CN114908018B - 一种短乳杆菌及其在青贮中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24643，保藏日期为2022年04月06日，所述短乳杆菌的16s rDNA如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的短乳杆菌生长速率快，产酸能力强，能加快饲草青贮pH值降低的速度，使乳酸菌成为主导菌群，从而使发酵更快进入稳态，减少氨态氮的产生，增加有机酸含量，保存更多的营养物质，提高青贮品质。

Description

一种短乳杆菌及其在青贮中的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种短乳杆菌及其在青贮中的应用。
背景技术
青贮是指把青绿植物压实封闭起来，使贮存的青饲料与外部空气隔绝，造成缺氧环境使植物上附着的乳酸菌厌氧发酵产生有机酸，并降低pH来长期保存饲草的方法，这种方法调制的饲料不仅青绿多汁、营养丰富，同时适口性佳，家畜喜食，是家畜重要的优质饲料来源之一。
高营养价值的原料是提高青贮饲料价值的必要条件，玉米作为主要的青贮原料，具有植株高大、营养价值高、适口性好等优点，其富含可发酵的水溶性碳水化合物，较容易成功青贮，但这种青贮饲料含有的粗蛋白质较低，不能满足家畜对蛋白质的需要。
大豆粗蛋白含量高，营养丰富，但由于缓冲能大和水溶性碳水化合物含量低，单独青贮时不能满足乳酸菌对发酵底物的需求，青贮初期pH值下降较慢，不能成功抑制有害微生物的生长繁殖，易导致制得的青贮饲料发酵失败，营养物质损失大，适口性差，因此属于不易青贮成功的原料。
乳酸菌添加剂可加快青贮前期的乳酸积累，更快地降低pH，常作青贮饲料添加剂以保证快速有效的发酵，并减少饲草中的营养成分损失等，然而市面上的商业乳酸菌在极端环境下不能发挥很好的效果，难以满足气候条件极端地方的青贮需求。
发明内容
在以上背景下，本发明提供一种短乳杆菌，所述短乳杆菌生长速率快，产酸能力强；发酵类型为异型发酵，能加快饲草青贮pH值降低的速度，使乳酸菌成为主导菌群，从而使发酵更快进入稳态，减少氨态氮的产生以及增加青贮中有机酸含量，保存更多的营养物质，提高青贮品质。同时还能产生乙酸，抑制好氧微生物，提高有氧稳定性，延长开窖饲喂家畜时饲料保质期。
本发明的一个目的是提供一种短乳杆菌，本发明的另一个目的是提供一种所述短乳杆菌在制备青贮饲料添加剂或制备青贮饲料中的用途。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
第一方面，本发明提供一种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24643，保藏日期为2022年04月06日。
所述短乳杆菌的16s rDNA如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供一种青贮饲料添加剂，所述青贮饲料添加剂中活性成分为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。
优选的，所述添加剂中还包括本领域技术人员知晓的辅料，所述添加剂可为混悬剂、分散剂、溶液剂。
第三方面，本发明提供一种青贮饲料，所述青贮饲料中含有短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。
优选的，所述青贮饲料中短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的含量为(1.0-5.0)×106CFU/g青贮原料。
第四方面，本发明提供一种短乳杆菌的应用，包括如下任意一种方式的应用：
(a1)制备青贮饲料添加剂；
(a2)制备青贮饲料。
所述青贮饲料添加剂在制备所述青贮饲料中的应用也属于本发明的保护范围。
第五方面，本发明提供一种制备青贮饲料的方法，所述方法包括：将青贮原料与短乳杆菌混合，进行固体厌氧发酵，得到的发酵产物即青贮饲料。
所述青贮原料为玉米、大豆或者玉米-大豆混合物，优选的，所述青贮原料为玉米-大豆混合物，玉米与大豆质量比为7:3。
所述青贮饲料中短乳杆菌的添加量为(1.0-5.0)×106CFU/g青贮原料。
保藏说明
菌种名称：短乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus brevis
保藏编号：CGMCC No.24643
附图说明
图1本发明提供的短乳杆菌的光学显微镜图
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1短乳杆菌的分离与筛选过程
(1)取采自四川省阿坝藏族羌族自治州瓦切镇玉米青贮样品(2019年6月份采集)，加入180ml无菌生理盐水稀释成10-1，10-3和10-5三个稀释度的样品稀释液；稀释后吸取涂布至MRS固体培养基培养，挑出单菌落继续培养后，连续传代培养不少于2次，得到纯化的菌落；
(2)将步骤(1)得到的所述纯化的菌落在乳酸菌固体培养基上恒温厌氧条件下培养后，通过革兰氏染色和过氧化氢酶接触反应，进行乳酸菌的鉴定；
