CN109370932A - 一株产阿魏酸酯酶的短乳杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株从青贮饲料中分离得到的可以产阿魏酸酯酶的短乳杆菌，保藏号为CGMCC12957，具有产阿魏酸酯酶的能力，最适pH 6.4，最适温度37℃，在pH 5‑7，温度25‑50℃条件下可以保持较好的稳定性。本发明菌株可应用于青贮饲料添加剂的制备以及阿魏酸的制备。

Description

一株产阿魏酸酯酶的短乳杆菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及乳酸菌开发与应用领域，特别是一株产阿魏酸酯酶的短乳杆菌。
背景技术
阿魏酸(ferulic acid，C10H10O4)，化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是在植物界中存在最广泛的轻基肉桂酸成分之一，因其具有去除活氧自由基、吸收紫外线、抑制色素生成及抗炎等作用，被广泛的应用于医药、化妆品及化工等行业。另外，在植物的细胞壁中，阿魏酸单体和多种二聚体与半纤维素、木质素通过酯键交联，加强了三维的多糖网状结构，并且限制了纤维素的利用和微生物对于植物纤维类材料的降解。
阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73，feruloyl esterase，简称FAE)又称肉桂酸水解酶或肉桂酸酯酶，是羧酸酯酶(EC3.1.1)的一个亚类，能水解多糖阿魏酸酯、低聚糖阿魏酸酯和阿魏酸酯中的酯键，产生阿魏酸(FA)。它能切断细胞壁中多糖-木质素、多糖-多糖间的连接的共价键，有利于细胞壁的降解和木质素的释放，在食品、造纸、医药及饲料工业具有广阔的应用前景。
FAE能够广泛应用于食品、医药、养殖业、燃料及纸浆行业中，它的作用主要包括：(1)释放FA。FA具有多种生理活性，能够作为抗氧化剂，还能够用作香料前体，通过生物和化学途径转化合成香兰素。(2)生产燃料乙醇。为了限制碳排放，对绿色生物工艺及可持续产品的需要越来越明显，越来越多的生物燃料替代石油，微生物酶引导着乙醇生产的领域，从木质纤维原料中生产燃料乙醇已经广泛研究了数十年。(3)制浆造纸。利用FAE协同木质素水解酶、纤维素水解酶处理麦秆等造纸原料，可破坏半纤维素等木质纤维的结构，减少化学试剂的使用，减少水污染及处理成本。(4)生物转化。羟基肉桂酸如FA、香豆酸、咖啡酸和芥子酸等都具有良好的抗氧化性，在工业上有着广泛的应用价值。(5)动物养殖。在饲料中添加FAE，可以协同木聚糖酶等半纤维降解体系共同作用于细胞壁，促进细胞壁的降解，降低非淀粉多糖的食糜粘性，同时释放出细胞内容物，促进养分的吸收利用。
乳酸菌生物制剂已广泛应用于青贮饲料生产中，并对提高青贮饲料发酵品，改善青贮饲料适口性，提高家畜采食量具有重要作用。由于大多数商业乳酸菌缺乏降解纤维素的酶，所以新型的产纤维分解酶乳酸菌的研究和利用已成为目前国内外研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株具有产阿魏酸酯酶能力的短乳杆菌，以期在青贮饲料发酵生产中得到进一步开发利用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种产阿魏酸酯酶的短乳杆菌，保藏编号为CGMCC12957。
所述的产阿魏酸酯酶的短乳杆菌FE3其阿魏酸酯酶酶活性的最适pH为6.4，最适酶活性温度为37℃。
所述的产阿魏酸酯酶的短乳杆菌可用于降解纤维和制备阿魏酸。
所述产阿魏酸酯酶的短乳杆菌，按下述工艺步骤制备获得。
(1)出发菌株：以本实验室从青贮饲料中分离获得并且保藏的乳酸菌菌株，主要包括植物乳杆菌，短乳杆菌，副干酪乳杆菌，乳酸片球菌，戊糖片球菌等。
(2)筛选试验：将上述乳酸菌接种到以阿魏酸乙酯为唯一碳源的平板培养基，适宜条件下培养，产生透明菌圈的可初步判定为产阿魏酸酯酶。
(3)液体培养产酶：将(2)中初筛得到的菌株接种到含阿魏酸甲酯的培养基中进行发酵产酶。
(4)将(3)中培养后的酶液进行酶活测定，选出1株产酶活性高的菌株短乳杆菌FE3(拉丁文命名为Lactobacillus brevis)。
(5)对产酶活性高的FE3菌株的生理生化特性和酶学性质进行研究。
(6)将菌株FE2的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得Genbank数据库菌株FE3的序列号：MF 093221。
本发明所述具有产阿魏酸酯酶能力的植物乳杆菌已于2016年9月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC12957。
本发明所获得的短乳杆菌FE3，可应用于发酵工业生产当中，特别是应用于青贮饲料的发酵中。在青贮饲料生产中，使用产阿魏酸酯酶乳酸菌不仅可以提高青贮饲料发酵品质，同时又能降解青贮饲料中的纤维，提高动物对青贮饲料的消化率。因此，筛选具有产阿魏酸酯酶的乳酸菌菌株具有重要的开发和应用价值。
附图说明
图1为本发明短乳杆菌FE3粗酶液的最适反应pH。
图2为本发明短乳杆菌FE3粗酶液的pH稳定性。
图3为本发明短乳杆菌FE3粗酶液的最适反应温度。
图4为本发明短乳杆菌FE3粗酶液的温度稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明。
培养基配方。
乳酸细菌培养基(MRS)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 6.2～6.4，加入琼脂，121℃灭菌15min，趁热倒平板。
实施例1。
产阿魏酸酯酶菌株的筛选实验。
1)将乳酸菌活化2-3次，在MRS固体培养基上进行划线，37℃条件下培养2天。
