CN102367431A - 一种地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于γ-PGA发酵生产的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis P-104及其应用，于2010年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.4156。本发明的地衣芽孢杆菌P-104是从中国传统豆酱制品中筛选分离得到，生产周期短、生产效率高、生产成本低，利用本发明的菌株及其发酵方法，γ-聚谷氨酸的7L发酵罐产量达到32g/L，补料发酵产量可达到41.6g/L。本发明具有生产周期短、生产效率高、生产成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及γ-PGA高产菌株及其应用，即地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)P-104及其发酵生产γ-PGA的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸为单体，通过α-氨基和γ-羧基以肽键的形式缩合而成的同聚酰胺。γ-PGA多由微生物发酵产生，分子量通常为100-1000kDa(Buescher，J.M.and A.Margaritis.Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer and applications in thebiopharmaceutical，biomedical and food industries.Critical Reviews inBiotechnology，2007，27：1-19)，不同分子量的γ-PGA具有不同的用途。γ-PGA不仅具有良好的生物相容性和生物可降解性，还具有增稠性、乳化性、成膜性、成纤维性、保湿性、粘性等功能特性，其降解产物为对人体和环境无公害的谷氨酸，是一种对环境友好且具有优良性能的绿色高分子材料。广泛应用于医药领域作为药物载体以及结构材料、用于化妆品保湿添加剂、食品工业的增稠剂和抗冻剂、工业胶黏剂等等，具有极大的商业开发价值和应用前景。
目前，众多学者开展γ-聚谷氨酸高产菌的选育、代谢途径、发酵工艺、分离纯化工艺以及性质、应用的研究。发酵生产γ-PGA的菌种主要为芽胞杆菌属细菌，其中枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌研究最多。枯草芽孢杆菌的产量普遍较地衣芽孢杆菌高，但是因为容易受到噬菌体的侵染，造成损失，因此地衣芽孢杆菌更加受到关注。Cheng等采用B.licheniformis A35生产γ-PGA(Cheng C，Asada Y，Aaida T.Production of γ-polyglutamic acid by Bacillus licheniformis A35under denitrifying conditions.Agric.Biol.Chem.，1989，53：2369-2375)产量为8g/L，且存在发酵周期长、需要无机厌氧培养基、发酵产率低、产物分子量小等不足。为了解决这一问题，研究者公开了采用B.licheniformis ATCC 9945A生产聚γ-PGA的方法(US Patent 5378807，1995)。先后有众多研究者通过基因工程、培养基优化、培养条件控制等手段，使其产量有所提高，但使用B.licheniformis ATCC 9945A，产量一般在17-45g/L左右，且发酵时间一般为96h相对较长，且过程中需添加高浓度的甘油，故其生产成本高。B.licheniformisSAB-26的产量较高(Abdel-Fattah，Y.R.，N.A.Soliman，and M.M.Berekaa，Application of Box-Behnken Design for Optimization of Poly-γ-Glutamic AcidProduction by Bacillus licheniformis SAB-26.Research journal of microbiology，2007，2(9)：664-670)，能够达到产量59.9g/L，但是周期为72h也较长，且B.licheniformis SAB-26生产的γ-PGA分子量仅有70kDa-180kDa，不能够满足高分子量的需求。综上所述，地衣芽孢杆菌生产周期长、生产效率低、成本高。因此，筛选一株高效γ-PGA生产菌并开发低成本的生产工艺具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种生产周期短、生产效率高、生产成本低的菌株，以及用该菌株发酵生产γ-PGA的方法。
为了达到上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
本发明提供一种用于γ-PGA发酵生产的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)P-104，于2010年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.4156。
本发明所提供的菌株P-104细胞呈直杆状，革兰氏染色阳性。在LB固体培养基上菌落圆形，干燥，不透明，蔓延，边缘不齐，毛发状。最适生长温度30-37℃，适宜pH 6.8-7.2。接触酶试验阳性，硝酸盐试验阳性，柠檬酸盐试验阳性，明胶液化试验阳性。
