CN102943056B - 一种地衣芽孢杆菌及多阶段发酵的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地衣芽孢杆菌及多阶段发酵的方法，属于发酵工程技术领域；所述的地衣芽孢杆菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacillus licheniformis，参据的微生物：NJWGYH 833051，保藏日期是2012年5月25日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.6155。该方法主要包括：种子的活化、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制过程、分批补料发酵阶段，以多阶段发酵生产地衣芽孢杆菌，使其菌体活力得到了大幅度提高。本发明操作简单，成本低，地衣芽孢杆菌菌体活力较高，有利于实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种高活力地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis CGMCC No.6155。
背景技术
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis）是芽孢杆菌属的一种，属于革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤、空气和其它自然环境中，具有丰富多样的生理生化特性,作为土壤和植物微生态优势种群，地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中极具应用潜力的菌种之一。目前，地衣芽孢杆菌在农作物病害防治方面的研究，在我国处于起步阶段，发展空间相当广阔。地衣芽孢杆菌可产生小分子细菌素、溶菌酶、抗菌蛋白以及多种抗生素(包括氨基酸类、磷脂类、脂肽类、多烯类、肽类、核酸类物质)等，可以抑制多种动、植物及人类病原菌。地衣芽孢杆菌为“公认安全(GRAS)”的细菌，因此可以被广泛应用于农药、医药、食品、饲料加工、环境污染治理等各领域
地衣芽孢杆菌作为微生态制剂，主要是通过其所含活菌的积极生命活动而达到调节宿主微生态平衡的，因此，其制剂中活菌含量的高低是评定产品质量的一项关键指标。地衣芽孢杆菌制剂的抑菌机理，主要是通过所含活菌的生理与代谢活动而产生多种抗菌物质实现对有害菌的有效抑制，因此评定生物制剂产品质量的一项关键指标就是活菌含量的高低。地衣杆菌微生态制剂作为生物农药发挥主要作用的是其芽孢，尽管芽孢杆菌以内生孢子的形式存在，且对加工、运输过程中的干燥、高温、高压、氧化等不良环境因素的抵抗能力强、稳定性高，但目前地衣杆菌制剂仍普遍存在加工和运输过程中以及有效期内活菌含量降低、货架期短等问题。如能建立起一套系统的多阶段发酵生产地衣芽孢杆菌的方法，特别对加工及贮存过程中地衣芽孢杆菌活力的保持进行深入研究，将可以为其它微生态制剂的发酵生产提供模板。
发明内容
本发明目的在于提供一种地衣芽孢杆菌；同时提供了利用上述地衣芽孢杆菌多阶段发酵的方法。
本发明的技术方案为：一种地衣芽孢杆菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacillus licheniformis，参据的微生物：NJWGYH 833051，保藏日期是2012年5月25日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.6155。
本发明还提供了利用上述的地衣芽孢杆菌进行多阶段发酵的方法；其具体步骤如下：利用地衣芽孢杆菌来培养发酵种子液；将发酵培养基进行接种前准备、灭菌；然后将发酵种子液按发酵培养基体积的3-9%的比例接种到灭菌的发酵培养基中，通过控制葡萄糖的浓度进行有氧多阶段发酵，得到地衣芽孢杆菌的菌体。
优选所述的培养发酵种子液为从营养琼脂培养基上挑取1个地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis单菌落接到含有种子培养基的锥形瓶中，种子培养基的体积为锥形瓶体积的10-20%，在温度维持在30-40℃，pH为6.0-8.0，转速为150-220rpm的摇床中培养10-20h，即为发酵种子培养液。
优选所述的种子培养基成分为：葡萄糖5.0-20.0g/L，蛋白胨5.0-15.0g/L，牛肉膏3.0-8.0g/L，NaCl 3.0-8.0g/L。
上述的发酵培养基接种前准备为：将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀后，倒入发酵罐中，发酵培养基的装液量为发酵罐体积的30%-60%，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0%；其中所述的发酵培养基的组分：葡萄糖5.0-20.0g/L，蛋白胨5.0-15.0g/L，酵母膏3.0-8.0g/L，牛肉膏3.0-8.0g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2.5g/L，NaCl 3.0-8.0g/L，CaCO3 1.0-5.0g/L，K2HPO4 0.5-2.5g/L。
