到甘蔗青贮饲料。
所述方法乙包括如下步骤：将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum和希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii施加到甘蔗上，进行青贮，得到甘蔗青贮饲料。
进一步的，所述方法甲中，所述菌剂的施用量为50mL菌剂/1.5kg(甘蔗鲜重)。
所述方法乙中，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum和希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii的施用量均为5×105CFU/g(甘蔗鲜重)。
更进一步的，所述青贮条件为在15-25℃、避光条件下贮存90天。
上述任一所述菌剂或方法或应用中，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum WQ-01；
所述希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii为希氏乳杆菌Lactobacillushilgardii60TS-2。
所述甘蔗为甘蔗尾叶。
上述方法在减少甘蔗青贮饲料中干物质的损失和/或维持甘蔗青贮饲料中有机酸含量的稳定和/或抑制甘蔗青贮饲料中氨态氮含量的增加和/或维持甘蔗青贮饲料的有氧稳定性和/或维持甘蔗青贮饲料中乳杆菌属的丰度和/或抑制甘蔗青贮饲料中有氧腐败菌的增殖和/或提高甘蔗青贮饲料的营养价值和/或延长甘蔗青贮饲料的保存期中的应用也属于本发明的保护范围。
第五方面，本发明保护一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum WQ-01。
本发明保护的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum WQ-01的保藏编号为CGMCCNo.13318。该菌株已于2016年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.13318。
第六方面，本发明保护一种希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii 60TS-2。
本发明保护的希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii 60TS-2的保藏编号为CGMCCNo.19435。该菌株已于2020年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.19435。
本发明的目的是提供一种用于甘蔗尾叶青贮的复合乳酸菌剂，其包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WQ-01和希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)60TS-2，该复合乳酸菌剂可维持甘蔗尾叶青贮的有氧稳定性、pH和温度，保持乳杆菌属在微生物菌群中的相对丰度，减少有氧暴露后干物质的损失。本发明的复合乳酸菌剂包含同型发酵和异型发酵两种类型的乳酸菌，不仅可以促使甘蔗尾叶在青贮初期快速发酵，还能够在接触空气后延长有氧稳定时间，从而提高甘蔗尾叶青贮的营养价值和延长甘蔗尾叶青贮的保存期。
保藏说明
菌种名称：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus plantarum
菌株编号：WQ-01
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年11月18日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13318
菌种名称：希氏乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus hilgardii
菌株编号：60TS-2
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年3月4日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19435
附图说明
图1为复合乳酸菌剂对甘蔗尾叶青贮有氧暴露后干物质含量的影响。
图2为复合乳酸菌剂对甘蔗尾叶青贮有氧暴露后干物质损失的影响。
图3为复合乳酸菌剂对甘蔗尾叶青贮有氧暴露后pH的影响。
图4为复合乳酸菌剂对甘蔗尾叶青贮有氧暴露后乳酸含量的影响。
图5为复合乳酸菌剂对甘蔗尾叶青贮有氧暴露后乙酸含量的影响。
图6为复合乳酸菌剂对甘蔗尾叶青贮有氧暴露后氨态氮含量的影响。
图7为复合乳酸菌剂对甘蔗尾叶青贮有氧暴露后温度的影响。
图8为复合乳酸菌剂对甘蔗尾叶青贮有氧暴露后微生物菌群的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、菌株的分离、鉴定与保藏
一、菌株的分离
植物乳杆菌WQ-01分离自甜高粱，希氏乳杆菌60TS-2分离自甘蔗尾叶。具体分离方法如下：取甜高粱或甘蔗尾叶10g，加90mL生理盐水，依次将其稀释到10-7，选取适宜的梯度涂布于MRS培养基(1L MRS培养基配方为牛肉膏10g，酪蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二胺2g，Tween80 1mL，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·7H2O0.25g，琼脂粉1.5％，双蒸水定容到lL，高压灭菌)。37℃静置培养48h，挑取边缘圆滑的单克隆转接在MRS液体培养基，继续37℃静置培养48h，培养液保存至终浓度为25％甘油的冻存管中。
二、菌株的分子鉴定
对WQ-01菌株和60TS-2菌株的16S rDNA序列进行扩增并测序。引物序列如下：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
