JP7440029B2

JP7440029B2 - 好熱・好気性有機酸分解微生物を用いた高速コンポスト化

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Publication number: JP7440029B2
Application number: JP2019138262A
Authority: JP
Inventors: 清彦中崎; 正英荒井; 裕之岩本; 浩太中瀬
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC; Penta Ocean Construction Co Ltd
Current assignee: Tokyo Institute of Technology NUC; Penta Ocean Construction Co Ltd
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2024-02-28
Anticipated expiration: 2039-07-26
Also published as: JP2021019537A

Description

NPMD

NITE P-02975

NPMD

NITE P-02976

本発明は、単数もしくは複数の新規な好熱・好気性有機酸分解菌、及び該好熱・好気性有機酸分解菌を用いた有機性廃棄物を高速にコンポスト化する方法に関する。

近年の生活様式の変化にともない食品廃棄物が大量に発生することが大きな問題となっている。廃棄物の中でも食品の製造過程で発生する残渣、食品の売れ残りや食べ残しなどは平成２７年度には年間２８４２万ｔにも達し、そのうち約１１１０万ｔが焼却・埋め立てによって処理されていることから（非特許文献１）、最終処分場の延命のためにも食品廃棄物を焼却処分せず、コンポスト化することで有用な資源として農地に還元することに期待が高まっている。

食品廃棄物のコンポスト化を更に普及させるには、短時間のコンポスト化を可能にする高速コンポスト化を行う必要がある。高速コンポスト化においては、微生物にとって適正な温度、酸素濃度、ｐＨなどを維持することが重要であるが、特にｐＨについては中性から弱アルカリ性を維持することが有機物の分解促進に有効であることがわかっている。食品廃棄物のコンポスト化過程で有機酸が蓄積しｐＨが酸性になると微生物による有機物分解が完全に阻害されることがあることもよく知られている。

このため、コンポストの酸性化を防ぐために水酸化カルシウム（非特許文献２）、フライアッシュと石灰（非特許文献３）、酢酸ナトリウム（非特許文献４）などのアルカリ性物質をコンポスト原料に混合することが行われてきたが、このようなアルカリ物質を添加することによって有機酸を中和する方法で作られたコンポストは、わが国では有機野菜生産のためのコンポストとしては使用できない（非特許文献５）。このため、化学物質の添加に代わって、微生物を接種して適正なｐＨを維持する方法が検討されている。本発明者らは酸分解性酵母を見出し、この微生物をコンポスト原料に接種し、酵母の適温である４０℃を維持することでコンポスト化初期のｐＨ低下を抑制することに成功している（非特許文献６）。しかしながら、この微生物は温度が６０℃に達する高温段階では死滅してしまい、高温段階で酸を分解することはできない。

一方、Ｓｏｎｇらは、ジスゴノモナス属種（Dysgonomonas sp.）、シュードモナス・カエニ（Pseudomonas caeni）、エアリバチルス・パリダス（Aeribacillus pallidus）、シュードモナス属種（Pseudomonas sp.）、ラクトバチルスサリバリウス（Lactobacillus salivarius）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、及びバチルス・セレウス（Bacillus cereus）によって構成されている微生物群を有機酸の蓄積した食品廃棄物に接種して、５０～７０℃の高温条件下で有機酸が分解されることを報告している（非特許文献７）。しかしながら、これらの微生物群には、高温段階では活性を持たないと言われる微生物が含まれており、コンポスト堆積層に存在する温度が低い場所で有機酸を分解していた可能性もあることから、真の高温条件で有機酸を分解する好熱・好気性有機酸分解菌を特定することはできていない。また、これらの微生物のすべてが本当に共存する必要があるかについても明らかにされていない。

農林水産省 (2018) 食品廃棄物等の利用状況 Gray, K. R., Sherman, K. and Biddlestone, A. J. (1971) Review of composting-Part 1, Process Biochem., 6, 32-36 Wong, J. W. C., Fung, S. O. and Selvam, A. (2009) Coal fly ash and lime addition enhances the rate and efficiency of decomposition of food waste during composting, Biores. Technol, 100, 3324-3331 Yu, H. and Huang, G. H. (2009) Effects of sodium acetate as a pH control amendment on the composting of food waste, Biores. Technol, 100, 2005-2011 農林水産省 (2018) 有機肥料の日本農林規格 Nakasaki, K., Araya, S. and Mimoto, H. (2013) Inoculation of Pichia kudriavzevii RB1 degrades the organic acids present in raw compost material and accelerates composting, Biores. Technol., 144, 521-528 Song, C., Li, M., Qi, H., Zhang, Y., Liu, D., Xia, X., Pan, H. and Xi, B. (2018) Impact of anti-acidification microbial consortium on carbohydrate metabolism of key microbes during food waste composting, Biores. Technol, 259, 1-9

本発明は、コンポストの高温条件下においても生育可能であり、コンポストの原料となる有機性廃棄物に含有する有機酸を分解することができる好熱・好気性有機酸分解菌を提供することを目的とする。

上記実情に鑑み、本発明者らは、コンポスト試料中の微生物叢から、酢酸を含む培地を用いて、好気条件下、６０℃以上の高温条件下で酢酸を分解できる少なくとも２種の微生物を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］有機性廃棄物を高速にコンポスト化するための好熱・好気性有機酸分解菌であって、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ又は１６ＳｒＤＮＡを有する好熱・好気性有機酸分解菌。
［２］生育可能温度が２０～８０℃、生育至適温度が４０～７０℃の範囲にある、上記［１］に記載の好熱・好気性有機酸分解菌。
［３］好熱・好気性有機酸分解菌がバチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７５）である、上記［１］又は［２］に記載の好熱・好気性有機酸分解菌。
［４］好熱・好気性有機酸分解菌がゲオバチルス属（Geobacillus）に属する新規微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７６）である、上記［１］又は［２］に記載の好熱・好気性有機酸分解菌。
［５］有機性廃棄物を高速にコンポスト化する方法であって、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ又は１６ＳｒＤＮＡを有する、好熱・好気性有機酸分解菌を高温コンポスト化の過程に接種することを含む方法。
［６］高速化が、好熱・好気性有機酸分解菌によってコンポスト高温段階における有機酸の分解を促進することによる、上記［５］に記載の方法。
［７］好熱・好気性有機酸分解菌が、バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７５）及び／又はゲオバチルス属（Geobacillus）に属する新規微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７６）である、上記［５］又は［６］に記載の方法。
［８］有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、上記［５］～［７］のいずれかに記載の方法。