优选上述的接种过程中发酵培养基的培养温度30-40℃，控制pH6.0-8.0；调节好转速、空气流量及罐压以校正溶氧DO 100%；所述的有氧多阶段发酵为：发酵过程的前3~20h为菌体生长阶段，通气量为10-15L/min，搅拌速度为300-400rpm，溶氧水平DO控制在50-100%；发酵过程的20-35h是芽孢形成阶段，当细胞光密度达到25-30时，调节空气流量为16.0-20.0L/min，搅拌速度为200-300rpm，溶解氧水平控制在10-30%。
优选在有氧多阶段发酵过程中，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2.5-3.5g/L范围内发酵8-16h；其中流加底物组成为：葡萄糖250-350g/L，牛肉膏100-200g/L，KH2PO4 5-10g/L。
上述地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis参据的微生物NJWGYH 833051是由本实验室自己分离得到。
初筛得到23株菌；经摇瓶复筛，进行产酶试验、生物好氧实验、抑菌试验，获得一株菌，通过生理生化特性实验和16S rDNA序列相似性分析，获得一株分类鉴定命名为地衣芽孢杆菌，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.6155。以此菌种作为生产菌株。
CGMCC No.6155菌株具有下述性质：
1、培养特征：
该菌落在营养琼脂上37℃培养24h，形成圆形凸起菌落，菌落边缘整齐，有光泽，呈乳白色、微透明，菌落表面偏光滑。
2、菌体及芽孢的形态特征：
在营养琼脂培养基平板上37℃培养，16-25h形成脱落的芽孢，到25-35h芽孢大部分脱落。菌体呈链状杆菌，菌体大小约为0.8um×2.0um，椭圆形或柱状芽孢，芽孢位于杆菌中心或偏中生。
3、生理生化性质：
表1 CGMCC No.6155菌株的生理生化性质
+：为可利用；-：为不可利用
有益效果：
采用本发明的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.6155多阶段发酵的方法，经过种子的活化、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段，实现了地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.6155的多阶段培养，使Bacillus licheniformis CGMCC No.6155活力大幅度提高。本发明操作简单，成本低，地衣芽孢杆菌活力较高，有利于实现工业化生产。
保藏信息
上述地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.6155是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCCNo.6155，保藏日期是：2012年5月25日。
具体实施方式
本发明提供一种地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.6155多阶段发酵方法，下面列举实施例予以进一步说明。
实例一：
①种子的培养
从营养琼脂培养基上挑取1个地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCCNo.6155单菌落接种到装液50mL种子培养基的500mL摇瓶中，pH为6.0，温度30℃，转速为150rpm的摇床中培养10h，得到发酵种子培养液。其种子培养基组成为：葡萄糖5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl 3.0g/L。
②接种前准备
首先将发酵罐清洗干净，组装好温度计，pH计（已校正）和泡沫传感器，将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0%，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。
其发酵培养基的组成为：葡萄糖5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母膏3.0g/L，牛肉膏3.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 3.0g/L，CaCO3 1.0g/L，K2HPO4 0.5g/L。
③接种
在酒精灯火焰的保护下，以按发酵培养基体积的3%的接种量将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.6155种子液接种于3L自动控制发酵罐中，发酵培养基的装液量1.5L，空气流量10L/min，培养温度30℃，搅拌转速为300r/min，校正溶氧100%，自动流加盐酸控制pH 6.5±0.5，调节好转速、空气流量及罐压。
④多阶段溶氧控制