本发明所提供菌株P-104的16S rRNA基因序列有1382个碱基，测得的16SrRNA序列通过MEG.4软件进行系统进化树的构建，进化树显示该菌株属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。综合形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rRNA基因分子鉴定结果，该菌株被鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
本发明同时提供了一种用B.licheniformis P-104生产γ-PGA的方法。包括以下步骤：
a、采用地衣芽孢杆菌P-104、保藏编号为CGMCC No.4156的菌株作为生产菌株；
b、将上述菌株接在LB培养基固体斜面上培养8-14h；刮取菌苔至无菌甘油保藏管中；在冷冻条件下保藏，冷冻温度不高于-70℃；
c、制备种子液：
(1)将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，培养至少24-36h，使其活化；
(2)将上述活化的种子转接到LB液体种子培养基中，培养至对数生长中期；
d、发酵培养：
(1)配置发酵培养基：每1L培养基加入谷氨酸钠10-100g；碳源10-100g；无机氮源3-20g；K2HPO4·3H2O 0.1-2g；MgSO4·7H2O 0.1-2g；柠檬酸钠2-10g；MnSO40.01-0.2g；补充蒸馏水至1000mL，调节pH 6.0-7.5；
(2)将上述发酵培养基投入摇瓶或发酵罐中，高压蒸汽灭菌至少20min后，冷却至30-37℃，按1-5％的接种量接入种子液，培养24-48h；
e、提取：将d中得到的菌株培养液离心除去菌体、收集上清液，并用乙醇或异丙醇沉淀、回收γ-PGA。
制备种子液步骤(2)时培养8-16h至对数生长中期。
摇瓶培养是在三角瓶中装入一定量的培养基配上瓶塞，经灭菌后接种，在摇瓶上进行恒温振荡培养。摇瓶培养依赖摇动振荡使培养基液面与上方空气不断接触，供给微生物生长所需的溶氧量。本发明采用摇瓶培养时，按50-100mL/500mL三角瓶的装液量投入发酵培养基。
发酵罐，指工业上用来进行微生物发酵的装置。其主体一般为用不锈钢板制成的主式圆筒，其容积在1m3至数百m3。在设计和加工中应注意结构严密，合理。能耐受蒸汽灭菌、有一定操作弹性、内部附件尽量减少(避免死角)、物料与能量传递性能强，并可进行一定调节以便于清洗、减少污染，适合于多种产品的生产以及减少能量消耗。发酵罐是一种对物料进行机械搅拌与发酵的设备。该设备采用内循环方式，用搅拌桨分散和打碎气泡，它溶氧速率高，混合效果好。罐体采用SUS304或316L进口不锈钢，罐内配有自动喷淋清洗机头，确保生产过程符合GMP要求。本发明采用发酵罐培养时，按发酵罐容积的40-80％投入发酵培养基，搅拌速度为200-600rpm，通气量为0.5-2vvm。在发酵罐培养过程中可以进行补料；补料方式优选加入葡萄糖。补料发酵可以解除底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻退等问题，得到较高的转化率、染菌和退化的概率小、对发酵过程可实现优化控制等优点。深层发酵是指在发酵过程中从发酵底部通入无菌空气并搅拌，使空气与发酵液的接触面积极大提高。从而大幅度提高氧气含量。本发明使用发酵罐时为深层发酵，能够有效提高转化率。
LB培养基是一种培养基的名称，生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用要求。培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌。通过培养工程菌，我们可以表达大量的外源蛋白，也可以拿到带有外源基因的质粒，工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础。本发明所述LB固体培养基含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl10g/L、琼脂18g/L，pH 7.0；LB液体种子培养基含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。
本发明所述发酵培养基成分还包括NaNO32-10g；CaCl2·2H2O 0.1-2g，添加NaNO3和CaCl2·2H2O的发酵培养基培养效果更好；谷氨酸钠的含量为30-100g/L；优选地，无机氮源为硫酸铵、氯化铵或硝酸钠中的一种或几种，例如硫酸铵、硝酸钠、或同时添加硫酸铵和硝酸钠作为氮源；含量为5-20g/L；优选地，碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉或淀粉水解液，例如葡萄糖、蔗糖、同时添加葡萄糖和淀粉作为碳源；含量为30-100g/L。
本发明各步骤所述的培养优选在30-37℃下进行。
高压蒸汽灭菌法(autoclaving)可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。方法是将需灭菌的物品放在高压锅(autoclave)内，加热时蒸汽不外溢，高压锅内温度随着蒸汽压的增加而升高。在103.4kPa(1.05kg/cm2)蒸汽压下，温度达到121.3℃，维持15～20分钟。适用于普通培养基、生理盐水、手术器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的灭菌。本发明所述高压蒸汽灭菌优选在115℃下灭菌30min。