本発明は、新規に単離された好熱・好気性有機酸分解菌を高温コンポスト化の過程に接種することにより、高温段階における通気操作においても有機酸の分解を促進し、高速コンポスト化に欠かすことのできない、ｐＨの上昇をさせることができる。

高温段階で酢酸が活発に分解されたコンポスト化における微生物存在度の経時変化を示す図である。コンポスト化の経時変化を示す図である。（ａ）Ｂ．コアグランス（＃６）及びゲオバチルス（＃２０）の相対存在度；（ｂ）酢酸濃度；（ｃ）ｐＨ；及び（ｄ）温度。バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）株（図中、「ＩＰ１」として表される）を含む系統樹を示す。ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）株（図中、「ＵＭ５」として表される）を含む系統樹を示す。バチルス・コアグランス（ＩＰ１）株及びゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（ＵＭ５）株を用いた液体培地中の酢酸分解を示す図である。バチルス・コアグランス（ＩＰ１）株及びゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（ＵＭ５）株を用いた液体培地中のｐＨを測定した結果を示す。バチルス・コアグランス（ＩＰ１）株及びゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（ＵＭ５）株を用いた液体培地中の菌体濃度を測定した結果を示す。コンポスト化実験システムの概略図である。ＲｕｎＨ、Ｉ、及びＪの含水率の経時変化を示す図である。「Ｒｕｎ」に関して、後述する表９を参照されたい。ＲｕｎＨ、Ｉ、及びＪの累積炭酸ガス発生速度の経時変化を示す図である。「Ｒｕｎ」に関して、後述する表９を参照されたい。ＲｕｎＨ、Ｉ、及びＪの酢酸濃度の経時変化を示す図である。「Ｒｕｎ」に関して、後述する表９を参照されたい。ＲｕｎＨ、Ｉ、及びＪのｐＨの経時変化を示す図である。「Ｒｕｎ」に関して、後述する表９を参照されたい。ＲｕｎＨ、Ｉ、及びＪの菌体濃度の経時変化を示す図である。「Ｒｕｎ」に関して、後述する表９を参照されたい。

以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態について詳述する。
前述の通り、本発明は、有機性廃棄物を高速にコンポスト化するための新規な好熱・好気性有機酸分解菌、及びそれを使用した、有機性廃棄物を高速にコンポスト化する方法に関する。本発明の一態様では、好熱・好気性有機酸分解菌は、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ又は１６ＳｒＤＮＡを有することによって特定される。ここで、本明細書で使用するとき、語句「実質的に同一な塩基配列」とは、対応する上記プライマーの塩基配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は上記プライマーの塩基配列の塩基の複数個、好ましくは５個、より好ましくは４個、さらに好ましくは３個、さらにより好ましくは２個、最も好ましくは１個が欠失、付加及び／又は置換されている塩基配列をいう。

ここで、特段の場合を除き、本発明に関連して用いられる科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。また、本明細書において記述される微生物及び培養、分子生物学、ならびにタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して用いられる名称、及びそれらの技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に用いられる。オリゴヌクレオチド合成、及び細菌培養に関しても、標準的な技術が用いられる。本明細書において記述される分析化学、ならびに医化学及び薬化学に関連して用いられる名称、ならびにそれらの実験技法及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に用いられる技法及び技術であることは、当業者によって承認されるべきものである。

本開示に従って用いられるように、以下の用語は、それ以外であることを示している場合を除き、以下の意味を有すると理解される。本明細書において使用するとき、用語「コンポスト」とは、有機性廃棄物をコンポスト化処理された後の堆肥を意味する。ここで、用語「コンポスト化」とは、有機性廃棄物を微生物の働きでコンポスト（堆肥）にすることをいう。なお、本発明によれば、コンポスト化に使用される微生物は「好熱・好気性有機酸分解菌」であることを特徴とするが、コンポスト化に使用される微生物は、「好熱性有機酸分解菌」と「好熱性有機物分解菌」を合わせた複合菌であってもよい。より具体的には、コンポスト化は、上記二群の微生物がコンポスト化に機能し、好熱性有機酸分解菌により有機酸が分解されるのと同時に、好熱性有機物分解菌により有機物が活発に分解されるというメカニズムで行われるものであってもよい。ここで、用語「有機酸」とは、少なくとも１つのカルボン酸基を含んでいる酸を指す。場合により、「有機酸」は、Ｃ_1-10有機酸であり、また、有機酸は２つのカルボキシラート基を含んでもよい。「有機酸」としては、限定されないが、例えば、酢酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、プロピオン酸、酪酸などが挙げられる。一方、「有機物」としては、限定されないが、糖、タンパク質、脂肪などが挙げられる。また、用語「有機性廃棄物」とは、一般的に、生物学的分解によって環境中に直接還元することができる廃棄物を指し、限定されないが、生ごみなどの食品廃棄物、糞尿、動植物性残さ、古紙、及び汚泥などが挙げられる。食品廃棄物には、一般廃棄物（事業系及び家庭系を問わない）及び産業廃棄物が含まれる。具体的には、食品廃棄物の例は、限定されないが、生ごみ、おから、排乳、ホエイ、コーヒーかす、茶かすなどが挙げられる。

本発明は、従来のコンポスト化と比べて高速にコンポスト化し得ることを特徴とする。本明細書で使用する場合、用語「高速（化）」とは、本発明の方法により、従来のコンポスト化法と比べて、好熱・好気性有機酸分解菌の作用により、コンポスト化までの時間を短縮することができることを意味する。従来のコンポスト化法では、有機物分解に数週間～数カ月以上を要することは周知である。このようにコンポスト化に長時間を要する原因として、まず、有機性廃棄物のコンポスト化過程で有機酸が蓄積し、そのためｐＨが酸性になると微生物による有機物分解が阻害されることが挙げられる。その後、微生物の働きが阻害されることで、コンポスト堆積層内の温度が低下する。引き続いて、好熱性でない酸分解菌が低温条件下で増え、酸の一部が分解されることで、他の有機物分解菌の作用が促進され活発な有機物分解が再び開始する。このため、新たな酸の生成と堆積層内の温度が上昇し、高温で酸が蓄積することで微生物の働きが阻害されるという悪い循環がおこり、結果としてコンポスト化に長時間がかかることになる。よって、本発明によれば、コンポスト化までの時間を７～１０日、長くても２週間程度に短縮することができ、従来のコンポスト化法によるコンポスト化までの時間と比較して、その時間が、限定されないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００倍、又は２～１００、３～９０、５～８０、１０～７０、若しくは２０～５０倍短縮され得る。