地衣芽孢杆菌发酵过程分为菌体生长和芽孢形成两个阶段。菌体生长阶段为发酵过程的前10h，这一阶段需要大量氧，初始空气流量为10L/min，搅拌速度为300rpm，溶氧水平DO控制在50-100%；芽孢形成阶段位于发酵过程的20-35h，当细胞光密度（OD600）水平达到25时，发酵液粘度较高，氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加溶氧量会对菌体造成机械损伤，经过加大空气流量与降低搅拌速度相结合的方式有利于解决此问题。此阶段调节空气流量为16.0L/min，搅拌速度为200rpm，溶解氧水平控制在10-30%。
⑤分批补料发酵
菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期。此阶段营养物质不断被消耗，葡萄糖浓度低于2.5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2.5-3.5g/L范围内发酵8h。
其流加底物组成为：葡萄糖250g/L，牛肉膏100g/L，KH2PO4 5g/L。
最终测得地衣芽孢杆菌活菌数为4.8×109cfu/mL。
实例二：
①种子的培养
从营养琼脂培养基上挑取1个地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCCNo.6155单菌落到装液70mL种子培养基的500mL摇瓶中，在温度37℃，pH为7.0，转速为180rpm的摇床中培养15h，得到发酵种子培养液。
其种子培养基组成为：葡萄糖12.5g/L，蛋白胨8.0g/L，牛肉膏5.0g/L，NaCl 5.0g/L。
②接种前准备
首先将发酵罐清洗干净，组装好温度计，pH计（已校正）和泡沫传感器，将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0%，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。
其发酵培养基的组成为：葡萄糖12.5g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，牛肉膏5.0g/L,KH2PO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，NaCl 5.0g/L，CaCO3 3.0g/L，K2HPO4 1.5g/L。
③接种
在酒精灯火焰的保护下，以按发酵培养基体积的6%的接种量将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.6155种子液接种于3L自动控制发酵罐中，装液量1.0L，空气流量13L/min，培养温度37℃，搅拌转速为350r/min，校正溶氧100%，自动流加盐酸控制pH 7.0±0.5，调节好转速、空气流量及罐压。
④多阶段溶氧控制
地衣芽孢杆菌发酵过程分为菌体生长和芽孢形成两个阶段。菌体生长阶段为发酵过程的前15h，这一阶段需要大量氧，初始空气流量为13L/min，搅拌速度为350rpm，溶氧水平DO控制在50-100%；芽孢形成阶段位于发酵过程的20-35h，当细胞光密度（OD600）水平达到28时发酵液粘度较高，氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加溶氧量会对菌丝体造成机械损伤，经过加大空气流量与降低搅拌速度相结合的方式有利于解决此问题。此阶段调节空气流量为18.0L/min，搅拌速度为250rpm，溶解氧水平控制在10-30%。
⑤分批补料发酵
菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期。此阶段营养物质不断被消耗，葡萄糖浓度低于2.5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2.5-3.5g/L范围内发酵12h。
其流加底物组成为：葡萄糖300g/L，牛肉膏150g/L，KH2PO4 8g/L。
最终测得地衣芽孢杆菌活菌数为5.0×1010cfu/mL。
实例三：
①种子的培养
从营养琼脂培养基上挑取1个地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCCNo.6155单菌落到装液100mL一级种子培养基的500mL摇瓶中，在温度40℃，pH为8.0，转速为220rpm的摇床中培养20h，得到发酵种子培养液。
其种子培养基组成为（g/L）：葡萄糖20.0，蛋白胨15.0，牛肉膏8.0，NaCl 8.0。
②接种前准备
首先将发酵罐清洗干净，组装好温度计，pH计（已校正）和泡沫传感器，将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0%，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。
其发酵培养基的组成为：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨15.0g/L，酵母膏8.0g/L，牛肉膏8.0g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，NaCl 8.0g/L，CaCO3 5.0g/L，K2HPO4 2.5g/L。
③接种
