CN111925972A - 一种希氏乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业微生物领域，本发明提供了一种希氏乳杆菌及其应用。本发明提供的希氏乳杆菌RX，拉丁文为Lactobacillus hilgardii，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为：CGMCC No.19559。本发明提供的希氏乳杆菌RX生长速度快、产酸能力强、可降解亚硝态氮，不仅能调节水质，而且可以用于发酵饲料，促进水产养殖的健康发展。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，尤其涉及一种希氏乳杆菌RX及其应用。
背景技术
乳酸菌在生长过程中能分泌乳酸、乙酸等有机酸及细菌素、抗菌肽、生长因子等代谢产物，该类物质具有很好的抑菌、促生效果，作为益生菌广泛使用于养殖业中，水产养殖中常用的乳酸菌有植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等。希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)是乳酸菌的一种，是GRAS(GenerallyRecognized as Safe公认的安全级)菌株，以希氏乳杆菌研制的农用微生物菌剂，广泛应用于各种经济作物种植，有效防治土传病害的发生，解决了重茬、死棵、土壤恶化等问题。此外，希氏乳杆菌也被应用于黄酒酿造和葡萄酒酿造，但鲜见希氏乳杆菌用于水产养殖的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种希氏乳杆菌及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种希氏乳杆菌RX，拉丁文为Lactobacillus hilgardii，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为：CGMCC No.19559。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用于降解氨氮、亚硝态氮的应用。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用于调节水质的应用。
本发明还提供了一种水质调节剂，由所述的希氏乳杆菌RX制备得到。
本发明还提供了所述水质调节剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将希氏乳杆菌RX接种到MRS液体培养基中，在25～32℃下培养20～26h，得到一级菌种；
(2)将一级菌种接种到MRS液体培养基中，在25～32℃下培养20～26h，得到二级菌种；
(3)将二级菌种接种到固体物料中，调整固体物料的含水率为28～32％，在25～30℃下发酵48～72h，得到三级菌种；
(4)在三级菌种中加入红糖和水，置于25～35℃的条件下发酵3～5d，所得发酵产物即为水质调节剂。
优选的，所述固体物料为麸皮、豆粕、玉米粉、番茄匀浆、葡萄糖、磷酸二氢钾按照质量比15～25:15～25:15～25:15～25:3～7:0.5～2混合得到。
优选的，所述三级菌种、红糖和水的质量比为1:2.5～5:90～100。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用作饲料发酵剂的应用。
本发明还提供了一种复合发酵剂，所述复合发酵剂中包括希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母。
优选的，所述希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母的体积比为1:1～3:4～8。
本发明主要为水产养殖提供了一株希氏乳杆菌RX，解决了水产养殖中后期控制亚硝态氮和pH的技术难题。本发明提供的希氏乳杆菌RX还可用于饲料发酵。与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明的希氏乳杆菌繁殖速度快，液体发酵24h有效活菌浓度达到每毫升30亿以上，固体发酵72h每克湿培养基达到500亿以上。