１．好熱・好気性有機酸分解菌の同定
本発明の高速コンポスト化に使用される「好熱・好気性有機酸分解菌」は、通気をともなうコンポスト化過程の高温段階（例えば、５０℃以上）で有機酸を分解する能力を維持し、また、有機酸が蓄積し、コンポストのｐＨが酸性になった環境下でさえ有機酸を分解する能力を維持する微生物を指す。

本発明のコンポスト化過程で見出される好熱・好気性有機酸分解菌は、細菌が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲにて増幅し、次世代シーケンサーを用いて試料中の微生物叢変化（細菌の種類や存在度など）を網羅的に解析することによって同定することができる。

従来、細菌の種類を同定するためには、選択培地による増菌やキャピラリーシーケンサーによる個別のシーケンス解析が必要であったが、細菌によっては増菌できないものがあること、大量の解析を行うには不向きであるなど問題が多い。周知の通り、細菌が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、タンパク翻訳に関わる重要な遺伝子であるため、細菌の種類によらず、比較的保存されている領域である。また、細菌の種類ごとに安定であることから、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を解析し、既存のデータベースと照らし合わせることにより、細菌の種類を同定することができる。

１６ＳｒＲＮＡ菌叢解析に関して、遺伝子長が約１．５ｋｂｐの１６ＳｒＲＮＡには、細菌の種類ごとに配列が異なるＶ領域が９か所（Ｖ１～Ｖ９）あることが知られている。Ｖ１～Ｖ２領域又はＶ３～Ｖ４領域に対する特異的プライマーを設計し、ＰＣＲを行うことにより、５００ｂｐ程度の増幅産物が得られる。さらには、次世代シーケンサーで解析するために必要なアダプター配列を付加したプライマーセットを用いて増幅し、その後、インデックスＰＣＲによって任意の識別配列及びシーケンス配列を付加することで、各種シーケンサーでのシーケンスランが可能となる。得られたシーケンスデータを専用解析ソフトで解析し、菌叢の一次解析（系統樹、分布図）を出力することができる。さらには、二次解析（主成分分析、α多様性解析）もすることができる。例えば、上記一次解析により、コンポス試料中の微生物叢の変化を経時的に分析することができる（図１を参照されたい）。

一般的に、遺伝子を増幅するための方法としては、ＰＣＲ法（ＳａｉｋｉＲ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０－１３５４（１９８５））が主流であるが、これに限定されず、当業者であれば、例えば、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕＤ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０－５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（ＫｗｏｈＤ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３－１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（ＷａｌｋｅｒＧ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２－３９６（１９９２）；ＷａｌｋｅｒＧ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，１６９１－１６９６（１９９２））等を用いることができることは容易に理解される。なお、本発明の方法においては、簡便であるという利点を考えて、ＰＣＲ法を利用することが好ましい。

ＰＣＲ用のプライマーの設計は、一般的な設計条件に基づいて行われるが、以下の条件を付して行ってもよい。増幅サイズは８０～１５０塩基（増幅効率を１００％にするため）、プライマー長さは１７～２５塩基（長過ぎるとアニーリング効率が低下する）ＧＣ含量は４０～６０％（４５～５５％が望ましい）とし、偏りがないように、部分的にＧＣ、ＡＴリッチができないように注意する、Ｔ／Ｃ、Ａ／Ｇが連続しないように注意する、プライマー内部での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー間での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー３’末端が２塩基相補する配列を避ける。プライマーの標的塩基配列への特異性を確認するため、所定のＰＣＲ反応条件下で定量的ＰＣＲ法（例えば、ＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲ法、蛍光プローブ法、競合ＰＣＲ法）を用いて、増幅曲線分析及び融解曲線分析を行って、微生物濃度を定量することができる。なお、本発明では、微生物叢変化を網羅的に分析するために次世代シーケンサーを用いることができるが、遺伝子増幅のために、インデックス配列を有するプライマーを用いたインデックスＰＣＲを使用することができる。

次に、上記で核酸を増幅させたＰＣＲ増幅産物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動することによって分離し得る。電気泳動によるＰＣＲ増幅産物の分離は常法に従って容易に行うことができる。電気泳動で使用するゲルは、核酸を変性させるための変性剤を含み、核酸の分離に適した所定の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲルであることが好ましい。また、電気泳動に使用される泳動溶液及び電圧等の泳動条件は適宜調整することができる。

本発明によれば、シーケンシングによる一次解析後、コンポスト試料から有機酸含有培地を用いて、好気条件下、高温条件下で有機酸を分解できる微生物をスクリーニングすることによって、目的とする好熱・好気性有機酸分解菌を得ることができる。後述する実施例１に示されるように、酢酸を含む培地中、好気条件下、６０℃の培養条件でスクリーニングを行った結果、好熱・好気性有機酸分解菌として、２種の菌株を同定することに成功した。一方は、図３に示した系統樹において、「ＩＰ１」と記載された菌株であって、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）の近縁株（９９％の相同性を有する）であり、配列番号３に示される１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を有する。他方、図４に示した系統樹において、「ＵＭ５」と記載された菌株であって、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）株であり、配列番号４に示される１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を有する。本明細書においては、「ＩＰ１」株を「バチルス・コアグランスの近縁株」又は「バチルス・コアグランス（＃６）」と表記することもある。また、「ＵＭ５」株を「ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスの近縁株」又は「ゲオバチルス（＃２０）」と表記することもある。これら２種の微生物を２０１９年６月２５日に独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託した。受託番号は、それぞれＮＩＴＥＰ－０２９７５及びＮＩＴＥＰ－０２９７６である。

本発明の好熱・好気性有機酸分解菌（ＩＰ１株及びＵＭ５株）は、各々、以下の特徴を有する。
（ｉ）ＩＰ１株：グラム陽性；芽胞を形成する；桿菌；好気的に増殖；カタラーゼ陽性；運動性あり；グルコースから乳酸生成。
（ｉｉ）ＵＭ５株：グラム陽性；芽胞を形成する；桿菌；好気的に増殖；カタラーゼ陽性；カゼインの加水分解。

