CN104560816A - 一种具有生物质水解酶活性的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有生物质水解酶活性的地衣芽孢杆菌菌株UTM108，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年9月18日，保藏编号为CGMCC？No.9679。本发明菌株UTM108可以利用城市污水厂的下水污泥、生活垃圾、餐厨垃圾、动物尸体、畜禽粪便、农作物秸杆和某些行业产生的有机固体废弃物如中药药渣、非危废菌渣、食品工业废弃物等进行高温发酵降解，以治理有机固废物料的污染，并且通过UTM108菌株堆肥发酵还可以制备环保型生物肥料，性能优良，具有较好的经济效益和社会效益。

Description

一种具有生物质水解酶活性的地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及有机固体废弃物处理领域，具体地说，涉及一种具有生物质水解酶活性的地衣芽孢杆菌及其应用。

背景技术

目前我国城乡每年产生大量有机固体废弃物，仅2005年统计农作物秸秆就达到8亿吨，而每年城市生活污水处理所产生的污泥达到8000万吨，并以每年5％的速度增长。同时在工业生产过程中产生的有机固体废弃物也达到惊人的数据，如中药提取加工后的大量废弃药材与药渣、食品加工行业的废弃物。这些大量的有机固体废弃物未能得到有效利用这不仅浪费了宝贵资源，而且加剧了环境污染。

国内外有机固体废弃物处理实践表明，高温好氧堆肥是实现有机固体废弃物资源无害化再利用化的有效途径之一。传统的堆肥法存在发酵时间长、腐殖质转化不完全等问题。物料中存在难以降解的有机物是导致上述问题的主要原因。而堆肥高温期作为有机大分子分解的主要阶段，也是保障堆肥无害化的重要阶段，在堆肥中接种高温菌，可增加高温期微生物的数量，促进难降解的有机物的快速转化，从而缩短发酵时间。与常温菌相比，高温菌具有更快的代谢能力和有机物降解速率，对于高温环境下有机物的生物转化具有重要的作用。在有机固体废弃物中半纤维素仅次于纤维素。主要的半纤维素聚合物是木聚糖，其在植物细胞壁中广泛存在。木聚糖主链的生物降解依赖于两类酶：内切木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切木聚糖酶将木聚糖主链切割成较小的寡糖，其能被β-木糖苷酶进一步降解成木糖。木聚糖降解中牵涉的其它酶包括例如乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有生物质水解酶活性的地衣芽孢杆菌及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种具有生物质水解酶活性的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株UTM108，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2014年9月18日，保藏编号为CGMCC No.9679。

所述菌株UTM108采自云南腾冲温泉的底泥，利用驯化培养基((NH₄)₂SO₄0.06％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.04％、K₂SO₄0.02％、NaCl 0.01％、CaCl₂·2H₂O 0.03％、半纤维素1.5％、琼脂1.5％，pH 6.5)在60℃下，经多代富集驯化、定向筛选得到。

所述菌株UTM108为革兰氏阳性、细胞0.8×(2.0～3.5)μm、直杆状、单生、芽孢中生、椭圆型、孢囊膨大；在含葡萄糖蛋白胨琼脂的培养基(葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g、琼脂15～20g、蒸馏水1000ml，pH7.0)上菌落光滑正园、微突、肉色、生长迅速，35～45℃培养24小时后菌落直径约2～3mm，最适生长温度40～70℃；接触酶阳性、硝酸盐还原阳性、PV实验阳性。

本发明还提供了用于克隆所述菌株16S rRNA的引物：

F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；

R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。

利用上述引物经PCR扩增该菌株的16S rRNA序列(如SEQ IDNo.1所示)，将获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示UTM108菌株的16S rRNA序列与Bacillus licheniformis的相似性最高，为99.7％，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。

利用通用引物UP-1S:5’-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3’和UP-2Sr:5’-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3’经PCR扩增该菌株的gyrB基因序列(如SEQ ID No.2所示)，将获得的序列提交到NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示UTM108菌株的gyrB基因序列与Bacillus licheniformis相似性最高，结合所述菌株的细胞形态及生理生化特性为鉴定该菌株的次要特征。确定该菌株为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。

进一步地，所述菌株具有的生物质水解酶活性为木聚糖脱乙酰基酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。木聚糖脱乙酰基酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因分别如SEQ IDNo.3～SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了含有述菌株的菌剂。