WQ-01菌株的16S rDNA序列如序列表中序列1所示。60TS-2菌株的16S rDNA序列如序列表中序列2所示。WQ-01菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库中的植物乳杆菌的相似性为99.79％，60TS-2菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库中的希氏乳杆菌的相似性为99.67％。
三、菌株的保藏
综合上述鉴定结果，确定WQ-01菌株名称为植物乳杆菌，其分类命名为Lactobacillus plantarum，该菌株已于2016年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.13318。
综合上述鉴定结果，确定60TS-2菌株名称为希氏乳杆菌，其分类命名为Lactobacillus hilgardii，该菌株已于2020年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.19435。
四、菌株的生物学特性
分别将植物乳杆菌WQ-01和希氏乳杆菌60TS-2在MRS液体培养基(北京陆桥技术股份有限公司，货号为CM187)或在MRS固体培养基(MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉)中生长，37℃厌氧培养。生物学特性鉴定结果如表1所示。
结果表明：植物乳杆菌WQ-01和希氏乳杆菌60TS-2均为革兰氏阳性菌，杆状结构，过氧化氢酶阴性，氧化酶阴性，耐受3.0％和6.5％NaCl浓度。植物乳杆菌L.plantarum WQ-01为同型发酵菌株，能够在pH 3.5～8.5范围内生长，在pH2.0有较弱生长，在15～45℃生长；希氏乳杆菌L.hilgardii 60TS-2为异型发酵菌株，能够在pH 3.5～8.0范围内生长，在pH2.0有较弱生长，在15～40℃生长，在45℃有较弱生长。
表1、植物乳杆菌WQ-01和希氏乳杆菌60TS-2的菌株特性
特性 L.plantarum WQ-01 L.hilgardii 60TS-2
保藏编号 CGMCC No.13318 CGMCC No.19435
形状 杆状结构 杆状结构
革兰氏染色 + +
发酵类型 Homofermentation同型发酵 Heterofermentation异型发酵
过氧化氢酶 - -
氧化酶 - -
生长pH
2.0 W W
3.5 + +
4.0 + +
4.5 + +
8.0 + +
8.5 + -
9.0 - -
耐受NaCl
3.0％ + +
6.5％ + +
生长温度
10℃ - -
15℃ + +
20℃ + +
25℃ + +
30℃ + +
35℃ + +
40℃ + +
45℃ + W
注：+为阳性，-为阴性，W为弱阳性。
实施例2、复合乳酸菌剂的制备及其应用
一、复合乳酸菌剂的制备
1、植物乳杆菌WQ-01菌剂的制备
将植物乳杆菌WQ-01接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养48h，4℃下8500rpm离心10min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀用无菌生理盐水稀释到OD600＝1，得到植物乳杆菌WQ-01菌剂(液态)，植物乳杆菌WQ-01菌剂(液态)中植物乳杆菌WQ-01浓度为1×109CFU/mL。
2、希氏乳杆菌60TS-2菌剂的制备
将希氏乳杆菌60TS-2接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养48h，4℃下8500rpm离心10min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀用无菌生理盐水稀释到OD600＝1，得到希氏乳杆菌60TS-2菌剂(液态)，希氏乳杆菌60TS-2菌剂(液态)中希氏乳杆菌60TS-2浓度为5×108CFU/mL。
3、复合乳酸菌剂
将0.75mL的植物乳杆菌WQ-01菌剂、1.5mL的希氏乳杆菌60TS-2菌剂与无菌生理盐水混匀，至总体积为50mL，得到复合乳酸菌剂。每50mL复合乳酸菌剂含0.75×109CFU植物乳杆菌WQ-01和0.75×109CFU希氏乳杆菌60TS-2。
二、甘蔗青贮
1、试验材料：来源于广西壮族自治区畜牧研究所试验田的新鲜甘蔗尾叶，对甘蔗尾叶进行切割，切至长度为2～4cm。
2、试验方法
对照组(CK)：将50mL生理盐水全部喷洒在1.5kg新鲜甘蔗尾叶上。
试验组(LHLP)：将50mL复合乳酸菌剂全部喷洒在1.5kg新鲜甘蔗尾叶上，植物乳杆菌WQ-01和希氏乳杆菌60TS-2的终浓度均为5×105CFU/g甘蔗尾叶鲜重。
分别将试验组和对照组处理后的甘蔗尾叶青贮装入聚乙烯袋中，每个处理3个重复，抽真空后在15～25℃、避光条件下贮存90天，得到甘蔗尾叶青贮饲料。贮存90天后开袋(有氧暴露)。
三、甘蔗青贮效果检测
1、干物质(DM)检测
为了研究复合乳酸菌对甘蔗尾叶青贮饲料中干物质的影响，对青贮甘蔗样品的干物质含量进行检测。具体步骤如下：
在贮存90天后开袋，分别在开袋后0、1、2、3、4、5天采集样品进行干物质检测。干物质检测步骤如下：称取约100g样品，在恒温干燥器中65℃烘干至恒重，自然冷却至室温后称重，计算测定样品中干物质的含量。有氧暴露5天干物质损失＝有氧暴露0天干物质含量-有氧露5天干物质含量。
结果如图1和图2所示，青贮90天后，对照组(CK)干物质含量(26.11％)高于试验组(LHLP)的干物质含量(25.35％)，但有氧暴露5天后，LHLP组干物质含量(24.76％)高于对照组的干物质含量(24.42％)。在有氧暴露5天后，LHLP组干物质损失(0.59％)显著低于CK组(1.69％)。说明复合乳酸菌剂可较好的保存甘蔗尾叶青贮饲料中的干物质含量、减少甘蔗青贮饲料中的干物质损失。
2、发酵产物检测