高速コンポスト化においては、微生物にとって適正な温度、酸素濃度、ｐＨなどを維持することが重要である。本発明の好熱・好気性有機酸分解菌は、高温において有機酸を分解する能力を維持し、有機性廃棄物に通気等により空気が供給されている状況下においても有機物の分解が促進される中性から弱アルカリ性を維持することができることから、高温コンポスト化に適した細菌である。本発明によれば、本発明の好熱・好気性有機酸分解菌は、高温で有機酸を分解し、コンポストのｐＨを上昇させる能力が維持される温度で生育できればよい。好ましくは、本発明の好熱・好気性有機酸分解菌の生育可能温度は２０～８０℃、好ましくは３０～７０℃、より好ましくは３０～６５℃であり、生育至適温度は４０～７０℃、好ましくは４５～６５℃である。別の態様によれば、本発明の好熱・好気性有機酸分解菌のそれぞれについて、生育可能温度は、ＩＰ１株では３０～６５℃が好ましく、ＵＭ５株では４５～７０℃が好ましい。また、本発明の好熱・好気性有機酸分解菌は、酸性条件下、すなわち、ｐＨ４以上からｐＨ７．０未満の範囲内で生育され、有機酸を分解する機能を発揮することができる。本発明によれば、本発明の好熱・好気性有機酸分解菌は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝４）でさえ、上記機能を発揮することができる。

２．有機性廃棄物の高速コンポスト化
周知の通り、食品廃棄物のコンポスト化過程で有機酸が蓄積し、これに伴いｐＨが酸性になると微生物による有機物分解が完全に阻害されることがある。そのため、短期間でのコンポスト化には、コンポストのｐＨを中性から弱アルカリ性を維持することにより、有機物の分解を促進する必要がある。

本発明によれば、本発明の好熱・好気性有機酸分解菌を高温コンポスト化の過程に接種することにより、短期間にコンポストを得ることができる。本発明の一態様では、有機性廃棄物を高速にコンポスト化する方法であって、本方法は、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ又は１６ＳｒＤＮＡを有する、好熱・好気性有機酸分解菌を高温コンポスト化の過程に接種することを含む。

本発明の方法は、好熱・好気性有機酸分解菌を高温コンポスト化の過程に接種することを特徴とするが、コンポスト化過程のコンポスト試料中の温度が、使用される好熱・好気性有機酸分解菌の生育可能温度又は至適温度の下限値、及び微生物叢に含まれる好熱・好気性でない細菌が死滅する温度である５０℃（好ましくは６０℃）に達することが予測される時点よりも一定期間前（例えば、６～７日前、２～３日前、１日前、１２～１６時間前、７～８時間、２～３時間前、１時間前など）もしくは直前に、又は５０℃（好ましくは６０℃）に達した時点で好熱・好気性有機酸分解菌をコンポスト試料に接種することが好ましい。また、好熱・好気性有機酸分解菌の接種量は、適切にコンポスト化され得る量であれば特に限定されないが、例えば、接種時の濃度は、１０⁵～１０⁹ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ（グラム乾燥物）、好ましくは１０⁶～１０⁹ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ、より好ましくは５×１０⁶～５×１０⁸ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ、さらにより好ましくは１０⁷～１０⁸ＣＦＵ／ｇ－ｄｓである。

本発明の一実施形態において、コンポスト試料に接種される好熱・好気性有機酸分解菌は、上記したバチルス属（Bacillus）に属する微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７５）、及びゲオバチルス属（Geobacillus）に属する微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７６）である。本発明によれば、これらの２種の微生物を同時に又は逐次的に接種することができる。逐次的に接種する場合は、微生物の接種する順番は限定されないが、バチルス属に属する微生物を接種した後に、ゲオバチルス属を接種することが好ましい。また、高速コンポスト化には、上記２種の微生物のうちのいずれかを単独で使用した場合であっても所望の効果は得られるが、後述する実施例３及び４において実証されるように、２種の微生物をともに使用することにより、有機酸の分解が加速されるという効果（相乗効果）が得られた。また、上記２種の微生物を用いて、高速コンポスト化を行う場合、バチルス属に属する微生物とゲオバチルス属に属する微生物の接種比は適宜調整することができるが、バチルス属に属する微生物とゲオバチルス属に属する微生物の比は、１：１００～１００：１であり得る。両微生物の比は、例えば、１：１であってもよい。また、これらの微生物を逐次的に接種する場合、限定されないが、バチルス属に属する微生物を接種した後、所定期間が経過した後にゲオバチルス属に属する微生物を接種することが好ましい。所定期間の経過には、例えば、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間（２日）後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後などが挙げられる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

実施例１：次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いたコンポスト化過程での微生物叢変化の解析
本発明者らは、高温条件下において有機酸が活発に分解されるコンポスト化のあることを発見した。そのコンポスト化においては、高温で有機酸を分解する微生物が存在するものと考えて、ＮＧＳ（ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の方法を適用し、微生物叢変化を解析した。１０日間におけるコンポスト化過程で適宜採取した試料１ｇからＩｓｏｉｌｆｏｒＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ（（株）ニッポンジーン）を用いてＤＮＡを抽出した。続いて、抽出した微生物のＤＮＡについて、その１６ＳｒＲＮＡの一部（Ｖ３、Ｖ４領域）を含む領域をＴａＫａＲａＥＸＴａｑ（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ（株））を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅に用いた試薬の組成、アンプリコンＰＣＲＦプライマー及びアンプリコンＰＣＲＲプライマーの配列と増幅条件をそれぞれ表１及び表２に示す。ＰＣＲ増幅には、ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴＰ６００、タカラバイオ（株））を用いた。

増幅したＰＣＲ産物は、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶＧｅｌ及びＰＣＲＣｌｅａｎ－ＵｐＳｙｓｔｅｍ（プロメガ（株））を用いて精製した。アンプリコンＰＣＲで得られたＰＣＲ産物から電気泳動で使用した液量を除いたＰＣＲチューブ内のＰＣＲ産物２４μＬに同量の膜結合溶液を加えた。ＳＶカラムを回収チューブに差し込んだＳＶミニカラムセットにＰＣＲ産物と膜結合溶液の混合液を注ぎ、室温で１分間インキュベートすることにより、ＳＶカラムにＤＮＡを吸着させた。その後、１６，０００×ｇで１分間遠心し、回収チューブ中に回収された液体を取り除いた。続いて、ＳＶミニカラムに吸着しているＰＣＲ産物を洗浄するために、エタノールと膜洗浄溶液の原液を４．８：１の割合で混ぜた洗浄液を調製した。この洗浄液７００μＬをＳＶミニカラムに加え、１６，０００×ｇで１分間遠心して回収チューブ中の液体を除去した。続いて、５００μＬの洗浄液をＳＶミニカラムに加え、１６，０００×ｇで５分間遠心して２回目の洗浄を行った。最後に、清浄な１．５ｍＬマイクロチューブ（コニカル底）に精製したＰＣＲ産物を回収した。