进一步地所述菌剂的制备方法为：

1)将所述菌株接种于培养基中，进行发酵培养，得到发酵液；

2)将发酵液直接分装成为液体菌剂，或将发酵液经脱水干燥得到菌粉剂。

更进一步地，所述步骤1)具体为：

(1)将所述菌株接种于培养基中，35-45℃温度下，100～250转/分钟摇瓶培养1～2天得到摇瓶种子液；

(2)将摇瓶种子液接种至含上述培养基的种子罐中，接种量0.1～1％，35～45℃温度下，100～400转/分钟，通气量1：0.2～0.5(v/v)，培养1-2天得到种子罐种子液；

(3)将种子罐种子液接种至含上述培养基的发酵罐，接种量0.1～1％、35～45℃温度下，60～200转/分钟，通气量1：0.3～0.6(v/v)，培养20～40小时，当OD₆₀₀≥2时，停止培养，即得发酵液。

作为优选，所述培养基为含葡萄糖蛋白胨的液体培养基，包括：葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl5g、水1000ml。

本发明还进一步提供了所述菌株或所述菌剂在城乡有机固体废弃物堆肥发酵和生产环保型生物肥料中的应用。

其中，所述有机固体废弃物包括城市生活污水厂的下水污泥、生活垃圾、餐厨垃圾、动物尸体或畜禽粪便，碳氮比为10～50:1、含水量为45％～65％。

进一步地，所述应用具体为：

1)将相当于总物料湿重0.1％～1％的菌剂接种于有机固体废弃物中，同时加入水分调理剂；混合拌匀后移入发酵槽中进行通气好氧发酵，保持氧气含量为8％～15％，间隔3～5天翻堆1次。

2)堆体好氧发酵15～30天后，大部分有机物被降解，水分降低，剩余物料或填埋或焚烧或过筛得到生物肥料。

本发明的有益效果在于：

本发明菌株UTM108是一株具有木聚糖脱乙酰基酶、β-木糖苷酶等多种耐高温的生物质水解酶活性的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，可以利用城市污水厂的下水污泥、生活垃圾、餐厨垃圾、动物尸体、畜禽粪便、农作物秸杆和某些行业产生的有机固体废弃物如中药药渣、非危废菌渣、食品工业废弃物等进行高温发酵降解，以治理有机固废物料的污染，并且通过UTM108菌株堆肥发酵还可以制备环保型生物肥料，性能优良，具有较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为本发明所述UTM108菌株的系统进化树。

图2为本发明所述UTM108菌株的显微镜照片。

图3为含有UTM108菌株的菌剂处理中的药渣。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1地衣芽孢杆菌UTM108的分离与鉴定

取约1g云南腾冲温泉底泥样品置于装有多粒小玻璃珠的250ml三角瓶中，内装100ml无菌水。于40℃恒温摇床上震荡1小时后静置30分钟。在无菌条件下吸取上清液1ml，转接至装有100ml已灭菌的富集培养基((NH₄)₂SO₄0.06％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.04％、K₂SO₄0.02％、NaCl 0.01％、CaCl₂·2H₂O 0.03％、半纤维素1.5％、琼脂1.5％，pH 6.5)中。在恒温摇床上40℃下振荡富集驯化培养3天，转速160转/分钟。取培养3天后的菌悬液1ml，加入到含9ml无菌水的试管中，以梯度稀释法制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的稀释度。分别取0.1ml涂布于定向筛选培养基平板上(K₂HPO₄0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.03％、(NH₄)₂SO₄0.2％、半纤维素1.5％、琼脂，1.5％，pH 6.5)。选择有水解圈的菌落，并测量菌落直径及透明圈直径，计算透明圈与菌落直径比值作为初筛指标挑取具有最大比值的的单菌落进行纯化。

以本发明菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA基因序列，引物为(27f)：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸90秒，30个循环，72℃延伸10分钟。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No.1所示。获得的16S rRNA基因序列通过EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/)进行比对，与菌株Bacillus licheniformis的相似性最高，同源性为99.7％。如图1所示的基于UTM108菌株及其相关菌株的16S rRNA基因序列，利用Mega5.0系统进化软件构建的系统进化树(最大似然法)，说明其系统进化关系与地衣芽孢杆菌最近。利用通用引物UP-1S:5’-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3’和UP-2Sr:5’-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3’经PCR扩增该菌株的gyrB基因，测序结果见序列表SEQ ID No.2，获得的序列提交到NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示UTM108菌株的gyrB基因序列与Bacillus licheniformis相似性最高，结合菌株的形态(如图2的UTM108菌株的显微形态)及生理生化特征，把该菌株鉴定为Bacillus licheniformis，命名为UTM108，并于2012年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为Bacillus licheniformis，保藏号为CGMCC No.9679。

