CN106028829A - 青贮饲料接种剂的稳定性和用于提高青贮饲料的有氧稳定性的方法 - Google Patents

青贮饲料接种剂的稳定性和用于提高青贮饲料的有氧稳定性的方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种用于处理青贮饲料的方法，其包括将青贮饲料接种剂加入青贮饲料中，所述青贮饲料接种剂包含青贮饲料保存有效量的希氏乳杆菌(Lactobaci l lus hi lgardi i)。所述青贮饲料接种剂能有效防止或降低有氧酸败。

Description

青贮饲料接种剂的稳定性和用于提高青贮饲料的有氧稳定性 的方法
本发明涉及青贮饲料。更具体地，涉及青贮饲料接种剂和使用青贮饲料接种剂提高青贮饲料的有氧稳定性的方法。
青贮饲料是饲喂反刍动物(如，反刍动物，如牛和绵羊)的发酵的、高水分草料。将青贮饲料发酵并储存于储料仓中，这是一种称为青贮法的方法。青贮饲料最常见的是由草或谷类作物制得，包括黑麦草、苜蓿、羊茅草、玉米或高粱。青贮饲料由整菌株植物或其部分制得。青贮饲料还可以由许多其他农田作物制得，包括甘蔗等等，如，例如，当进行时，有时候使用针对燕麦的oatlage，针对苜蓿的半干青贮饲料。有时使用混合物，如燕麦和豌豆。
青贮饲料的生产和相关的作物耕作在近些年已经发展到可以限定多种不同方法的程度。这些是：(i)具有特别低干物质(例如，低于25％)的嫩草的青贮；(ii)较高干物质，更成熟草的青贮，或通过萎蔫获得的高干物质但是嫩草的青贮；和(iii)整个玉米，包括秸秆和玉米穗轴的青贮，通常为约35％的干物质浓度，或整个谷类作物的青贮，例如，小麦，45-50％干物质。
尽管这些方法通常引起良好的产量，但不是没有问题。特别是在第(ii)和(iii)情况中，经常出现一个主要问题。这是称为有氧酸败的现象。有氧酸败的过程在料仓打开，物质暴露于空气时发生。其可以分成特定的阶段。首先，存在初始阶段，其中酵母和有时醋酸细菌开始呼吸保存的有机酸，提高青贮饲料pH，并且温度开始上升。初始的pH升高后，存在第二个阶段，其中杆菌的活性是明显的，并且与递增的温度相关。再一个阶段包括各种微生物，包括真菌的活性。
在含有实质性含量的干物质(即，超过30％)的那些青贮饲料中，酸败的问题特别严重。一旦青贮饲料堆打开并暴露于空气，或多或少可以看到酸败。
生物添加剂，如细菌接种剂，已经广泛用于改善青贮饲料的加工，主要是用于提高乳酸产生的程度和速率，以及防止好养酸败。Mann等的美国专利No.6,326,037提供了用于改善这种状况的方法和组合物。特别地，其中描述了至少部分基于将好养酸败过程鉴定为与暴露于进入的空气时料堆中的升温密切相关。随后所述青贮饲料的检查显示出高浓度的嗜热革兰氏阳性细菌，包括杆菌，酵母和霉菌。这显然证明了二次发酵的开始，类似于堆肥的开始(主发酵是青贮过程)。在这个发酵阶段中，酵母和霉菌占优势。显然，为了防止酸败，需要杀灭或抑制的三种主要类别的生物体是产孢子细菌、酵母和真菌。只消除一种类别可能导致剩余类别的增殖，使得不能防止酸败。
因此，Mann教导了通过使用处理生物体来防止酸败，所述处理生物体至少在第一种情况中，抑制启动有氧酸败的微生物，主要是酵母，以及在青贮饲料表面的真菌。能够起到该作用的生物体还可以抑制其他酸败微生物的发展，并且可以通过筛选来鉴定。符合这个要求的布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)种的生物体已经于1996年2月13日保藏于National Collection of Industrial and Marine Bacteria。其保藏号为40788。
尽管使用布氏乳杆菌的处理降低了青贮饲料中的酸败，但只是在有限的程度上。因此，仍然需要改善的青贮饲料处理，特别是用于提高青贮饲料的有氧稳定性，同时提高回收的干物质量。
发明概述
在一个方面中，提供了一种用于处理青贮饲料的方法。该方法包括将包含青贮饲料保存有效量的希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)的青贮饲料接种剂加入所述青贮饲料中。所述青贮饲料接种剂能有效防止或降低有氧酸败。
在另一个方面中，提供了一种包含青贮饲料保存有效量的希氏乳杆菌的青贮饲料接种剂。
在青贮饲料接种剂的一个方面中，所述青贮饲料接种剂进一步包含 载体。
在进一步的方面中，提供了包含青贮饲料保存有效量的希氏乳杆菌的青贮饲料。