(2)本发明的希氏乳杆菌RX能有效降低水体中亚硝态氮、氨氮含量和pH，改善养殖水质。
(3)本发明的希氏乳杆菌RX与枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母复合用于发酵饲料，活菌含量高，提高饲料的利用率和营养成分的含量。
附图说明
图1为希氏乳杆菌RX基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树；
图2为实验例1中希氏乳杆菌RX对模拟水体中亚硝态氮的去除效果；
图3为实验例2中由希氏乳杆菌RX制备的水质调节剂对氨氮的去除效果；
图4为实验例2中由希氏乳杆菌RX制备的水质调节剂对亚硝态氮去除效果；
图5为实验例2中由希氏乳杆菌RX制备的水质调节剂对水体pH值的影响。
保藏说明
希氏乳杆菌RX，拉丁文为Lactobacillus hilgardii，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为：CGMCC No.19559。
具体实施方式
本发明提供了一种希氏乳杆菌RX，具有生长速率快、产酸能力强、降解亚硝态氮的特点，可用来调节水质、发酵饲料，可促进水产养殖的健康发展。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用于降解氨氮、亚硝态氮的应用。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用于调节水质的应用。
在本发明中，所述希氏乳杆菌RX优选用于调节水产养殖水质。
本发明还提供了一种水质调节剂，由所述的希氏乳杆菌RX制备得到。
在本发明中，所述水质调节剂用于调节水产养殖水质。
本发明还提供了所述水质调节剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将希氏乳杆菌RX接种到MRS液体培养基中，在25～32℃下培养20～26h，得到一级菌种；
(2)将一级菌种接种到MRS液体培养基中，在25～32℃下培养20～26h，得到二级菌种；
(3)将二级菌种接种到固体物料中，调整固体物料的含水率为28～32％，在25～30℃下发酵48～72h，得到三级菌种；
(4)在三级菌种中加入红糖和水，置于25～35℃的条件下发酵3～5d，所得发酵产物即为水质调节剂。
本发明在制备水质调节剂时，先将希氏乳杆菌RX接种到MRS液体培养基中培养，得到一级菌种。
在本发明中，所述希氏乳杆菌RX优选为穿刺培养保存的菌种。
在本发明中，一级菌种培养过程中，所述培养的温度优选为25～32℃，进一步优选为30℃；所述培养的时间优选为20～26h，进一步优选为24h。
制得一级菌种后，将一级菌种接种到MRS液体培养基中培养，得到二级菌种；
在本发明中，所述一级菌种的接种量优选为4～6％(v/v)，再进一步优选为5％(v/v)。
在本发明中，二级菌种培养过程中，所述培养的温度优选为25～32℃，进一步优选为30℃；所述培养的时间优选为20～26h，进一步优选为24h。
在本发明中，所述二级菌种的有效活菌浓度优选为30～35×108CFU/mL，进一步优选为32.8×108CFU/mL，pH优选为3～4，进一步优选为3.62。
在本发明中，所述MRS液体培养基的配方优选为(g/L)：牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，醋酸钠5.0g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，1.0g吐温80，柠檬酸二铵2.0g，蒸馏水补至1L，pH为6.2～6.6，115℃高压灭菌20min。
制得二级菌种后，将二级菌种接种到固体物料中，调整固体物料的含水率为28～32％，在25～30℃下发酵48～72h，得到三级菌种；
在本发明中，所述二级菌种的接种量优选为质量比8～12％，进一步优选为质量比10％。