本发明所提供的B.licheniformis P-104在用于生产γ-PGA时，性能明显优于已报道B.licheniformis菌株，主要体现在发酵周期短，生产效率高：采用本发明菌株B.licheniformis P-104，在7L发酵罐中间歇发酵生产γ-PGA，发酵周期为24-36h，γ-PGA产量可达到40g/L以上。
附图说明
附图1；γ-PGA紫外扫描图谱；
附图2：γ-PGA红外吸收图谱；
附图3：菌株P-104的扫描电镜图片；
附图4：菌株P-104的16S rRNA系统进化树；
附图5：B.licheniformis P-104发酵生产聚合物产物水解样品的HPLC分析图谱，保留时间为2.74min的峰与谷氨酸标准样品保留时间相同。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的权利范围以权利要求书为准。
具体实施方式
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
本发明提供一种用于γ-PGA发酵生产的地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis P-104，于2010年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.4156。
实施例1：本发明菌株的分离、筛选
选取国内生产的多种豆豉酱，各取1g于灭菌试管中，加无菌水9mL，用棉塞封口，振荡2min，然后放入水浴锅中，70℃加热10min，再静置30min。冷却后，吸取上清液0.1mL，稀释102和103倍，分别取0.2mL，涂布LB平板(谷氨酸钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH7.2)，37℃培养48h观察结果，挑选在LB培养基上呈乳液状能拉丝的单菌落，接入新鲜LB液体种子培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2)中，37℃摇床培养12h后，按2％的接种量分别接种到装有50mL灭菌基本发酵培养基的250mL摇瓶(谷氨酸钠50g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸钠12g/L，氯化铵7g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O0.15g/L，MnSO4·H2O 0.104g/L，pH7.2)中，37℃，180rpm，振荡培养36h结束发酵。对发酵产物分别取样离心除去菌体，用3倍乙醇沉淀上清液，轻轻振荡后4000rpm离心15min，收集沉淀物，冷冻干燥，再加入蒸馏水溶解沉淀物，透析去除离子，利用HPLC检测产物。
实施例2：本发明菌株的鉴定
生理生化鉴定
本发明所提供的地衣芽孢杆菌菌株菌体直杆状，革兰氏染色阳性。在LB固体培养基上菌落圆形，干燥，不透明，蔓延，边缘不齐，毛发状。最适生长温度30-37℃，适宜pH 6.8-7.2。接触酶试验阳性，硝酸盐试验阳性，柠檬酸盐试验阳性，明胶液化试验阳性。
利用16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定
菌株P-104总DNA通过细菌基因组抽提试剂盒抽提，16S rRNA基因PCR扩增采用通用引物(27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和(1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT)进行。PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，28个循环；72℃延伸10min。基因测序通过ABI Prism 370自动测序仪完成。测序结果显示该菌株的16S rRNA基因序列有1382个碱基，通过MEG.4软件进行系统进化树的构建，进化树显示菌株LSSE-62属于地衣芽胞杆菌。结合16S rRNA分子鉴定与前面的形态学和生理生化鉴定结果，鉴定P-104为芽胞杆菌属地衣芽胞杆菌。
实施例3：采用本发明菌株P-104所生产高分子产物的定性定量分析
采用紫外光谱扫描和红外光谱分析，通过与γ-PGA标准品光谱图比较，表明菌株P-104发酵所得高分子产物为γ-PGA。
对本发明菌株P-104所生产的高分子产物在酸性条件下水解，对水解产物采用HPLC进行定性和定量分析，所用色谱柱为Brava C18-BDS，流动相为10mmol/LKH2PO4加5.0％甲醇(用磷酸调pH值至2.5，过滤，超声波脱气)，流速为1mL/min，紫外检测波长为210nm，谷氨酸标准品作为定性和定量的标准物。γ-PGA浓度＝水解后谷氨酸浓度×129/147。
实施例4：γ-PGA发酵生产
(1)用冷冻保藏的本发明菌株P-104作为生产菌株；
(2)将冷冻保藏的菌株P-104，接种到LB培养基固体斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L、pH 7.0)，37℃培养8h，刮取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中；-70℃冷冻保藏；
(3)种子液培养：
将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养24h，使其活化；将活化的种子转接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，37℃，200rpm培养16h至对数生长中期；
(4)摇瓶发酵培养