实施例2菌株UTM108木聚糖脱乙酰基酶活性检测及其基因序列

取UTM108菌液100ml(牛肉膏5g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、半纤维素5g、可溶性淀粉15g、蒸馏水1000ml，pH7.2，40℃培养2天)离心(6000转/分钟10分钟)收集菌体。菌体置于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，用超声波破碎仪(600W)，工作时间5秒，间隔时间5秒，连续20次进行细胞破碎。离心(7500转/分钟、10分钟)获得上清液，即获得粗酶液。

木聚糖脱乙酰基酶活性测定以对硝基苯酚醋酸酯为底物，反应混合物含500μl对硝基苯酚醋酸酯(5％悬浮于50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)，450μl 50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)以及50μl的从UTM108的粗酶液。上述混合物置于恒温摇床，150转/分钟，37℃反应1小时后，在410nm波长下测定对硝基苯酚的含量，以确定木聚糖脱乙酰基酶活性的大小。反应重复3次，取平均值。测得UTM108菌株的木聚糖脱乙酰基酶活性为22.3个活力单位。

根据木聚糖脱乙酰基酶基因设计的引物axe-f:5’-GTG GCA TATCAA ACG G-3’和axe-r:5’-TTC GCT GAC TGT TAC G-3’，并以本发明菌株UTM108DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸60秒，35个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约0.7kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码木聚糖脱乙酰基酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No.3。

实施例3菌株UTM108α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性检测及其相关基因序列

将LB斜面(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，pH7.2)上的活化的UTM108菌株接种在含木聚糖的培养基(蛋白胨4g、燕麦木聚糖5g、葡萄糖4g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH7.2)中，40℃振荡(160转/分钟)培养两天，离心(6000转/分钟、10分钟)收集菌体。菌体置于磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，用超声波破碎仪(功率600W)工作时间5秒、间隔时间5秒，连续20次进行细胞破碎。离心(7500转/分钟、10分钟)得上清液即获得粗酶液。阿拉伯糖苷酶活性是以底物对硝基苯-阿拉伯呋喃糖苷(pNPAF)中释放对硝基苯酚(pNP)的量确定的。取待测酶液10μl加入0.18ml 0.1mmol/L pH 5.8的缓冲液中，再加10μl底物，反应10分钟后加入NaCO₃0.6ml(1mol/L)终止反应。用分光光度计在波长405nm测定其吸光值，测得UTM108菌株具有α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。

根据α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因设计的引物ara-f:5’-GCG AAGATG ACG ATT G-3’和ara-r:5’-AGC TTC GGA AGG TGA G-3’，并以本发明菌株UTM108DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，54℃退火45秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约1.5kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No.4。

实施例4菌株UTM108β-木糖苷酶活性检测及其基因序列

β-木糖苷酶活性测定反应体系为200μl，内含10μl 20mmol/L底物对硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX，Sigma)、185μl 100mmol/L pH6.0的邻苯二甲酸氢钾-咪哇缓冲液、5μl适量浓度的实施例3中所提取粗酶液。于65℃反应5分钟，然后加入600μL 1mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应并显色,用分光光度计测定其在410nm波长下的吸收值，重复3次，取平均值计算β-木糖苷酶的活性为最终测定UTM108菌株具有β-木糖苷酶的活性，其活力约为13.6个活力单位。

根据β-木糖苷酶基因保守序列设计的简并引物xylo-F1:5’-ACCGGG ATA TCT CAG G-3’和xylo-R1:5’-GCA ATA TAG CGG AACC-3’，并以本发明菌株UTM108DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸60秒，30个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约0.5kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码β-木糖苷酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No.5。

实施例5菌株UTM108液体菌剂及菌粉剂的制备

从4℃保存的本发明菌株UTM108斜面括菌苔接种于含葡萄糖蛋白胨的液体培养基(葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、Nacl5g、水1000ml)30ml的250ml三角瓶中，温度35-45℃、转速100～250转/分钟、培养1～2天为摇瓶种子液。

将摇瓶种子液接种至含上述培养基的种子罐中。培养温度35～45℃、搅拌速度100～400、通气量1：0.2～0.5(v/v)、培养1-2天为种子罐种子液。

将种子罐种子液接种至同样培养基的发酵罐，接种量0.1～1％、培养温度35～45℃、搅拌速度60～200、通气量1：0.3～0.6(v/v)、培养20～40小时，当OD₆₀₀≥2，停止培养，此为发酵液。