在酒精灯火焰的保护下，以按发酵培养基体积的9%的接种量将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.6155种子液接种于3L自动控制发酵罐中，装液量1.8L，空气流量15L/min，培养温度40℃，搅拌转速为400r/min，校正溶氧100%，自动流加盐酸控制pH 7.5±0.5，调节好转速、空气流量及罐压。
④多阶段溶氧控制
地衣芽孢杆菌发酵过程分为菌体生长和芽孢形成两个阶段。菌体生长阶段为发酵过程的前20h，这一阶段需要大量氧，初始空气流量为15L/min，搅拌速度为400rpm，溶氧水平DO控制在50-100%；芽孢形成阶段位于发酵过程的20-35h，当细胞光密度（OD600）水平达到30时，发酵液粘度较高，氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加溶氧量会对菌体造成机械损伤，经过加大空气流量与降低搅拌速度相结合的方式有利于解决此问题。此阶段调节空气流量为20L/min，搅拌速度为300rpm，溶解氧水平控制在10-30%。
⑤分批补料发酵
菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期。当营养物质的不断消耗，葡萄糖浓度低于2.5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2.5-3.5g/L范围内发酵15h。
其流加底物组成为：葡萄糖350g/L，牛肉膏200g/L，KH2PO4 10g/L。
最终测得地衣芽孢杆菌活菌数为3.0×109cfu/mL。
本发明用于地衣芽孢杆菌生产，具有广阔的应用前景。通过开发地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.6155多阶段发酵生产工艺，操作简单，降低了生产成本、使菌体活力得到了大幅度的提高，有利于实现工业化生产。
Claims (7)
1.一种地衣芽孢杆菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacilluslicheniformis，保藏日期是2012年5月25日，保藏中心登记入册编号是CGMCCNo.6155。
2.一种利用如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌进行多阶段发酵的方法；其具体步骤如下：利用地衣芽孢杆菌来培养发酵种子液；将发酵培养基进行接种前准备、灭菌；然后将发酵种子液按发酵培养基体积的3-9%的比例接种到灭菌的发酵培养基中，通过控制葡萄糖的浓度进行有氧多阶段发酵，得到地衣芽孢杆菌的菌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的培养发酵种子液为从营养琼脂培养基上挑取1个地衣芽孢杆菌单菌落接到含有种子培养基的锥形瓶中，种子培养基的体积为锥形瓶体积的10-20%，在温度维持在30-40℃，pH为6.0-8.0，转速为150-220rpm的摇床中培养10-20h，即为发酵种子液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的种子培养基成分为：葡萄糖5.0-20.0g/L，蛋白胨5.0-15.0g/L，牛肉膏3.0-8.0g/L，NaCl3.0-8.0g/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基接种前准备为：将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀后，倒入发酵罐中，发酵培养基的装液量为发酵罐体积的30%-60%，通入冷却水，校正溶解氧DO为0%；其中所述的发酵培养基的组分：葡萄糖5.0-20.0g/L，蛋白胨5.0-15.0g/L，酵母膏3.0-8.0g/L，牛肉膏3.0-8.0g/L，KH2PO41-5g/L，MgSO4·7H2O0.5-2.5g/L，NaCl3.0-8.0g/L，CaCO31.0-5.0g/L，K2HPO40.5-2.5g/L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的接种过程中发酵培养基的培养温度30-40℃，控制pH6.0-8.0；调节好转速、空气流量及罐压以校正溶氧DO100%；所述的有氧多阶段发酵为：发酵过程的前3～20h为菌体生长阶段，通气量为10-15L/min，搅拌速度为300-400rpm，溶氧水平DO控制在50-100%；发酵过程的20-35h是芽孢形成阶段，当细胞光密度OD600达到25-30时，调节空气流量为16.0-20.0L/min，搅拌速度为200-300rpm，溶解氧水平控制在10-30%。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于有氧多阶段发酵过程中，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2.5-3.5g/L范围内发酵8-16h；其中流加底物组成为：葡萄糖250-350g/L，牛肉膏100-200g/L，KH2PO45-10g/L。
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