2)挑取单菌落于不加葡萄糖，以阿魏酸乙酯为唯一碳源的MRS固体培养基上，每个板子加入0.3ml的阿魏酸乙酯溶液(将阿魏酸乙酯溶于二甲基甲酰胺，制成质量体积比为10％的溶液)，30℃下培养72h，观察平板上是否出现透明菌圈。
3)产生透明菌圈的可初步判定为产阿魏酸酯酶。供试的一株短乳杆菌FE3产生透明圈。
实施例2。
液体培养产酶及酶活测定。
1)初筛后的菌株短乳杆菌FE3在MRS液体培养基中，37℃，过夜培养，3000rpm离心5min，收集菌体。
2)用0.85％生理盐水洗涤菌体3次，重悬于去离子水中。
3)取菌悬液(定菌数1×109cfu/ml)接种到含阿魏酸甲酯的培养基中(100ml培养基中加5ml阿魏酸甲酯(1％W/V二甲基甲酰胺)，菌种接种量为2％(V/V)，进行发酵。发酵条件为37℃，48h，振荡频率为120rpm。
4)吸取9ml发酵液于10ml离心管中，10000rpm离心10min，上清液即为阿魏酸酯酶粗酶液，用于酶活测定。
5)取2ml粗酶液，50℃水浴10min。
6)加入2ml pH为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制成的0.5mg/ml阿魏酸甲酯溶液，50℃水浴20min。
7)沸水浴10min终止反应。
8)10000rpm离心20min，得到酶解液。
9)高效液相测酶活：色谱条件：C18色谱柱，Synergi 4um Hydro-RP 80；250×4.6mm 4micro 393548-11；流动相：A甲醇—B 1％冰乙酸(28:72)；柱温40℃，检测波长320nm；进样量10μl，流速0.6ml/min。
10)酶活定义为：在50℃反应条件下，每分钟降解阿魏酸甲酯，生成1μmol阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。
表1本发明乳酸菌阿魏酸酯酶酶活
实施例3。
产FAE的短乳杆菌理化性质研究。
1)糖发酵、精氨酸产氨、硝酸盐还原和葡萄糖产气：采用细菌微量生化反应管；菌株活化2-3次，划线培养2-3d，用接种环挑取单菌落于生化管中，用灭菌的甘油封口，37℃培养2-3d观察其变色情况。
表2本发明乳酸菌对糖源的利用能力
注：“+”表示利用该糖；“—”表示不利用该糖。
2)不同温度条件下菌株生长特性：乳酸菌活化2-3次后，37℃过夜培养，定菌数为1×108cfu/ml，以3％的接种量接种到灭菌的MRS液体培养基中，摇匀，封口膜封口，各设2个重复。分别放在温度为4、10、15、25、35、45、50℃的恒温培养箱中培养，其中4、10、15℃培养7d，25、35℃培养2d，45、50℃培养4d。分光光度计600nm处测定其OD值。
表3本发明乳酸菌不同温度下生长特性
注：++,+,w,－分别表示生长良好(OD﹥0.5),生长(0.1<OD<0.5)微量生长(0.05﹤OD﹤0.1),不生长(OD<0.05)。
3)不同pH条件下菌株生长特性：乳酸菌活化2-3次后，37℃过夜培养，定菌数为1×108cfu/ml，以3％的接种量接种到灭菌的MRS液体培养基中，摇匀，封口膜封口，各设2个重复。MRS液体培养基用盐酸或氢氧化钠调pH值至所需酸碱度，即pH值分别为：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0。于37℃恒温培养箱中培养7d，测其OD值，观察菌株的耐酸碱能力。
表4本发明乳酸菌不同pH下生长特性
注：++,+,w,－分别表示生长良好(OD﹥0.5),生长(0.1<OD<0.5)微量生长(0.05﹤OD﹤0.1),不生长(OD<0.05)。
4)菌株的耐盐特性：乳酸菌活化2-3次后，37℃过夜培养，定菌数为1×108cfu/ml，以3％的接种量接种到灭菌的MRS液体培养基中，摇匀，封口膜封口，各设2个重复。MRS液体培养基加入NaCl，使其盐浓度分别为：3％、4％、6.5％、8％、12％、18％。于37℃恒温培养箱中培养7d，测其OD值，观察菌株的耐盐能力。
表5本发明乳酸菌耐盐特性
注：++,+,w,－分别表示生长良好(OD﹥0.5),生长(0.1<OD<0.5)微量生长(0.05﹤OD﹤0.1),不生长(OD<0.05)。
实施例4。
短乳杆菌阿魏酸酯酶粗酶液的酶学性质分析。
1)最适pH及pH稳定性(如图1、图2所示)。
(1)最适pH值的测定：将加入阿魏酸甲酯的0.5mL酶液分别与0.5mL的不同pH缓冲液混合，在50℃下放置0.5h，测定残留酶活，以所测的最高酶活为100％，计算相对酶活。
(2)pH值稳定性的测定：将酶液置于pH 3.6－8的缓冲液中，在4℃放置0、0.5、1、2、3、4、6、8、20h，测定残留酶活(MFA为底物，50℃)，以各pH值的初始酶活为100％，计算相对酶活。
缓冲液是pH3.6、pH4.0、pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.0、pH5.6、pH6.0、pH6.4、pH7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。
用MFA作为底物测定短乳杆菌FE3粗酶液的最适pH及pH稳定性，发现阿魏酸酯酶在pH5.0～7.0时具有相对较高的活性且稳定性较高，如图1、图2所示。
通过比较发现，FE3粗酶液的最适pH为6.4如图1所示。
2)最适温度及温度稳定性(如图3、图4所示)。
(1)最适反应温度的测定：将加入阿魏酸甲酯的酶液0.5mL与0.5mL的pH 6.4的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液混合，在25－65℃(25、30、37、40、45、50、55、65℃)保温0.5h后，测定残留酶活。以所测的最高酶活为100％，计算相对酶活。
(2)温度稳定性的测定：在pH 6.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液中，分别将酶液置于25－65℃保温0、0.5、1、2、3、4、6、8、20h，测定残留酶活，以初始酶活为100％，计算相对酶活。