(3)将步骤(2)得到的所述分离纯化的乳酸菌进行菌种活化后，接种到MRS液体培养基中于15℃下培养，得到菌液，并保存所有生长出肉眼可见的白色沉淀物的菌液，将上述菌液加入含灭菌甘油的液体营养培养基中，并储存在-80℃，得到分离纯化的乳酸菌共24株；
4)将上述得到的分离纯化的乳酸菌进行菌种活化，以3％的接种量接种到10mlMRS液体培养基中，以温度10-15℃，湿度85％-98％培养72h，得到菌液，测定所述菌液pH与OD值。结果如下表所示，根据测定结果筛选得到pH＝4.01，OD值＝1.533的菌液，即菌株编号为WQwh的菌株为初步筛选后的菌株。
表1菌液pH与OD值
菌株编号 OD值 pH 菌株编号 OD值 pH
WQ1 1.381 4.92 WQ13 1.246 5.35
WQ2 1.249 4.83 WQ14 1.494 4.46
WQ3 1.421 4.36 WQ15 1.399 4.99
WQ4 1.498 4.12 WQ16 1.218 4.92
WQ5 1.381 4.98 WQ17 1.413 4.15
WQ6 1.394 5.03 WQ18 0.233 5.04
WQ7 0.978 5.49 WQwh 1.533 4.01
WQ8 1.029 5.38 WQ20 1.254 4.37
WQ9 1.265 5.29 WQ21 0.503 5.25
WQ10 1.102 5.26 WQ22 1.438 4.21
WQ11 1.402 4.78 WQ23 1.460 4.17
WQ12 1.312 5.3 WQ24 1.445 4.26
将初步筛选后的菌株WQwh在温度37℃条件下厌氧培养48h后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物。
PCR扩增得到扩增产物过程具体为：以上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.2)，下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.3)为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次，再72℃延长5min。
菌株WQwh的16s rDNA如SEQ ID NO.1所示，对16S rDNA序列分析发现，与其他短乳杆菌(Lactobacillus brevis)16S rDNA分析序列的相似性达到100％和99％，因此判定菌株WQwh为短乳杆菌。
菌株WQwh的16s rDNA序列具体为：
GCTGACTCCCGAAGGTTATCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTAGCCTCACGACTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGTCTTATCTCTAAGATTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACTAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAACCCTTGAACAGTTACTCTCAAAGGTGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCATTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATCGTCTTGGTGGGCCTTTACCTCACCAACTAACTAATACGCCGCGGGATCATCCAGAAGTGATAGCCGAAGCCACCTTTCAAACAAAATCCATGCGGATTTTGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTGCTTCTGGGCAGATTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGCTTCATTGTGAAATCAGTGCAAGCACGTCATTCAACGGAAGCTCG
如无特别说明，本发明涉及的短乳杆菌为实施例1筛选得到的菌株WQwh。
实施例2短乳杆菌生理生化特征测定
生理生化测定：分析实施例1筛选的短乳杆菌生理生化特征，结果见表2。
耐盐试验：将实施例1筛选的短乳杆菌以含有NaCl浓度3.0％(w/v)和6.5％(w/v)的MRS液体培养基中，30℃下培养2天后，测定其耐盐性，结果见表2。
不同温度试验：将实施例1筛选得到的短乳杆菌以3％的接种量接种到MRS液体培养基中，在表2的温度条件下进行培养，观察其生长状况，结果见表2。
耐酸试验：将实施例1筛选的短乳杆菌表在为表2pH值条件的MRS液体培养基中30℃下培养7天后，测定其耐酸性，结果见表2。
表2短乳杆菌生理生化、温度、耐盐、耐酸试验结果
Figure BDA0003673295700000061
Figure BDA0003673295700000071
注：+表示生长Positive；－表示不生长Negative；W表示微弱生长Weaklypositive.