发酵液直接分装成为液体菌剂，发酵液脱水干燥得到菌粉剂。

实施例6利用菌株UTM108的菌剂堆肥发酵处理生活污泥

按脱水生活污泥40吨(含水量80.1％)、水分调理剂30吨(含水量32.4％)混合，混合物含水量约60％。此物料中添加UTM108菌剂70升，充分混合拌均后用装载车移入发酵槽中，堆体高度不低于2.3m。发酵槽7m×5m×8m，底部设有通气管,用400KW鼓风机不断供气并根据堆体温度调节通气量。第2天后堆体温度上升至70～85℃，第5天用装载车倒槽一次，此时温度会下降至60～65℃，随后又上升到90～100℃，最高103～105℃。当温度上升速度减慢，用装载车再倒槽一次。一个发酵周期倒槽3～4次。当倒槽后堆体温度不再维持高温，停止供气，发酵结束。此时物料水分下降至30％左右。表1为经上述技术处理后的物料检测结果。

表1 污泥经堆肥发酵后样品的检测结果(干基)

实施例7利用UTM108菌剂处理中药药渣制备生物肥料

中药虎杖提取后的药渣约20吨，含水量67.2％；水分调理剂10吨，含水量32.5％，加UTM108菌剂25升，三者混合拌匀。混合物含水量约55.6％。用装载车将混合物移入发酵槽中进行好氧推肥发酵。发酵过程中，用鼓风机(400W)通气，使氧气含量为8～15％之间。第8天温度达95℃，第10天堆体温度从95℃下降时倒槽一次，使其继续发酵。第10～20天堆体温度在80～100℃间。第25天温度降低至60～65℃，再次倒槽温度不再升高，停止供气、终止发酵。图3显示发酵过程中的中药药渣。并将物料在发酵场内散开使温度迅速下降至室温，过筛得到棕色发酵粉末。该发酵粉末可用作肥料。此生物肥料养分分析见表2。

表2 接种UTM108菌剂堆肥后的养分指标(％)

实施例8利用UTM108菌剂处理菌渣头孢菌素C

头孢菌素C菌渣约28吨，含水量77.1％，菌渣中头孢菌素C残留约2000ppm；加入水分调理剂25吨和UTM108菌剂55升，三者混合拌匀。混合物含水量约57.3％。用装载车将混合物移入发酵槽中进行好氧推肥发酵，堆体高度2.6m。发酵过程中，用鼓风机(400W)通气，并根据堆体温度情况改变通气量。第3天后温度达75～104℃，第10天堆体温度从104℃下降时倒槽一次，倒槽是起搅拌作用，使其继续发酵。倒槽后温度下降但当天就会上升。第10～15天堆体温度在100～106℃间，当堆体温度100℃下降时再次倒槽。约在第20天左右，当倒槽后堆体温不再升高，终止发酵。此时物料中的头孢菌素C残留约5ppm。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种具有生物质水解酶活性的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌株UTM108，其特征在于，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年9月18日，保藏编号为CGMCC No.9679。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述生物质水解酶活性为木聚糖脱乙酰基酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。

3.用于克隆权利要求1或2所述菌株16S rRNA的引物，其特征在于，所述引物为：

F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；

R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。

4.含有权利要求1或2所述菌株的菌剂。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的制备方法为：

1)将权利要求1或2所述菌株接种于培养基中，进行发酵培养，得到发酵液；

2)将发酵液直接分装成为液体菌剂，或将发酵液经脱水干燥得到菌粉剂。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述步骤1)具体为：

将权利要求1或2所述菌株接种于培养基中，35-45℃温度下，100～250转/分钟摇瓶培养1～2天得到摇瓶种子液；

将摇瓶种子液接种至含上述培养基的种子罐中，接种量0.1～1％，35～45℃温度下，100～400转/分钟，通气量1：0.2～0.5(v/v)，培养1-2天得到种子罐种子液；

将种子罐种子液接种至含上述培养基的发酵罐，接种量0.1～1％、35～45℃温度下，60～200转/分钟，通气量1：0.3～0.6(v/v)，培养20～40小时，当OD600≥2时，停止培养，即得发酵液。

7.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述培养基为含葡萄糖蛋白胨的液体培养基，包括：葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 5g、水1000ml。

8.权利要求1或2所述菌株或权利要求4-7任一项所述菌剂在城乡有机固体废弃物堆肥发酵和生产环保型生物肥料中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述有机固体废弃物包括城市生活污水厂的下水污泥、生活垃圾、餐厨垃圾、动物尸体或畜禽粪便，碳氮比为10～50:1、含水量为45％～65％。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：

1)将相当于总物料湿重0.1％～1％的菌剂接种于有机固体废弃物中，同时加入水分调理剂；混合拌匀后移入发酵槽中进行通气好氧发酵，保持氧气含量为8％～15％，间隔3～5天翻堆1次；

2)堆体好氧发酵15～30天后，大部分有机物被降解，水分降低，剩余物料或填埋或焚烧或过筛得到生物肥料。