精製したＰＣＲ産物に対して、ＮｅｘｔｅｒａＸＴインデックスキット（イルミナ（株）ならびにＴａＫａＲａＥＸＴａｑ（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ（株））を用いてインデックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅に用いた試薬の組成、インデックスＰＣＲの増幅条件をそれぞれ表３及び表４に示す。プライマーには２種類のインデックスプライマー（ＮｅｘｔｅｒａＸＴインデックス１（Ｎ７）、ＮｅｘｔｅｅａＸＴインデックス２（Ｓ５））を用いた。

ＰＣＲにより目的配列が増幅されたことを確認するために、各ＰＣＲ増幅物を１．０×Ｔｒｉｓ－ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）アガロースゲル（寒天濃度２％）を用いて電気泳動した。その後、上述のＰＣＲＣｌｅａｎ－Ｕｐを同じ手順で行い、ＰＣＲ産物を精製した後、分析会社（（株）北海道システムサイエンス）に送って分析を依頼した。

データの解析はＭａｃＱＩＩＭＥを使用して行われた。Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄ法で得られた約３００塩基の配列を、ＦＡＳＴＱ－Ｊｏｉｎツール（ＥｒｉｋＡｒｏｎｅｓｔｙ、２０１１．ｅａ－ｕｔｉｌｓ）を用い、オーバーラップしている部分を結合させ、約４６５ｂｐの長い塩基配列に調整した。その結果得られた４６５塩基の配列を類似度が９７％以上のものを１つのＯＴＵに分類した。各ＯＴＵの代表配列はＵＣＬＵＳＴ法により、ＯＴＵの分類の際に最初に選択した配列となっている。代表配列は１６ＳｒＲＮＡ配列のデータベース（Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅデータベース）に対する相同性検索を行うことにより、系統分類を推定した。その後、各ＯＴＵに属する配列の数を集計することで、コンポスト試料中の微生物叢を得た。

このようにして得られたコンポスト中の微生物叢の経時変化を図１に示す。試料中で存在度が高い微生物が１０種類以上あることが判明した。このうちバチルス・コアグランス（＃６）とゲオバチルス（＃２０）はコンポスト化前半から中盤に掛けて特徴的な相対的存在度の変化を示した。

コンポスト試料中のバチルス・コアグランス（＃６）とゲオバチルス（＃２０）の相対的存在度、酢酸濃度、ｐＨ、及び温度の経時変化を比較した結果を図２に示す。温度が６０℃に維持されていたコンポスト化６～８日にかけてゲオバチルス（＃２０）の相対的存在度は１０～２０％に上昇した。この期間には酢酸濃度が大きく減少し、ｐＨも上昇したことから、ゲオバチルス（＃２０）がその増殖に伴い、酢酸を分解したものと考えられた。一方、バチルス・コアグランス（＃６）の相対存在度は温度が４０℃から６０℃に上昇したコンポスト化３～４日にかけて急激に上昇した後、コンポスト中で温度が６０℃に保たれたコンポスト化６日後までに低下した。バチルス・コアグランス（＃６）は相対存在度が増加している期間に酢酸濃度は上昇しているために、この微生物の濃度変化は、見かけ上、酢酸分解と対応しないと考えられた。しかしながら、後述するように、純粋培養したバチルス・コアグランス（ＩＰ１）は６０℃で生育できること、また、そのときに酢酸を分解することを確かめているため、バチルス・コアグランス（＃６）がコンポスト中に存在しなければ、さらに高濃度の有機酸が蓄積しｐＨも低下したところ、この微生物が存在したために、酢酸の蓄積とｐＨ低下はこの程度に抑えられた、すなわち、コンポスト化においてバチルス・コアグランス（＃６）は酢酸分解に寄与しているものと推察された。なお、バチルス・コアグランス（＃６）の相対存在度の減少とゲオバチルス（＃２０）の相対存在度の増加は引き続いて起こっており、いわゆる微生物遷移が観察された。そして、コンポスト化過程でバチルス・コアグランス（＃６）からゲオバチルス（＃２０）へと特徴的な微生物群の遷移が起こったことが、酢酸の分解、ｐＨの上昇、共存する他のコンポスト化微生物の活性化に寄与していたものと考えられた。

実施例２：好熱・好気性有機酸分解菌の単離
上述のコンポスト試料から、酢酸を含む培地を用いて、好気条件下、６０℃の高温条件下で酢酸を分解できる微生物をスクリーニングした。スクリーニングには、無機塩液体培地（表５参照）に酢酸３ｇ／Ｌを唯一の炭素源として添加した液体培地と、トリプチケース・ソイ液体培地（表６参照）に酢酸３ｇ／Ｌを添加した液体培地を用いた。コンポスト試料を滅菌水で１００倍に希釈してそれぞれの液体培地に接種し、６０℃、３日間の条件で集積培養した。その後、上述の酢酸含有トリプチケース・ソイ液体培地に寒天を加えた寒天平板を用いて希釈平板法を適用し、６０℃で３日間の培養後にコロニーを形成した菌株を釣菌し、純粋培養を確立した。

酢酸を含む培地を用いたスクリーニングから２種類の微生物が単離された。それぞれを「ＩＰ１」株、「ＵＭ５」株とした。単離した微生物の特定は、微生物からＤＮＡを抽出し、塩基配列を決定することによって行った。ＤＮＡ抽出方法には、上述と同様にＤＮＡ抽出キットＩｓｏｉｌｆｏｒＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ（（株）ニッポンジーン）を用いた。続いて、ＰＣＲ反応を行い、１６ＳｒＲＮＡを含む領域をＴａＫａＲａＥＸＴａｑ（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ（株））を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅に用いた試薬の組成、プライマー１６ＳＦ及び１６ＳＲの配列と増幅条件の一覧をそれぞれ表７及び表８に示す。なお、ＰＣＲ増幅にはＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴＰ６５０、タカラバイオ（株））を用いた。増幅確認後、得られたＰＣＲ増幅物はＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ－ＵｐＳｙｓｔｅｍ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて精製した。