由表2可知，本发明提供的短乳杆菌耐盐性和耐酸性好，对不同温度的适应性较好。
糖发酵试验：通过糖发酵试验分析实施例1筛选的短乳杆菌糖发酵特征，结果见表3。
表3糖发酵试验结果
Figure BDA0003673295700000072
Figure BDA0003673295700000081
注：+表示生长Positive；－表示不生长Negative；W表示微弱生长Weaklypositive.
由表3可知，本发明提供的短乳杆菌利用碳源范围较广，可较好的利用不同青贮原料中不同类型的碳源进行发酵。
实施例3青贮饲料的制备及分析
玉米青贮样的制备：取四川农业大学崇州基地生长的玉米(处于2/3乳线期)，留茬高度为15cm，切成约20mm获得青贮原料。取300g青贮原料装进塑料袋(25×35cm；Aodeju,China)，按照短乳杆菌(1.0-5.0)×106CFU/g(Colony forming unit/g)青贮原料添加菌液，抽真空封口，置于15℃发酵，青贮60d后开封，得到玉米青贮样。
大豆青贮样的制备：取四川农业大学崇州基地生长的大豆(处于鼓粒期)，留茬高度为15cm，切成约20mm长度得到青贮原料。取300g青贮原料装进塑料袋(25×35cm；Aodeju,China)，按照短乳杆菌(1.0-5.0)×106CFU/g(Colony forming unit/g)青贮原料添加菌液，抽真空封口，置于15℃发酵，青贮60d后开封，得到大豆青贮样。
玉米-大豆混合青贮样的制备：取四川农业大学崇州基地生长的玉米和大豆(按照质量比为7:3)，切成约20mm长度得到青贮原料。取300g青贮原料装进塑料袋(25×35cm；Aodeju,China)，按照短乳杆菌(1.0-5.0)×106CFU/g(Colony forming unit/g)青贮原料添加菌液，抽真空封口，置于15℃发酵，青贮60d后开封，得到玉米-大豆混合青贮样。
以上青贮样处理组均设置3个平行操作，用于后续结果分析，并且每个处理组设置空白对照(CK，不添加短乳杆菌)。
1、感官评定：
青贮样根据德国牧业协会(DLG)1899年编订的感官青贮评分标准及等级评定对青贮饲料的气味、结构和色泽分别进行感官评分。
表4青贮饲料感官评定标准(DLG)
Figure BDA0003673295700000091
本发明制备的青贮样感官评定结果如下表所示：
表5感官评定结果
Figure BDA0003673295700000092
Figure BDA0003673295700000101
由表5可知，与CK组相比，本发明提供的青贮样臭味弱，芳香性更佳，茎叶结构保持更佳，说明在青贮原料中添加适宜量的本发明提供的短乳杆菌有利于提升青贮饲料的感官评价。
2、发酵品质分析
分别取20g上述青贮样(即玉米单贮、大豆单贮、玉米-大豆混贮)加入180mL去离子水放入小型搅拌机中搅拌1min，过8层滤布，用苯酚-次氯酸纳比色法测定滤液pH值，用苯酚-次氯酸纳比色法测定滤液氨态氮(NH3-N)。
分别取20g上述青贮样(即玉米单贮、大豆单贮、玉米-大豆混贮)与180ml灭菌蒸馏水混合震荡，用四层纱布过滤，采用高效液相色谱法测定有机酸含量。
发酵品质分析见表6。
表6发酵品质分析
Figure BDA0003673295700000102
Figure BDA0003673295700000111
注：同一行数据后的不同小写字母表示差异在5％水平上显著。
由表6可知，本发明提供的短乳杆菌降低了青贮的pH和NH3-N/％TN，并提高乳酸含量，在大豆单贮和玉豆混贮中效果更显著(P<0.05)。同时，所有添加了短乳杆菌的青贮中酵母菌和大肠杆菌数量及丁酸含量减少，乳酸菌数量和有氧稳定性增加(P<0.05)。可见，本发明提供的短乳杆菌使得乳酸菌成为主导菌群，提高了发酵品质，而且可以抑制不良微生物的繁殖，并提高青贮饲料开袋饲喂后的保质期。
3、化学成分分析
青贮样：玉米单贮、大豆单贮、玉米-大豆混贮。
取青贮样置于鼓风干燥箱中，105℃杀青0.5h，随后在65℃烘72h左右直至恒重，烘干样品用小型植物样粉碎机粉碎后过40目筛。采用常规烘干法测定干物质(Dry Matter,DM)，采用FOSS 8400型全自动凯氏定氮仪蒸馏测定粗蛋白(Crude Protein,CP)，采用范氏洗涤纤维法测定中性洗涤纤维(Neutral Detergent Fiber,NDF)与酸性洗涤纤维(AcidDetergent Fiber,ADF)，采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物(Water SolubleCarbohydrates,WSC)；
其化学成分分析结果见表7。
表7青贮化学成分
Figure BDA0003673295700000112
Figure BDA0003673295700000121
注：同一行数据后的不同小写字母表示差异在5％水平上显著。
由表7可知，本发明提供的短乳杆菌作为牧草青贮添加剂与不添加任何添加剂的对照组相比，能提高玉米大豆青贮饲料干物质含量、粗蛋白含量、降低牧草青贮饲料酸性洗涤纤维含量(P<0.05)，提升牧草青贮饲料的质量。对玉米单贮、大豆单贮和玉豆混贮处理组平行对比可以发现，向青贮原料中加入本发明提供的短乳杆菌对玉豆混贮饲料的质量提升更显著。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种短乳杆菌及其在青贮中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgactccc gaaggttatc tcaccggctt tgggtgttac aaactctcat ggtgtgacgg 60
gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc 120