在所述方法的一个方面中，在所述青贮饲料接种剂和所述青贮饲料中，希氏乳杆菌是具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4784的希氏乳杆菌菌株SIL51和具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4785的希氏乳杆菌菌株SIL52中的至少一种。所述菌株已经被法国Lal lemand SAS 19rue des Briquettiers,31702Blagnac Cedex保藏于国立微生物保藏中心(Institut Pasteur 25Rue Du Docteur Roux 75724Paris Cedex 15)。
在所述方法的一个方面中，所述青贮饲料接种剂进一步包含载体。
在再进一步的方面中，提供了具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4784的希氏乳杆菌菌株SIL51的分离菌株或其遗传等价物。
在另一个方面中，提供了具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4785的希氏乳杆菌菌株SIL52的分离菌株或其遗传等价物。
发明详述
根据本发明，已经分离和纯化了提高青贮饲料的有氧稳定性的乳酸细菌。更具体地，希氏乳杆菌已经显示出增强青贮饲料的有氧稳定性。此外，当接种于青贮饲料时，希氏乳杆菌菌株产生保存完好的青贮饲料，并且其中与有氧酸败和加热相关的二次发酵的开始得到降低或防止。
本发明的菌株从甘蔗(Saccharum spp.)青贮饲料分离。该菌株纯化和分离后，进行了分类学研究以鉴别该菌株。其中两个菌株鉴别为希氏乳杆菌并且给予原型号SIL51和SIL52。
因此，本发明提供了青贮饲料接种剂和使用青贮饲料接种剂提高青贮饲料的有氧稳定性的方法。
在本文中使用时，术语“青贮饲料保存有效量”将理解为表示至少足以保存青贮饲料的量。因此，所述量为至少足以提高青贮饲料的稳定性，但优选是足以提高青贮饲料的稳定性同时提高收集的干物质量的量。
在本文中使用时，术语“有氧稳定性”将理解为表示在升高高于环 境温度超过2℃前青贮饲料的温度保持稳定的小时数。
现在将参考本文中描述的实施方案。将理解并不打算由此限制本发明的范围。进一步理解本发明的公开内容包括所示实施方案的任何改变和变化并且包括本发明公开原理的更多应用，如本发明公开所属领域中的技术人员通常进行的。
在一个实施方案中，提供了一种用于处理青贮饲料的方法。该方法包括将青贮饲料接种剂加入所述青贮饲料中的步骤，所述青贮饲料接种剂包含青贮饲料保存有效量的希氏乳杆菌。所述青贮饲料接种剂能有效防止或降低有氧酸败。
还提供了一种至少包含希氏乳杆菌菌株的青贮饲料接种剂。更具体地，所述青贮饲料接种剂包含青贮饲料保存有效量的希氏乳杆菌种。
在上述方法和青贮饲料接种剂的一个实施方案中，希氏乳杆菌菌株是2013年6月26日提交的希氏乳杆菌菌株CNCM I-4784(SIL51)、2013年6月26日提交CNCM I-4785(SIL52)的分离菌株，或其遗传等价物。将理解还考虑了2013年6月26日提交的菌株CNCM I-4784(SIL51)和CNCM I-4785(SIL52)的保持了本发明中所述的提高草料有氧稳定性的功能活性的突变体或遗传等价物。
与诱导突变或遗传等价物的方式无关，关键问题在于它们能够与亲本菌种和/或菌株一样来提高青贮饲料的有氧稳定性。换句话说，本发明包括导致此类微小改变(例如，微小的分类学改变)的突变。
根据本发明的青贮饲料接种剂可以是液体或固体形式并且可以包含其他细菌菌株。根据本发明的青贮饲料接种剂可以包含合适的载体或可以按原样使用。以固体形式时，该青贮饲料接种剂可以包含固体载体。合适的载体可以是含水或非含水形式或固体形式。含水或非含水液体形式载体的实例包括水、油和石蜡(parafins)。固体形式载体的实例包括有机或无机载体，如，例如，麦芽糖糊精、淀粉、碳酸钙、纤维素、乳清、磨碎的玉米芯和二氧化硅。固体组合物可以以轻质粉尘的形式直接施用于草料中，或如果将其分散于液体载体中，可以将其成功地喷在草料上。将理解可以使用用于本发明目的的任何其他合适的载体。
显然抑制物质可能是次生代谢产物。因此，当用于青贮饲料中时，如果青贮饲料打开太快，可能看不到完全的作用。青贮饲料优选保持密闭至少30天，并且更优选至少45天。最佳时间段特别是取决于青贮饲料堆的大小和被青贮材料的性质。