按照每1L培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠70g；葡萄糖80g；柠檬酸钠10g；硫酸铵10g；K2HPO4·3H2O 0.6g；MgSO4·7H2O 0.6g；MnSO40.15g；补充蒸馏水至1000mL，pH 7.5，配制100mL发酵液分装500mL三角瓶，在115℃下，高压蒸汽灭菌30min，冷却至37℃，按照1％的接种量接入种子液，摇床转速180rpm，发酵温度37℃，发酵至36h结束发酵；
(5)将上述菌株培养液离心除去菌体、收集上清液，用95％的乙醇沉淀、回收γ-PGA。
(6)检测分析所得到的γ-谷氨酸的浓度为44.7g/L。
实施例5：γ-谷氨酸的发酵生产
(1)用冷冻保藏的本发明菌株P-104作为生产菌株；
(2)将冷冻保藏的菌株P-104，接种到LB固体斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L、pH 7.0)，30℃培养14h，刮取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中；-80℃冷冻保藏；
(3)种子液培养：
将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，30℃培养36h，使其活化；将活化的种子转接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，35℃，200rpm培养14h至对数生长中期；
(4)发酵罐发酵培养
按照每1L培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠70g；葡萄糖80g；柠檬酸钠10g；硫酸铵10g；K2HPO4·3H2O 0.6g；MgSO4·7H2O 0.8g；MnSO40.15g；NaNO32g，补充蒸馏水至1000mL，pH 7.5，配制3L发酵液分装7L发酵罐，以115℃高压蒸汽灭菌维持30min，冷却至37℃按照3％的接种量接入种子液，搅拌速度为600rpm，通风量0.5vvm，发酵温度37℃，发酵至36h结束发酵。
(5)将上述菌株培养液离心除去菌体、收集上清液，用异丙醇沉淀、回收γ-PGA。
(6)检测分析所得到的γ-谷氨酸的浓度为32g/L。
实施例6：γ-谷氨酸的发酵生产
(1)用冷冻保藏的本发明菌株P-104作为生产菌株；
(2)将冷冻保藏的菌株P-104，接种到LB固体斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L、pH7.0)，33℃培养10h，刮取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中；-100℃冷冻保藏；
(3)种子液培养：
将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，34℃培养30h，使其活化；将活化的种子转接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，30℃，200rpm培养15h至对数生长中期；
(4)发酵罐发酵培养
按照每1L培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠70g；葡萄糖80g；柠檬酸10g；硫酸铵10g；K2HPO4·3H2O 0.6g；MgSO4·7H2O 0.8g；MnSO40.15g；NaNO34g；CaCl2·2H2O 0.1g，补充蒸馏水至1000mL，pH 7.0，配制3L发酵液分装6.6L发酵罐，以115℃高压蒸汽灭菌维持31分钟，冷却至30℃按照5％的接种量接入种子液，搅拌速度为400rpm，通风量2vvm，发酵温度37℃，发酵至21h时加入40g/L葡萄糖120ml，继续发酵至36h结束发酵。
(5)将上述菌株培养液离心除去菌体、收集上清液，用95％的乙醇沉淀、回收γ-PGA。
(6)检测分析所得到的γ-谷氨酸的浓度为41.6g/L。
实施例7：γ-PGA发酵生产
(1)用冷冻保藏的本发明菌株P-104作为生产菌株；
(2)将冷冻保藏的菌株P-104，接种到LB固体斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L、pH 7.0)，32℃培养11h，刮取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中；-70.5℃冷冻保藏；
(3)种子液培养：
将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养28h，使其活化；将活化的种子转接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，37℃，200rpm培养8h至对数生长中期；
(4)摇瓶发酵培养
按照每1L培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠10g；葡萄糖和淀粉100g；柠檬酸钠5g；硫酸铵和氯化铵20g；K2HPO4·3H2O 0.1g；MgSO4·7H2O 2g；MnSO40.01g；补充蒸馏水至1000mL，pH 6.0，配制50mL发酵液分装500mL三角瓶，在115℃下，高压蒸汽灭菌50min，冷却至37℃，按照5％的接种量接入种子液，摇床转速230rpm，发酵温度37℃，发酵至24h结束发酵；
(5)将上述菌株培养液离心除去菌体、收集上清液，用异丙醇沉淀、回收γ-PGA。
(6)检测分析所得到的γ-谷氨酸的浓度为38.2g/L。