在本发明中，所述固体物料优选为麸皮、豆粕、玉米粉、番茄匀浆、葡萄糖、磷酸二氢钾；所述固体物料中麸皮、豆粕、玉米粉、番茄匀浆、葡萄糖、磷酸二氢钾优选按照质量比15～25:15～25:15～25:15～25:3～7:0.5～2混合，进一步优选为18～22:18～22:18～22:18～22:4～6:0.8～1.5，再进一步优选为20:20:20:20:5:1。
在本发明中，用水调整固体物料的含水率。
在本发明中，所述含水量优选为28～32％，进一步优选为30％。
在本发明中，所述发酵的温度优选为25～30℃，进一步优选为26～28℃，再进一步优选为27℃；所述发酵的时间优选为48～72h，进一步优选为72h。
在本发明中，所述发酵优选在带呼吸阀塑料袋中进行密封发酵。
发酵好三级菌种后，在三级菌种中加入红糖和水，置于25～35℃的条件下发酵3～5d，所得发酵产物即为水质调节剂。
在本发明中，优选将发酵好的三级菌种置于干净的发酵容器中，再加入红糖和水。
在本发明中，所述三级菌种、红糖和水的质量比优选为1:2.5～5:90～100，进一步优选为1:4～5:95～100，再进一步优选为1:5:100。
在本发明中，所述发酵的温度优选为25～35℃，进一步优选为30℃；所述发酵的时间优选为3～5d，进一步优选为4d。
在本发明中，检测所述水质调节剂的pH低于4.0，即为合格产品，可用于全池泼洒。
本发明还提供了所述希氏乳杆菌RX用作饲料发酵剂的应用。
本发明还提供了一种复合发酵剂，所述复合发酵剂中包括希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母。
在本发明中，所述希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母的体积比优选为1:1～3:4～8，进一步优选为1:2～3:4～6，再进一步优选为1:2:5。
在本发明中，所述枯草芽胞杆菌K8分类为Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为：CGMCC No.19558。
在本发明中，所述热带假丝酵母为市场购买所得。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种希氏乳杆菌RX，分离自天津市北辰区南美白对虾养殖池中。希氏乳杆菌RX的分离鉴定：
1)RX分离、纯化：取南美白对虾养殖池底质活性污泥，用MRS液体培养基富集培养5d，将富集培养液梯度稀释，在含碳酸钙的培养基上涂布，挑选水解圈大的菌落，继代4～5次后得到纯种。
2)RX的鉴定：将RX纯菌株进行形态观察、革兰氏染色观察，提取DNA，将PCR扩增产物纯化后进行测序，所得序列进行Blast分析，并采用MEGA 7.0的Neighbor-Joining建立系统发育树。
结果显示：RX为单细胞，短杆状，细胞直径0.5～0.8×2.0～4.0μm，革兰氏染色阳性，不产芽胞，菌落表面湿润光滑，乳白色，兼性厌氧。RX核酸序列长度为1516bp，在NCBI数据库Blast分析表明，RX与Lactobacillus hilgardii的相似性为100％。从系统发育树(图1)可知，RX与Lactobacillus hilgardii LMG 07934和菌株YIT 0269处在同一分支中，证明RX为希氏乳杆菌。
实验例1
本实验例为希氏乳杆菌RX对亚硝态氮的降解实验，实验步骤如下：
1)菌液的制备：无菌条件下挑取保存的希氏乳杆菌RX单菌落到灭菌的细菌培养基中，30℃静置培养24h；测得菌液中有效活菌数为32.8×108CFU/mL；
2)接种：取菌液1mL接种至含100mL模拟污水的三角瓶中，模拟污水中亚硝态氮含量为10mg/L；
3)处理及指标测定：将三角瓶在30℃静置培养24h后取样，测氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量。结果如图2。从图2可知，希氏乳杆菌RX对模拟污水中亚硝态氮的去除率为96.5％，且不产生硝态氮和氨氮，说明希氏乳杆菌RX能将亚硝态氮彻底从水体中去除。