次に、精製したＰＣＲ増幅物について、その１６ＳｒＲＮＡの一部（Ｖ３及びＶ４領域）を含む領域にＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１サイクルシーケンシングキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＪａｐａｎ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ）を用いてシーケンシング反応を行った。シーケンシング反応後に塩基配列をＡＢＩＰｒｉｓｍ（登録商標）３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。決定した塩基配列はＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に登録されている配列に対してＢＬＡＳＴ検索を行い、最も近縁な微生物名を決定した。得られた塩基配列のＢｌａｓｔ結果から、単離した微生物の系統樹を作製した（図３及び図４）。ＩＰ１株は、バチルス・コアグランスと近縁であることが確かめられた。一方、ＵＭ５株は、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）と相同性が９９％と高いことがわかった。また、これらの微生物はコンポスト化過程で特徴的な相対存在度を示したバチルス・コアグランス（＃６）、及びゲオバチルス（＃２０）のグループを形成していたと考えられた。

実施例３：ＩＰ１株及びＵＭ５株の有機酸分解特性の評価
ＩＰ１株及びＵＭ５株の有機酸分解特性を把握するために、表９に示すＲｕｎＡ～Ｇの実験を行った。

実験にはトリプチケース・ソイ液体培地に酢酸を添加して培養液中の酢酸濃度が０．３ｇ／Ｌ、及び１．２ｇ／Ｌとなるように調整した培地を用いた。酢酸水溶液はトリプチケース・ソイ液体培地をオートクレーブで滅菌した後に０．２０μｍ孔径のメンブレンフィルター（２５ＣＳ０２０ＡＳ、Ａｄｖａｎｔｅｃ）を用いてろ過し、無菌的に加えた。酢酸濃度が０．３ｇ／Ｌ、及び１．２ｇ／Ｌの培養液のｐＨは、それぞれ６．３と５．８となった。続いて、５００ｍＬ容の坂口フラスコに上述のように調整した液体培地を１００ｍＬ注ぎ込み、ＩＰ１株、ＵＭ５株のそれぞれ、及びその両方を接種して、６０℃、１５０ｒｐｍで５日間培養した。なお、菌体濃度は約１０⁷ＣＦＵ／ｍＬとなるように接種した。培養期間中、一日に１度、培養液の試料を５ｍＬずつ採取し、ｐＨ、有機酸濃度、微生物濃度を測定した。

ｐＨはｐＨメータ（Ｄ－５１，（株）堀場製作所）を用いて測定した。また有機酸濃度は、試料を０．２０μｍ孔径のメンブレンフィルター（２５ＣＳ０２０ＡＳ、Ａｄｖａｎｔｅｃ）でろ過し、ろ液中の濃度をＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣのカラムにはＳＵＧＡＲＳＨ１０１１（Ｓｈｏｄｅｘ）を用い、カラム温度は５０℃とした。また、移動相には５ｍＭの硫酸水溶液を用い、流速は１．０ｍＬ／分とした。なお、検出器にはＵＶ－２０７５（日本分光株式会社製）を用いて、波長２１０ｎｍでの紫外光吸光度を測定した。微生物濃度の測定には、トリプチケース・ソイ寒天培地を用いた希釈平板法を適用した。培養温度は６０℃で培養期間は３日間とした。

図５は、ＲｕｎＡ～Ｇにおける酢酸（有機酸）濃度の経時変化を示す。ＩＰ１株を接種し、酢酸濃度を０．３ｇ／ＬとしたＲｕｎＡでは培養１日後までに酢酸が完全に分解された。一方、酢酸濃度を１．２ｇ／ＬとしたＲｕｎＤでは酢酸の分解開始は培養１日経過以降に始まり、完全な酢酸の分解まで５日間を要した。また、ＵＭ５株を接種し、酢酸濃度を０．３ｇ／ＬとしたＲｕｎＢでは酢酸濃度は５日間で０．１３ｇ／Ｌまで減少したが、酢酸濃度を１．２ｇ／ＬとしたＲｕｎＥでは減少は見られなかった。これらの結果は、ＩＰ１株の方がＵＭ５株に比べて酢酸の分解活性が高いことを示している。また、酢酸濃度を１．２ｇ／Ｌとし、ＩＰ１株とＵＭ５株の両方を接種したＲｕｎＦでは、培養４日後までに酢酸は完全に分解され、ＩＰ１株のみを接種した場合よりも１日早く、酢酸は消費し尽されており、ＩＰ１株とＵＭ５株の両者を同時に接種することで、酢酸分解が加速されることがわかった。なお、微生物を接種しなかったＲｕｎＣ、及びＧではｐＨと酢酸濃度に顕著な変化は見られなかった。

さらに、ＩＰ１株及びＵＭ５株による有機酸分解に関連して、酢酸以外の有機酸（プロピオン酸及び酪酸）を用いて上記と同様の実験を行った結果、各菌株は、表１０に示した各濃度の有機酸を分解することができた。ＩＰ１株の方が有機酸を分解する能力が高いことが示唆された。

図６は、ＲｕｎＡからＧにおけるｐＨの経時変化を示す。ＩＰ１株を接種し、初期酢酸濃度を０．３ｇ／ＬとしたＲｕｎＡにおいては初期ｐＨ６．３から２日後に８．５付近まで上昇した後はほぼ一定となった。一方、初期酢酸濃度を１．２ｇ／ＬとしたＲｕｎＤではｐＨは５．７から５日後の培養終了時に８．５付近まで上昇した。ＲｕｎＡとＤにおいてｐＨが８．５付近まで上昇したのは、酢酸の分解と同時に、培地中のタンパク質の分解によるアンモニア等のアルカリ性物質が生産されたためと考えられた。

ＵＭ５株を接種し、初期酢酸濃度を０．３ｇ／ＬとしたＲｕｎＢではｐＨは初期６．３から継続的に上昇して培養５日後に７．８に到達した。一方、酢酸濃度が１．２ｇ／ＬのＲｕｎＥではｐＨ５．７から変化しなかった。また、ＩＰ１株とＵＭ５株の両方を接種し酢酸濃度を１．２ｇ／ＬとしたＲｕｎＦでは、ＩＰ１株のみの接種よりも１日早く、初期ｐＨ５．７から培養４日後にｐＨが８．５付近まで上昇した。なお、微生物の接種を行わなかったＲｕｎＣとＧのｐＨはほぼ一定だった。以上のようにｐＨの変化は上述した酢酸濃度の変化とよく対応した。また、ＩＰ１株とＵＭ５株の両者を接種するは液体培養中での酢酸分解、ｐＨの上昇に効果的であることが判明した。