根据本发明，适用于青贮的材料是易受有氧酸败影响的那些。所述材料通常含有至少20％重量的干物质。这样的材料包括，例如，黑麦或传统青草、玉米，包括高水分玉米、整菌株玉米、紫花苜蓿、枯萎的青草、小麦、豆类、高粱、向日葵、大麦、其他整菌株谷类作物和其他农田作物，如甘蔗。青贮饲料可以是捆包(bales)(一种特别易受有氧酸败影响的形式)、氧限制袋、料仓、直立仓状青贮窖、氧限制青贮窖、袋、堆或任何其他合适的易受有氧酸败影响的存储形式。在一个实施方案中，本发明的青贮饲料接种剂可以与任何合适的动物饲料一起使用，不管该饲料是固体还是液体，用于饲喂动物，如，例如，猪、家禽或反刍动物。
以下实施例用于进一步描述和限定本发明，并且并不打算以任何方式来限制本发明。
实施例
实施例1：
从大约12月大的植物新鲜切割的甘蔗制得青贮饲料。人工采收甘蔗并使用实验室型切碎机(Pinheiro，型号：PP-47)切成大约30mm的长度。将3kg切碎的材料与接种剂混合并且在PVC塑料仓(迷你-青贮窖，10cm直径和60cm长)中调和，所述仓用含有用于气体释放的Bunsen阀的密封盖密封。将青贮窖中的材料压缩成大约630±19.9kg m-3的密度。将迷你-青贮窖储存在室温并且在储存61天后分析，对于每个青贮窖，准备了三个重复。
使用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SIL 34(植物乳杆菌通常用作青贮饲料接种剂)和希氏乳杆菌菌株SIL 51(2013年6月26日的CNCM I-4784)和SIL 52(2013年6月26日的CNCM I-4785) 作为接种剂来生产青贮饲料。从甘蔗青贮饲料分离了植物乳杆菌和希氏乳杆菌菌株，并且鉴定为具有98％序列同一性。将没有使用任何接种剂的青贮饲料用作对照。根据等(Effects of an indigenous and a commercialLactobacillus buchneri strain on quality of sugar cane silage，Grass ForageSci 6:384-394，2009)来培养接种剂。最终培养后，在De Man Rogosa Sharpe琼脂(OxoidCM361，Basingstoke，Hampshire，英国)上计数细胞数，并且将培养物的浓度调节至9logcfu ml-1。将培养物与80mL无菌蒸馏水混合并且喷在切碎的甘蔗上至6log cfu g-1草的终浓度。对照接受了相同量的不含任何细菌的水。对于每次处理，使用分开的喷雾器，以避免交叉污染。
记录了空的和满的青贮窖的重量。密封后，将青贮窖维持在室温(平均25℃)并且防止日晒雨淋。青贮61天后，在打开之前，将满的青贮窖称重。使用新鲜草料和青贮饲料的重量和DM含量计算了干物质(DM)的损耗。
与其他菌株和对照相比，使用植物乳杆菌(SIL 34)的接种获得了具有较低DM含量，较高DM损耗和较高NDF的青贮饲料。在接种了希氏乳杆菌菌株SIL 51和SIL 52的青贮饲料中，发现与SIL 34和对照相比，DM损耗较低(表1)。接种这些相同菌株还获得了具有较高DM含量和较低NDF的青贮饲料。该接种剂没有影响青贮饲料的pH值和可溶性碳水化合物含量。
表1在没有使用接种剂和使用不同接种剂青贮第61天时甘蔗青贮饲料的化学组成
b-干物质含量；c-新鲜物质；d-中性去污剂纤维；e-水溶性碳水化合物；f：乳酸细菌。
一栏中具有不同字母的平均值是显著差异的(p<0.05)。
分析程序
在打开那天，从每个迷你青贮窖中取出两个样品，并且将迷你窖中的所有内含物均质。将样品之一称重并在风扇辅助烘箱中在55℃下干燥96小时；另一个样品用于制备水提物，以测定pH值，评价微生物群和检查发酵终产物。
将干燥的样品在使用30-目筛网的Willey-型研磨机中磨碎，并储存在标记的塑料罐中。分析了样品的DM含量(AOAC(1990)Official methods of analyses，第15版，Washington，DC，USA：Association of Official Analytical Chemists)，通过酚方法分析了水溶性碳水化合物(WSC)(Dubois M，Gilles KA，Hamilton JK，Rebers PA，Smith F(1956)Colorimetric method for determination of sugars and related substances，Anal Chem 28:350-356)和通过Holden描述的分析了中性去污剂纤维(NDF)(Comparisonof methods of in vitro dry matter digestibility for ten 565feeds.J Dairy Sci82:1791-1794；1999)，使用Ankom纤维分析仪(ANKOM Technology Corporation，Fairport，NY，USA)并基于DM来表示。