实施例2
本实施例提供了一种水质调节剂，由希氏乳杆菌RX制备得到。
将穿刺培养保存的希氏乳杆菌RX菌种接种到MRS液体培养基中，30℃静置培养24h，作为一级菌种；将制得的一级菌种按5％(v/v)的接种量接种到MRS液体培养基中，30℃静置培养24h，测得菌液的有效活菌浓度为32.8×108CFU/mL，检测pH降至3.62，作为二级菌种；将二级菌种按10％(质量比)接种量接种到固体物料(麸皮：豆粕：玉米粉：番茄匀浆：葡萄糖：磷酸二氢钾＝20:20:20:20:5:1)中，在固体物料加一定比例的水，使最终的含水率为30％，用带呼吸阀塑料袋装好后，热耦合密封，30℃发酵72h，测得有效活菌浓度为532.8×108CFU/g，作为三级菌种；准备好干净的容量为1吨发酵容器，将三级菌种10kg置于发酵容器中，容器中加红糖50kg，清洁水1吨，置于30℃的环境中密封发酵4d，测定菌液的pH值为3.6，即发酵完成，得到合格的水质调节剂。
实施例3
本实施例提供了一种水质调节剂，由希氏乳杆菌RX制备得到。
将穿刺培养保存的希氏乳杆菌RX菌种接种到MRS液体培养基中，25℃静置培养26h，作为一级菌种；将制得的一级菌种按4％(v/v)的接种量接种到MRS液体培养基中，32℃静置培养26h，测得菌液的有效活菌浓度为30.5×108CFU/mL，检测pH降至3.50，作为二级菌种；将二级菌种按8％(质量比)接种量接种到固体物料(麸皮：豆粕：玉米粉：番茄匀浆：葡萄糖：磷酸二氢钾＝20:20:20:20:6:1)中，在固体物料加一定比例的水，使最终的含水率为28％，用带呼吸阀塑料袋装好后，热耦合密封，25℃发酵60h，测得有效活菌浓度为521.8×108CFU/g，作为三级菌种；准备好干净的容量为1吨发酵容器，将三级菌种10kg置于发酵容器中，容器中加红糖40kg，清洁水1吨，置于35℃的环境中密封发酵3d，测定菌液的pH值为3.3，即发酵完成，得到合格的水质调节剂。
实施例4
本实施例提供了一种水质调节剂，由希氏乳杆菌RX制备得到。
将穿刺培养保存的希氏乳杆菌RX菌种接种到MRS液体培养基中，32℃静置培养20h，作为一级菌种；将制得的一级菌种按6％(v/v)的接种量接种到MRS液体培养基中，25℃静置培养20h，测得菌液的有效活菌浓度为34.2×108CFU/mL，检测pH降至3.81，作为二级菌种；将二级菌种按12％(质量比)接种量接种到固体物料(麸皮：豆粕：玉米粉：番茄匀浆：葡萄糖：磷酸二氢钾＝20:20:20:20:5:2)中，在固体物料加一定比例的水，使最终的含水率为32％，用带呼吸阀塑料袋装好后，热耦合密封，27℃发酵48h，测得有效活菌浓度为505.2×108CFU/g，作为三级菌种；准备好干净的容量为1吨发酵容器，将三级菌种10kg置于发酵容器中，容器中加红糖25kg，清洁水1吨，置于20℃的环境中密封发酵5d，测定菌液的pH值为3.5，即发酵完成，得到合格的水质调节剂。
实验例2
本实验例在西青区选择两个相邻面积为10亩的养殖池进行试验，一个作为对照池，另一个为处理池，每个池塘均有独立的进、排水系统。放苗前蓄水1.5m，选择一代体质健壮的南美白对虾虾苗，虾苗规格为体长1.0cm～1.5cm，在2018年5月9日左右水温稳定在18℃以上投放，投放量为20000尾/亩，投虑食性鱼类白鲢10尾/亩。处理池使用实施例2制备的水质调节剂，选择晴天上午全池泼洒，15天使用1次，每次用量为20kg，每次泼洒过调节剂后开增氧机3.5h；对照池按照常规方法管理。定期取处理池和对照池的水样，检测亚硝态氮、氨氮和pH。
对取样数据进行处理，结果如图3～5。由图3可知，对照池的氨氮变化较小，而处理池的氨氮逐渐降低，到8月25日仅为0.55mg/L，明显低于对照池；由图4可知，使用本发明实施例2制备的水质调节剂的池塘亚硝态氮一直保持在较低的水平，低于0.1mg/L，而对照池亚硝态氮含量逐渐升高，到后期最后一次测定达到0.38mg/L；由图5可知，处理池的pH呈现逐渐降低的趋势，低于对照池；上述结果说明由希氏乳杆菌RX制备的水质调节剂的使用对氨氮、亚硝态氮具有较好的去除作用且能降低水体pH，有效防止了高浓度氨氮、亚硝态氮和高pH对养殖生物的伤害。