分别在25～65℃测定粗酶液的活力，结果见图2。
结果显示，菌株FE3FAE粗酶液最适反应温度为37℃，在30～40℃的范围内酶活性较高，如图3所示。
在稳定性方面，如图4所示，温度为25～50℃时，该酶比较稳定，处理2h后，剩余酶活仍能达到90％左右，随着时间的延长，剩余酶活下降较快；当温度达65℃时，保温1h，剩余酶活力仅为15％。
SEQUENCE LISTING
<110> 兰州大学
<120> 一株产阿魏酸酯酶的短乳杆菌
<130> 3
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1311
<212> DNA
<213> 短乳杆菌（Lactobacillus brevis）
<400> 1
ggcgaactgg tgagtaacac gtggggaatc tgcccagaag caggggataa cacttggaaa 60
caggtgctaa taccgtataa caacaaaatc cgcatggatt ttgtttgaaa ggtggcttcg 120
gctatcactt ctggatgatc ccgcggcgta ttagttagtt ggtgaggtaa aggcccacca 180
agacgatgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc 240
ccaaactcat acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga 300
gcaatgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac 360
acctttgaga gtaactgttc aagggttgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta 420
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa 480
agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggcttaac cggagaagtg 540
catcggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg 600
gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctagt ctgtaactga 660
cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt 720
aaacgatgag tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta 780
agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc 840
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt 900
gacatcttct gccaatctta gagataagac gttcccttcg gggacagaat gacaggtggt 960
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1020
ccttattatc agttgccagc attcagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc 1080
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1140
ctacaatgga cggtacaacg agttgcgaag tcgtgaggct aagctaatct cttaaagccg 1200
ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gttggaatcg ctagtaatcg 1260
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc c 1311

Claims (4)

1.一种产阿魏酸酯酶的短乳杆菌，保藏编号为CGMCC12957。
2.一种如权利要求1所述的产阿魏酸酯酶的短乳杆菌FE3其阿魏酸酯酶酶活性的最适pH为6.4，最适酶活性温度为37 °C。
3.一种如权利要求1所述的产阿魏酸酯酶的短乳杆菌在降解纤维和制备阿魏酸中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌FE1，其特征在于所述短乳杆菌FE3按下述工艺步骤制备获得：
（1）出发菌株：以本实验室从青贮饲料中分离获得并且保藏的乳酸菌菌株，主要包括植物乳杆菌，短乳杆菌，副干酪乳杆菌，乳酸片球菌，戊糖片球菌等；
（2）筛选试验：将上述乳酸菌接种到以阿魏酸乙酯为唯一碳源的平板培养基，适宜条件下培养，产生透明菌圈的可初步判定为产阿魏酸酯酶；
（3）液体培养产酶：将（2）中初筛得到的菌株接种到含阿魏酸甲酯的培养基中进行发酵产酶；
（4）将（3）中培养后的酶液进行酶活测定，选出1株产酶活性高的菌株短乳杆菌FE3（拉丁文命名为Lactobacillus brevis）；
（5）对产酶活性高的FE3菌株的生理生化特性和酶学性质进行研究；
（6）将菌株FE2的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得Genbank数据库菌株FE3的序列号：MF 093221。
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