根据Carvalho等(Effects of propionic acid and Lactobacillus buchneri(SIL 72)addition on fermentative and microbiological characteristics of sugarcane silage treated with or without calcium oxide，Grass Forage Sci doi:10.1111/j.1365-2494.2012.00863.x)，通过HPLC测量了乙醇、1,2-丙二醇以及乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的水平。通过将其停留时间与已知标准品的停 留时间进行比较来鉴别酸、乙醇和1,2-丙二醇。通过外部校准方法来测定鉴定的化合物的浓度。HPLC装置(Shimadzu型号LC-10Ai；Shimadzu Corp.，东京，日本)配备有由紫外检测仪(UV-VisSPD-10Ai)和折射率检测仪(RID 10A)组成的双检测系统。将在50℃下运行的来自Shimadzu(Shim-pack SCR-101H；7.9mm X 30cm)的离子排阻柱用于色谱分离。移动相由100mM高氯酸溶液组成，使用0.6mL分钟-1的流速。通过UV吸收(210nm)检测了酸。使用折射率检测仪鉴定了乙醇和1,2-丙二醇。使用电位计(Expandomatic Beckman SS-2)测量了pH值。
如表2中所示，接种了SIL 51和SIL 52菌株的具有最低DM损耗的青贮饲料具有浓度低于SIL 34和对照的乙醇浓度。导致具有最高DM损耗的青贮饲料的SIL 34产生了最高量的乳酸。在接种了SIL 51和SIL 52菌株的青贮饲料中，还注意到了与SIL 34和对照相比较高浓度的乙酸和1,2-丙二醇。丙酸水平相似地低，与SIL 34和对照青贮饲料一致。
表2在没有使用接种剂和使用希氏乳杆菌接种剂青贮第61天时甘蔗青贮饲料的乳酸、乙酸、丙酸和丁酸以及乙醇和1,2-丙二醇
微生物分析
将新鲜草料和接种61天后的甘蔗青贮饲料的样品(70g)与630mL的0.1％无菌蛋白胨水混合并在轨道混合器中用120rpm搅拌20分钟。随后，制备10-倍稀释，以定量不同的微生物组。在厌氧孵育(AnaeroGen；Oxoid，Basingstoke，UK)后，使用含有0.1％盐酸半胱氨酸(Merck， Dasmstadt，德国)和0.4％放线菌酮(0.4％)(Sigma)的MRS琼脂(De Man RogosaSharpe，Difco，Detroit，MI，USA)将乳酸细菌(LAB)逐一计数。将平板在30℃下孵育48小时。将平板在28℃下孵育72小时后，在Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol培养基(DRBC，Difco；Becton Dickinson，Sparks，MD，USA)上，将酵母和丝状真菌逐一计数。对于所有微生物，只计数含有30至300cfu的平板。
青贮饲料的有氧稳定性的评价
青贮90天后，打开迷你青贮窖，并且从每个迷你青贮窖中取出大约3kg的重复三份的样品，并且放入5-kg塑料仓中，以评价其有氧稳定性。将温度计插入青贮饲料堆中，至10cm的深度，持续7天。将容器保存在具有26℃(±1.5℃)受控温度的房间中。每8小时记录青贮饲料温度。使用接近于仓的温度计测量环境温度。有氧稳定性被定义为在升高高于环境温度超过2℃前青贮饲料保持稳定的小时数。
表3.使用接种剂的甘蔗青贮饲料的有氧稳定性
如表3中所示，在青贮窖打开后，对照青贮饲料的温度稳定了大约21.3小时，而接种了SIL 51和52菌株的青贮饲料分别在26.7和21.3小时后失去温度稳定性。SIL 51和52菌株达到最大温度的时间都较长。因此，SIL 51和SIL 52菌株获得了具有比SIL 34和对照青贮饲料更好的温度稳定的青贮饲料。