实施例5
本实施例提供了希氏乳杆菌RX作为发酵剂用于发酵饲料的小试实验：将分离保存的希氏乳杆菌RX与枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母复合用于发酵饲料。将5mL枯草芽胞杆菌K8与10mL热带假丝酵母、25mL希氏乳杆菌RX加入到118mL水中，混合均匀加入到500g商品料中，搅拌均匀装入呼吸袋中，呼吸袋热耦合封口，30℃发酵48h，然后检测商品料的菌含量和总酚、总蛋白及氨基酸含量。经检测发酵后商品料中总酚、总蛋白及氨基酸含量分别较发酵前提高6.20％、4.91％、6.15％，枯草芽胞杆菌、热带假丝酵母菌和希氏乳杆菌的有效活菌浓度分别达到1.6×106CFU/mL、2.5×108CFU/mL、2.0×109CFU/mL，说明有益菌发酵不仅增加了有益菌含量，还提高了饲料的营养成分。
实施例6
本实施例提供了希氏乳杆菌RX作为发酵剂用于发酵饲料的规模发酵：5L枯草芽胞杆菌K8与10L热带假丝酵母、25L希氏乳杆菌RX加入到118L水中，混合均匀加入到500kg商品料中，搅拌均匀后分装到25kg呼吸袋中，呼吸袋热耦合封口，30℃发酵5d，饲料由暗褐色变成黄褐色，散发出酸香味，经检测总酚、总蛋白及氨基酸含量分别较发酵前提高了6.58％、5.12％、6.63％，枯草芽胞杆菌、热带假丝酵母菌和希氏乳杆菌的有效活菌浓度分别达到2.0×106CFU/mL、4.19×108CFU/mL、3.3×109CFU/mL。投喂后具有明显的诱食效果。
由以上实施例可知，本发明提供的希氏乳杆菌RX生长速率快、产酸能力强，30℃培养24h的菌液中有效活菌浓度能够达到32.8×108CFU/mL，pH降至3.62；本发明提供的希氏乳杆菌RX能够降解亚硝态氮，且不积累硝态氮和氨氮，能明显降低水体中pH、氨氮和亚硝态氮的含量；本发明提供的希氏乳杆菌RX与酵母菌、芽孢杆菌复合可用于发酵饲料，活菌含量高，提高饲料的营养价值和利用率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种希氏乳杆菌RX，拉丁文为Lactobacillus hilgardii，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为：CGMCC No.19559。
2.权利要求1所述的希氏乳杆菌RX用于降解氨氮、亚硝态氮的应用。
3.权利要求1所述的希氏乳杆菌RX用于调节水质的应用。
4.一种水质调节剂，其特征在于，由权利要求1所述的希氏乳杆菌RX制备得到。
5.权利要求4所述的水质调节剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将希氏乳杆菌RX接种到MRS液体培养基中，在25～32℃下培养20～26h，得到一级菌种；
(2)将一级菌种接种到MRS液体培养基中，在25～32℃下培养20～26h，得到二级菌种；
(3)将二级菌种接种到固体物料中，调整固体物料的含水率为28～32％，在25～30℃下发酵48～72h，得到三级菌种；
(4)在三级菌种中加入红糖和水，置于25～35℃的条件下发酵3～5d，所得发酵产物即为水质调节剂。
6.如权利要求5所述的水质调节剂的制备方法，其特征在于，所述固体物料为麸皮、豆粕、玉米粉、番茄匀浆、葡萄糖、磷酸二氢钾按照质量比15～25:15～25:15～25:15～25:3～7:0.5～2混合得到。
7.如权利要求5所述的水质调节剂的制备方法，其特征在于，所述三级菌种、红糖和水的质量比为1:2.5～5:90～100。
8.权利要求1所述的希氏乳杆菌RX用作饲料发酵剂的应用。
9.一种复合发酵剂，其特征在于，所述复合发酵剂中包括希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母。
10.如权利要求9所述的复合发酵剂，其特征在于，所述希氏乳杆菌RX、枯草芽胞杆菌K8和热带假丝酵母的体积比为1:1～3:4～8。
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