図７は、ＲｕｎＡ～Ｇにおける細菌濃度の経時変化を示す。ＩＰ１株を接種したＲｕｎＡでは１０⁷ＣＦＵ／ｍＬから細菌濃度が減少し続けて、３日後に希釈平板法で検出限界以下になった。一方、ＲｕｎＤ及びＦでは、それぞれ、培養５日、及び４日後に検出限界以下となった。酢酸が分解されて濃度が低下すると、ＩＰ１株濃度は低下するが、これはＩＰ１株が、生育のために酢酸を必要とすることを示している可能性もある。一方、ＵＭ５株を接種した実験では、酢酸が分解されても、菌体濃度は培養期間を通してほぼ一定であり、ＩＰ１株とは際立って異なる性質を有することが明らかとなった。

このようにトリプチケース・ソイ液体培地において、ＵＭ５株及びＩＰ１株が６０℃という高温条件下においても酢酸分解によりｐＨを上昇させることがわかった。また、ＩＰ１株はＵＭ５株に比べて、高酢酸濃度、低ｐＨでも活性が高いこと、また、ＩＰ１株は、酸分解が終了すると菌体濃度は低下するが、ＵＭ５株は高濃度が維持されることを確かめた。また、ＩＰ１株とＵＭ５株の２種を接種した場合には、ＩＰ１株のみよりも短期間で酢酸の完全分解が可能であり、このことからＩＰ１株とＵＭ５株の２種を接種することによる酢酸分解の促進効果が確かめられた。

実施例４：ＩＰ１株とＵＭ５株を接種したコンポスト化
上記の通り、液体培地を用いてＩＰ１株、ＵＭ５株の酢酸分解特性を評価することで、ＩＰ１株とＵＭ５株の両方に６０℃の高温条件下での酢酸分解能があることがわかった。また、ＩＰ１株とＵＭ５株を同時に接種することによる酢酸分解の促進効果が確認された。そこで、次に、コンポスト原料を用いて固体培養であるコンポスト化におけるＩＰ１株とＵＭ５株の酢酸分解の効果について検討した。

（１）コンポスト原料
再現性のあるデータを得るためにコンポスト原料として、生ごみの代わりにラビットフード（チモシー、イースター株式会社）、通気性改良材としておがくず（株式会社島田小割製材所）、研究室の従来の実験と比較するために市販の微生物資材（オーレスＧ、（株）松本微生物研究所）を加え、それぞれの混合比を乾燥重量比で１０：９：１としたものを用いた。ラビットフードは均一な有機物分解と試料時のばらつきを小さくするために、フードプロセッサーで１ｍｍ程度に磨砕した後に使用した。コンポスト原料は１２１℃、９０分間オートクレーブで処理し、予め、滅菌した。なお、酢酸はオートクレーブ後に０．２０μｍ孔径のメンブレンフィルター（２５ＣＳ０２０ＡＳ、ａｄｖａｎｔｅｃ）を用いてろ過した後に１０ｍｇ／ｇ－ｄｓとなるように添加した。

（２）コンポスト化操作及び実験装置
コンポスト化装置を図８に示す。先に調製したコンポスト原料１２ｇを容積１００ｍＬの円筒形ガラス容器（ミニリアクター）に充填し、微生物を接種した。接種する微生物の種類を変えて、ＩＰ１株とＵＭ５株を接種したＲｕｎＨ、ＩＰ１株のみを接種したＲｕｎＩ、いずれの微生物も接種しないＲｕｎＪの３通りを行った。菌体の接種のためにトリプチケース・ソイ培地で培養したＩＰ１株とＵＭ５株は菌体を回収した後、生理的食塩水に懸濁して接種した。続いて、実験開始時の含水率が６０％となるよう滅菌水を無菌的に添加し、好気条件を維持するために装置の底部から５．５ｍＬ／分の速度で通気した。なお、通気した空気は、予め、炭酸ガスを取り除くために水酸化ナトリウム水溶液に通気し、さらに、コンポストが乾燥し過ぎるのを避けるために蒸留水に通気した後に供給した。ミニリアクターの温度はインキュベーター内で維持したが、高温になるほど酢酸の揮発が起こりやすいことから温度設定は５５℃とした。コンポスト化開始時に室温から５５℃まで２．５℃／時で昇温させ、その後、５５℃一定を維持した。ミニリアクターから排出されたガスをサンプリングバッグ（スマートバッグＰＡ、ＧＬサイエンス）に集め、一日に１度交換して、排気ガス量と炭酸ガス濃度を計測した。排気ガス量は乾式ガスメータ（ＤＣ－１、株式会社シナガワ）によって、炭酸ガス濃度は炭酸ガス濃度測定器（ＧＭＴ２２０、ヴァイサラ）によって測定した。また、コンポスト化に伴い、均一な有機物分解を目的に、一日に１度、リアクター内部を混合攪拌する切り返し操作を行い、同時に一基ずつのミニリアクターを取り除いて、固体試料を回収した。

固体試料についてはｐＨ、含水率、有機酸濃度、微生物濃度を測定した。コンポスト試料のうち２．０ｇをホモジナイズカップに測り取り、滅菌水１８ｇを加えて１０倍希釈したものを１０，０００ｒｐｍで１０分間、ホモジナイザ（ＡＭ－５、（株）日本精機製作所）で処理した。微生物濃度の測定には、この懸濁液に希釈平板法を適用した。ｐＨは懸濁液を用いてｐＨメータ（Ｄ－５１、（株）堀場製作所）にて、有機酸濃度はＨＰＬＣで測定した。含水率は、乾燥機（ＤＳ－６００、ヤマト科学（株））で１０５℃、１日間乾燥し重量減少から算出した。

（３）含水率の経時変化
図９は、ＲｕｎＨ、Ｉ、及びＪの含水率の経時変化を示す。リアクター内の含水率調整を行わなかったため、いずれのコンポスト化においても、水分が蒸発して１日あたりおよそ２％ずつ含水率が減少したが、コンポスト化期間中において微生物活性を高く維持するのに適した含水率５０～６０％の間に維持されていた。