实施例8：γ-谷氨酸的发酵生产
(1)用冷冻保藏的本发明菌株P-104作为生产菌株；
(2)将冷冻保藏的菌株P-104，接种到LB固体斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L、pH7.0)，30℃培养8h，刮取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中；-120℃冷冻保藏；
(3)种子液培养：
将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养30h，使其活化；将活化的种子转接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，30℃，200rpm培养15h至对数生长中期；
(4)发酵罐发酵培养
按照每1L培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠100g；葡萄糖10g；柠檬酸钠10g；硫酸铵3g；K2HPO4·3H2O 2g；MgSO4·7H2O0.1g；MnSO40.15g；NaNO310g；CaCl2·2H2O2g，补充蒸馏水至1000mL，pH7.0，配制2.4L发酵液分装3L发酵罐，以115℃高压蒸汽灭菌维持20分钟，冷却至30℃按照2％的接种量接入种子液，搅拌速度为200rpm，通风量1.2vvm，发酵温度37℃，发酵至25h时加入40g/L葡萄糖120ml，继续发酵至48h结束发酵。
(5)将上述菌株培养液离心除去菌体、收集上清液，用95％的乙醇沉淀、回收γ-PGA。
(6)检测分析所得到的γ-谷氨酸的浓度为40.0g/L。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的具体操作步骤，但本发明并不局限于上述操作步骤，即不意味着本发明必须依赖上述具体操作步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用于γ-PGA发酵生产的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)P-104，于2010年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4156。
2.一种如权利要求1所述地衣芽孢杆菌P-104在合成γ-PGA中的应用。
3.一种如权利要求1所述地衣芽孢杆菌P-104合成制备γ-PGA的方法，包括以下步骤：
a、采用地衣芽孢杆菌P-104、保藏编号为CGMCC No.4156的菌株作为生产菌株；
b、将上述菌株接在LB培养基固体斜面上培养8-14h；刮取菌苔至无菌甘油保藏管中；在不高于-70℃冷冻条件下保藏；
c、制备种子液：
(1)将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，培养至少24-36h，使其活化；
(2)将上述活化的种子转接到LB液体种子培养基中，培养至对数生长中期；
d、发酵培养：
(1)配置发酵培养基：每1L培养基加入谷氨酸钠10-100g；碳源10-100g；无机氮源3-20g；K2HPO4·3H2O 0.1-2g；MgSO4·7H2O 0.1-2g；柠檬酸钠2-10g；MnSO40.01-0.2g；补充蒸馏水至1000mL，调节pH 6.0-7.5；
(2)将上述发酵培养基投入摇瓶或发酵罐中，高压蒸汽灭菌至少20min后，冷却至30-37℃，按1-5％的接种量接入种子液，培养24-48h；
e、提取：将d中得到的菌株培养液离心除去菌体、收集上清液，并用乙醇或异丙醇沉淀、回收γ-PGA。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，制备种子液步骤(2)时培养8-16h至对数生长中期。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，摇瓶培养时，按50-100mL/500mL三角瓶的装液量投入发酵培养基。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵罐培养时，按发酵罐容积的40-80％投入发酵培养基，搅拌速度为200-600rpm，通气量为0.5-2vvm。
7.如权利要求3-6之一所述的方法，其特征在于，在发酵罐培养过程中进行补料；补料方式优选加入葡萄糖。
8.如权利要求3-7之一所述的方法，其特征在于，所述LB固体培养基含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L，pH7.0；LB液体种子培养基含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L，pH7.0。
9.如权利要求3-8之一所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分还包括NaNO3、CaCl2·2H2O；
所述谷氨酸钠的含量优选30-100g/L；
优选地，无机氮源为硫酸铵、氯化铵或硝酸钠中的一种或几种；含量为5-20g/L；
优选地，碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉或淀粉水解液中的一种或几种；含量为30-100g/L。
10.如权利要求3-9之一所述的方法，其特征在于，各步骤所述的培养优选在30-37℃条件下进行；所述高压蒸汽灭菌优选在115℃下灭菌30min。
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