接种了植物乳杆菌株SIL 34的产生了乳酸的青贮饲料在24小时后失去了温度稳定性。然而，SIL 34菌株获得了具有较高乙醇含量、较高 酵母计数和更高DM损耗的青贮饲料。SIL 51和SIL 52菌株给青贮饲料提供了更好的特征，如较小的酵母群、较低的乙醇含量和较低的DM损耗。
实施例2：玉米青贮饲料的有氧稳定性
使用布氏乳杆菌NCIMB40788(Mann等的美国专利No.6,326,037)、植物乳杆菌SIL34和希氏乳杆菌菌株SIL 51(2013年6月26日提交的CNCM I-4784)和SIL 52(2013年6月26日提交的CNCM I-4785)作为接种剂，如实施例1中所述的，在微-青贮窖中生产了玉米青贮饲料。将未使用任何接种剂的青贮饲料用作对照。按照实施例1中所述的培养了接种剂。
青贮90天后，打开迷你青贮窖，并且从每个迷你青贮窖中取出大约3kg的样品，并且放入5kg塑料仓中，以评价其有氧稳定性。将数据记录仪插入青贮饲料堆中，至10cm的深度，持续7天。使用位于仓附近的数据记录仪测量了环境温度。关于青贮饲料有氧稳定性的数据显示于表4中。
表4.使用接种剂的玉米青贮饲料的有氧稳定性。
剂量1＝105cfu/g；2＝106cfu/g
如表4中所示，打开青贮窖后，对照青贮饲料的温度稳定了大约42.7小时，而接种了SIL 51和52菌株的青贮饲料分别在73.05和53.35 小时后失去温度稳定性。接种了SIL34的青贮饲料稳定了17.4小时。接种布氏乳杆菌NCIMB 40788的青贮饲料稳定了60.5小时。SIL 51和SIL 52菌株获得了温度稳定性优于接种了SIL 34和对照青贮饲料的青贮饲料。SIL 51和SIL 52菌株还获得了温度稳定性优于NCIMB 40788青贮饲料的青贮饲料。
尽管已经结合其特定的实施方案描述了本发明，但将理解其能够进一步修改并且这种描述旨在涵盖一般来说，按照本发明的原理本发明的任何变化、使用或适应性的改变，并且包括在本发明所属领域内已知的做法或惯例内的本发明公开内容的这种脱离，并且其可适用于本文中之前所阐明的必要特征，并且落入以下所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.青贮饲料接种剂，其包含青贮饲料保存有效量的希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)。
2.根据权利要求1的青贮饲料接种剂，其中所述希氏乳杆菌是具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4784的希氏乳杆菌菌株SIL51和具有2013年6月26日提交的保藏号CNCMI-4785的希氏乳杆菌菌株SIL52中的至少一种，或其遗传等价物。
3.用于处理青贮饲料的方法，包括将青贮饲料接种剂加入所述青贮饲料中，所述青贮饲料接种剂包含青贮饲料保存有效量的希氏乳杆菌，所述青贮饲料接种剂能有效防止或降低有氧酸败。
4.根据权利要求3的方法，其中所述希氏乳杆菌是具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4784的希氏乳杆菌菌株SIL51和具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4785的希氏乳杆菌菌株SIL52中的至少一种，或其遗传等价物。
5.根据权利要求3或4的方法，其中所述青贮饲料是传统青草、玉米、紫花苜蓿、枯萎的青草、谷类作物或甘蔗青贮饲料。
6.根据权利要求3至5任一项的方法，其中所述青贮饲料在捆包、袋、仓、仓状青贮窖或青贮窖中。
7.青贮饲料，其包含青贮饲料保存有效量的希氏乳杆菌。
8.权利要求7的青贮饲料，其中所述希氏乳杆菌是具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4784的希氏乳杆菌菌株SIL51和具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4785的希氏乳杆菌菌株SIL52中的至少一种，或其遗传等价物。
9.具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4784的希氏乳杆菌菌株SIL51的分离菌株，或其遗传等价物。
10.具有2013年6月26日提交的保藏号CNCM I-4785的希氏乳杆菌菌株SIL52的分离菌株，或其遗传等价物。
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