（４）ｐＨ、有機酸濃度の経時変化
図１０及び図１１は、ＲｕｎＨ、Ｉ、及びＪにおける酢酸濃度とｐＨの経時変化を示す。ＩＰ１株とＵＭ５株を接種したＲｕｎＨでは、コンポスト化４日後までに添加した酢酸１０ｍｇ／ｇ－ｄｓが完全に分解され、ｐＨは初期値５．８から８．２まで上昇した。一方、ＩＰ１株のみを接種したＲｕｎＩでは、コンポスト化４日までに酢酸濃度が５．８ｍｇ／ｇ－ｄｓまで減少して、ｐＨは７．７まで上昇した。ＲｕｎＨ、ＩにおいてはＩＰ１株及びＵＭ５株は酢酸の分解だけなく、コンポスト原料中のタンパク質を分解してアルカリ物質を生産することでｐＨを上昇させていたと考えられた。一方、微生物の接種を行わなかったＲｕｎＪでは、酢酸濃度は初期値１０ｍｇ／ｇ－ｄｓから９．７ｍｇ／ｇ－ｄｓまでわずかに減少し、ｐＨは初期値５．８から６．１付近まで上昇した。ＲｕｎＪにおけるｐＨと酢酸濃度の変化は、５５℃という高温条件下で通気をおこなった結果、水分と共に酢酸が揮発したことが原因と考えられた。ＲｕｎＨとＩの比較から、ＩＰ１株のみの接種よりもＩＰ１株とＵＭ５株を同時に接種することが酢酸分解に効果的であることがわかった。

（５）炭酸ガス発生速度の経時変化
図１２は、ＲｕｎＨ、Ｉ、及びＪにおける累積炭酸ガス発生量の経時変化を示す。ＩＰ１株とＵＭ５株の２種類を同時に接種した場合、ＩＰ１株のみを単独で接種した場合に比べて累積炭酸ガス発生量は大きくなった。また、微生物を何も接種しないＲｕｎＪにおいては、炭酸ガスは全く発生しなかった。以上の結果、ＩＰ１株とＵＭ５株は協同して有機物分解を促進することがわかった。

（６）好熱・好気性細菌の濃度の経時変化
図１３は、ＲｕｎＨ、Ｉにおける菌体濃度の経時変化を示す。なお、ＲｕｎＪにおいては微生物の存在は全く確認されず、無菌条件が保たれていた。ＲｕｎＨにおいてはＵＭ５株の接種直後の濃度は１０^8.5ＣＦＵ／ｇ－ｄｓであったが、コンポスト化１日経過後に１０⁸ＣＦＵ／ｇ－ｄｓまで減少した後、再び１０⁹ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ付近まで増加した。一方、ＩＰ１株の接種直後の濃度は１０⁷ＣＦＵ／ｇ－ｄｓだったが、コンポスト化初期に１０⁸ＣＦＵ／ｇ－ｄｓまで増加したものの、２日以降はＵＭ５株の菌体濃度が増加したことから希釈平板法ではＩＰ１株のコロニーを検出できなくなった。希釈平板法でＵＭ５株が１００個以上のコロニーが観察される寒天平板上でＩＰ１株は１個のコロニーも観察されなかったことから、ＩＰ１株はＵＭ５株の１／１００以下、すなわち１０⁷ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ以下に低下したものと考えられた。これらのＩＰ１株とＵＭ５株の菌体濃度変化は、最初に示した高温段階で酸分解が活発なコンポスト化において、バチルス・コアグランス（＃６）からゲオバチルス（＃２０）へと菌体濃度の高い微生物が遷移した結果とよく対応しているとみることができる。なお、ＲｕｎＩにおいてＩＰ１株の接種直後の濃度は１０⁷ＣＦＵ／ｇ－ｄｓであり、コンポスト化開始直後に一旦、僅かに減少するが、２日後に１０⁸ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ付近に増加、そして、最終的には１０⁶ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ付近の値に再び低下した。以上の結果、ＩＰ１株とＵＭ５株が高温条件下、協同して酢酸を分解することにより、酢酸の分解を加速すること、また、ＩＰ１株は有機酸分解にともなって菌体濃度が低下するがＵＭ５株は有機酸が消費し尽くされた後も高濃度を維持することが明らかとなった。

１フローメーター
２ＣＯ₂トラップ
３バブラー
４ゴム栓
５ステンレス製スクリーン
６Ｐｌｙｅｘガラス
７膜フィルター
８サンプリングバッグ
９インキュベーター

ＮＩＴＥＰ－０２９７５
ＮＩＴＥＰ－０２９７６

Claims

有機性廃棄物をコンポスト化するための好熱・好気性有機酸分解菌であって、該好熱・好気性有機酸分解菌が、
（ａ）配列番号３に示される１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を有するバチルス・コアグランス、及び
（ｂ）配列番号３に示される１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を有するバチルス・コアグランスと、配列番号４に示される１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を有するゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスとの組み合わせ
からなる群から選択される、上記好熱・好気性有機酸分解菌。
生育可能温度が２０～８０℃、生育至適温度が４０～７０℃の範囲にある、請求項１に記載の好熱・好気性有機酸分解菌。
バチルス・コアグランスが新規微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７５）である、請求項１又は２に記載の好熱・好気性有機酸分解菌。
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスが新規微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７６）である、請求項１又は２に記載の好熱・好気性有機酸分解菌。
好熱・好気性有機酸分解菌であって、受託番号ＮＩＴＥＰ－０２９７５として寄託されているバチルス・コアグランス株。
好熱・好気性有機酸分解菌であって、受託番号ＮＩＴＥＰ－０２９７６として寄託されているゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス株。
有機性廃棄物を少なくとも５日間コンポスト化する方法であって、
（ａ）配列番号３に示される１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を有するバチルス・コアグランス、及び
（ｂ）配列番号３に示される１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を有するバチルス・コアグランスと、配列番号４に示される１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を有するゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスとの組み合わせ
からなる群から選択される好熱・好気性有機酸分解菌を４０～７０℃のコンポスト化の過程において１０^５～１０^９ＣＦＵ／ｇ－ｄｓ（グラム乾燥物）の濃度で接種することを含み、ここで、上記（ｂ）の場合、前記バチルス・コアグランスと前記ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスが同時に又は逐次的に接種される、方法。
配列番号３に示される１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を有するバチルス・コアグランスと、配列番号４に示される１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を有するゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスを逐次的に接種するときに、配列番号３に示される１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を有するバチルス・コアグランスを接種したのち少なくとも１５分以上の任意の期間経過後に配列番号４に示される１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を有するゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスを接種する、請求項７に記載の方法。
好熱・好気性有機酸分解菌によってコンポスト化の過程における有機酸の分解を促進する、請求項７又は８に記載の方法。
好熱・好気性有機酸分解菌の生育可能温度が２０～８０℃、生育至適温度が４０～７０℃の範囲にある、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
バチルス・コアグランスが新規微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７５）である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスが新規微生物（ＮＩＴＥＰ－０２９７６）である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。