gattccaact tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg aactgagaac ggctttaaga 180
gattagctta gcctcacgac ttcgcgactc gttgtaccgt ccattgtagc acgtgtgtag 240
cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc 300
ggcagtctca ccagagtgcc caactgaatg ctggcaactg ataataaggg ttgcgctcgt 360
tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca 420
ttctgtcccc gaagggaacg tcttatctct aagattggca gaagatgtca agacctggta 480
aggttcttcg cgtagcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540
aattcctttg agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag 600
ctgcagcact gaagggcgga aaccctccaa cacttagcac tcatcgttta cggcatggac 660
taccagggta tctaatcctg ttcgctaccc atgctttcga gcctcagcgt cagttacaga 720
ctagacagcc gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc tacgcattcc accgctacac 780
atggagttcc actgtcctct tctgcactca agtctcccag tttccgatgc acttctccgg 840
ttaagccgaa ggctttcaca tcagacttaa aaaaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat 900
aaatccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt 960
ggctttctgg ttaaataccg tcaacccttg aacagttact ctcaaaggtg ttcttcttta 1020
acaacagagt tttacgagcc gaaacccttc ttcactcacg cggcattgct ccatcagact 1080
ttcgtccatt gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtttggg ccgtgtctca 1140
gtcccaatgt ggccgattac cctctcaggt cggctacgta tcatcgtctt ggtgggcctt 1200
tacctcacca actaactaat acgccgcggg atcatccaga agtgatagcc gaagccacct 1260
ttcaaacaaa atccatgcgg attttgttgt tatacggtat tagcacctgt ttccaagtgt 1320
tatcccctgc ttctgggcag atttcccacg tgttactcac cagttcgcca ctcgcttcat 1380
tgtgaaatca gtgcaagcac gtcattcaac ggaagctcg 1419

Claims (9)

1.一种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，其特征在于，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24643，保藏日期为2022年04月06日。
2.一种青贮饲料添加剂，所述青贮饲料添加剂中活性成分为权利要求1所述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。
3.根据权利要求2所述的青贮饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂中还包括辅料，所述添加剂为混悬剂、分散剂、溶液剂。
4.一种青贮饲料，其特征在于，所述青贮饲料中含有权利要求1所述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。
5.根据权利要求4所述的青贮饲料，其特征在于，所述青贮饲料中短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的含量为(1.0-5.0)×106CFU/g青贮原料。
6.一种权利要求1所述的短乳杆菌的应用，包括如下任意一种中的应用：
(a1)制备青贮饲料添加剂；
(a2)制备青贮饲料。
7.一种制备青贮饲料的方法，所述方法包括：将青贮原料与权利要求1所述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)混合，进行固体厌氧发酵，得到的发酵产物即青贮饲料；所述青贮原料为玉米、大豆或者玉米-大豆混合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述青贮原料为玉米-大豆混合物，玉米与大豆质量比为7:3。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述青贮饲料中短乳杆菌的添加量为(1.0-5.0)×106CFU/g青贮原料。
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