为了研究复合乳酸菌对甘蔗尾叶青贮饲料中发酵产物的影响，对青贮甘蔗样品的pH、有机酸(乳酸、乙酸)和氨态氮进行检测。具体步骤如下：
在贮存90天后开袋，分别在开袋后0、1、2、3、4、5天采集样品进行pH和有机酸检测。取25g青贮甘蔗尾叶，加入225mL生理盐水，混合均匀后置于4℃冰箱过夜放置。然后用4层纱布过滤分装置50mL离心管中，进行pH、有机酸和氨态氮的测定。pH值采用pH计(pH 213；HANNA；意大利)测定。有机酸含量采用配备有UV检测器(210nm)和柱(ICSep COREGEL-87H)的HPLC(1200，Agilent，America)检测，55℃下，流动相为0.005M H2SO4，流速为0.6mL/min。氨态氮含量使用苯酚次氯酸盐和茚三酮比色法测定。
pH值测定结果如图3所示，青贮90天后，与CK组(pH＝3.71)相比，LHLP组的pH值略高，为3.82。但是在有氧暴露2天后，CK组pH值急剧增加，直至有氧暴露5天后的4.95；LHLP组的pH值在有氧暴露5天内pH几乎稳定，始终保持4.0以下。
乳酸含量测定结果如图4所示，青贮90天后，与CK组(107.43g/kg DM)相比，LHLP组的乳酸含量较低，为66.26g/kg DM，但有氧暴露后CK组乳酸含量逐渐下降，直至有氧暴露5天后的31.6g/kg DM，而LHLP组的乳酸含量维持较稳定水平，有氧暴露5天后乳酸含量仍然维持在65g/kg DM以上。
乙酸含量测定结果如图5所示，青贮90天后，与CK组(15.66g/kg DM)相比，LHLP组的乙酸含量较高，为38.68g/kg DM，且有氧暴露后CK组乙酸含量逐渐下降，直至有氧暴露5天后的2.88g/kg DM，而LHLP组的乙酸含量维持较稳定水平，有氧暴露5天后乙酸含量为26.75g/kg DM，是CK组的9倍。
氨态氮含量测定结果如图6所示，青贮90天后，CK组和LHLP组的氨态氮含量均低于1g/kg DM，而有氧暴露3天后，CK组氨态氮逐渐增加，达到1.74g/kg DM，是初始值0.83g/kgDM的2倍，LHLP组的氨态氮含量在有氧暴露后几乎不变，在有氧暴露第5天仍然维持较低水平，为0.68g/kg DM。
以上结果说明复合乳酸菌能够维持甘蔗尾叶青贮饲料中乳酸、乙酸含量的稳定，抑制氨态氮含量的增加。
3、有氧稳定性检测
为了研究复合乳酸菌对甘蔗尾叶青贮饲料有氧稳定性的影响，对青贮甘蔗样品的有氧稳定性进行检测。具体步骤如下：
青贮90天后，打开青贮袋，通过多通道数据记录仪(SMOWO，型号：MDL-1048A；中国上海天河自动化仪器有限公司，中国)测量温度，设置为每4小时记录一次。为了防止干燥和污染，将样品袋用双层纱布覆盖。当青贮饲料温度比环境温度升高2℃以上定义为有氧腐败。
有氧稳定性测定结果如图7所示，CK组在有氧暴露20h后温度为28.5℃，高于室温(26.5℃)2℃，即发生有氧腐败，LHLP组在有氧暴露64h后温度才达到28.5℃，有氧稳定时间是CK组的3倍。而且，CK组的最高温度为32.3℃(有氧暴露40.3h后)，LHLP组的最高温度仅为29.2℃(有氧暴露68.3h后)，低于CK组。说明复合乳酸菌剂有助于维持甘蔗尾叶青贮饲料的有氧稳定性，从而维持甘蔗尾叶青贮开袋后的品质。
4、微生物菌群检测
为了研究复合乳酸菌对甘蔗尾叶青贮饲料中微生物菌群的影响，对青贮甘蔗样品的微生物菌群进行检测。具体步骤如下：
青贮90天后，打开青贮袋使其有氧暴露，在有氧暴露后的第0天和第2天取10g青贮样品，加入90mL无菌生理盐水，振荡30min后将溶液过滤4层纱布，滤入50mL无菌离心管中；4℃下10000rpm离心15min，弃上清；用1mL无菌生理盐水吹打沉淀，转移到1.5mL离心管中，4℃下10000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀。用试剂盒(MP，货号12888-100)提取微生物DNA。对提取的DNA进行高通量测序，并计算微生物菌群丰度。微生物菌群丰度的计算方法如下：在高通量测序后，将所获得的测序序列进行拼接，经过质控后得到干净高质量序列，然后对所有样品进行抽平，某种属的微生物丰度为该种属的序列数占样品微生物总序列数的比例。
结果如图8所示，青贮90天后，与CK组(76.02％)相比，LHLP组乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度较高，占微生物菌群丰度的99.81％，而醋酸杆菌属(Acetobacter)的相对丰度较低；在有氧暴露2天后，即CK组已经发生有氧腐败，此时CK组乳杆菌属的相对丰度下降至6.23％，远低于LHLP组乳杆菌属的相对丰度(73.54％)，反而醋酸杆菌属的相对丰度升高至93.66％，远高于LHLP组醋酸杆菌属的相对丰度(26.39％)。乳杆菌属在青贮品质好的青贮中占据主导地位，乳杆菌属中异型发酵的乳酸菌有助于青贮有氧稳定，而醋酸杆菌属恰恰是导致青贮有氧腐败的关键微生物。说明复合乳酸菌剂有助于维持甘蔗尾叶青贮饲料中乳杆菌属的丰度，抑制有氧腐败菌的增殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一种复合乳酸菌剂及其在甘蔗尾叶青贮中的应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1427
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
caagtcgaac gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt 60
ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa 120
cagatgctaa tatttcataa caacttggac cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg 180
gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca 240
tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc 300
ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga 360
gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac 420
atatctgaga gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa 540
agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg 600
catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg 660
aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga 720
cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccataccgt 780
aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta 840
agcattccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt 960
gacatactat gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt 1020
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccttattatc agttgccagc attaagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200
ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaac tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca 1260
ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380
tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg gtaacctttt aggaatt 1427
<210>2
<211>1495
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gcgtcttggt caatgaagtt 60
gagtgcttgc atttaactga tccacattaa gacgagtggc gaactggtga gtaacacgtg 120
ggtaacttgc cccgaagcgg gggataacat ttggaaacag gtgctaatac cgcataacaa 180
caaaaaccac atggtttttg tttaaaagat ggtttcggct atcactttgg gatggacccg 240
cggcgtatta gctagttggt gaggtaatgg ctcaccaagg caatgatacg tagccgacct 300
gagagggtaa tcggccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca 360
gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgatgaag 420
ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttgga gaagaacggg tgtcagagta actgttgaca 480
tcgtgacggt atccaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 540
gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttag 600
gtctgatgtg aaagccttcg gcttaaccgg agaagtgcat cggaaaccgg gagacttgag 660
tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa 720
caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg caactgacgc tgaggctcga aagcatgggt 780
agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttgg 840
agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga 900
ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 960
ttaattcgat gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcttctgct aacctaagag 1020
attaggcgtt cccttcgggg acggaatgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1080
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tattgtcagt tgccagcatt 1140
tagttgggca ctctggcgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1200
aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacgg tacaacgagt 1260
cgcgaaaccg cgaggtcaag ctaatctctt aaagccgttc tcagttcgga ttgtaggctg 1320
caactcgcct acatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagcatgc cacggtgaat 1380
acgttcttgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagc 1440
cggtgaggta accttcgggg gccagccgtc taaggtggga cagatgatta gggtg 1495

Claims (10)

1.植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）在制备甘蔗青贮饲料或甘蔗青贮添加剂中的应用；
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）WQ-01 CGMCC No.13318；
所述希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）为希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）60TS-2 CGMCC No.19435。
2.一种菌剂，其活性成分为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）；
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）WQ-01 CGMCC No.13318；
所述希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）为希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）60TS-2 CGMCC No.19435。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：每毫升所述菌剂中至少含1.5×107 CFU植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；每毫升所述菌剂中至少含1.5×107 CFU希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于：所述植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）和所述希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）的CFU之比为1：（1-10）。
5.权利要求2-4任一所述的菌剂的制备方法，包括将植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）菌剂和希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）菌剂与溶剂混匀的步骤；
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）WQ-01 CGMCC No.13318；
所述希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）为希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）60TS-2 CGMCC No.19435。
6.权利要求2-4任一所述的菌剂或按照权利要求5所述方法制备的菌剂在如下A1）-A10）中任一种中的应用：
A1）制备甘蔗青贮饲料；
A2）作为甘蔗青贮添加剂；
A3）减少甘蔗青贮饲料中干物质的损失；
A4）维持甘蔗青贮饲料中有机酸含量的稳定；
A5）抑制甘蔗青贮饲料中氨态氮含量的增加；
A6）维持甘蔗青贮饲料的有氧稳定性；
A7）维持甘蔗青贮饲料中乳杆菌属的丰度；
A8）抑制甘蔗青贮饲料中有氧腐败菌的增殖；
A9）提高甘蔗青贮饲料的营养价值；
A10）延长甘蔗青贮饲料的保存期。
7.一种甘蔗青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：将权利要求2-4任一所述的菌剂或按照权利要求5所述方法制备的菌剂施加到甘蔗上，进行青贮，得到甘蔗青贮饲料。
8.一种甘蔗青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：将植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）和希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）施加到甘蔗上，进行青贮，得到甘蔗青贮饲料；
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）WQ-01 CGMCC No.13318；
所述希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）为希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）60TS-2 CGMCC No.19435。
9.权利要求7或8所述的方法在减少甘蔗青贮饲料中干物质的损失和/或维持甘蔗青贮饲料中有机酸含量的稳定和/或抑制甘蔗青贮饲料中氨态氮含量的增加和/或维持甘蔗青贮饲料的有氧稳定性和/或维持甘蔗青贮饲料中乳杆菌属的丰度和/或抑制甘蔗青贮饲料中有氧腐败菌的增殖和/或提高甘蔗青贮饲料的营养价值和/或延长甘蔗青贮饲料的保存期中的应用。
10.希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）60TS-2，其保藏编号为CGMCC No.19435。
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