CN102093974B - 一种蜡样芽孢杆菌及其多阶段发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌；其分类命名为蜡样芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacillus cereus，参据的微生物：NJYH 63305，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4348。本发明还提供了蜡样芽孢杆菌进行多阶段发酵生产的方法。该方法包括：种子的培养、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段，以多阶段发酵生产蜡样芽孢杆菌，使其活力得到大幅度提高。本发明成本低，操作简易，蜡样芽孢杆菌活力较高，有利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种高活力蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCCNo.4348。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界，常存在于空气、尘埃、土壤、水、动植物中，有时正常人的肠道中也能检出。蜡样芽孢杆菌可单独制成微生态制剂，用于胃肠道疾病的防治、降血脂、抗衰老、防止细菌移位、抗肿瘤及自身免疫性疾病防治，如能效改善肝硬化患者肠道菌群失调，并可降低血清LBP浓度，可以作为肝硬化患者的辅助治疗措施。还可以和其他菌、试剂复配，如核黄素与蜡样芽孢杆菌复配，不但可以为严重烧伤病人提供大量核黄素，还能更有效的保护肠道黏膜应激性损害。在畜禽养殖业和水产养殖业种，蜡样芽孢杆菌作为饲料添加剂得到广泛的应用。在仔猪饲料中加入蜡样芽孢杆菌饲料添加剂能提高仔猪的机体免疫能力，降低仔猪下痢发病率，同时能促进仔猪生长；使用含蜡样芽孢杆菌制剂的饲料同样能提高鱼虾贝类等的产率、增重率，降低发病率和死亡率。
蜡样芽孢杆菌作为微生态制剂，主要是通过其所含活菌的积极生命活动而达到调节宿主微生态平衡的，因此其制剂中活菌含量的高低是评定产品质量的一项关键指标。液态微生态制剂在贮存及保藏过程中存在体积与重量大等种种不利因素，所以产品需要经过进一步的加工处理(离心、干燥、制粒或胶囊化等)，同时菌体需能适应消化系统复杂的环境条件，能进行新陈代谢活动。针对当前蜡样芽孢杆菌制剂普遍存在产品有效期不长、货架期短的问题，如能建立起一套系统的多阶段发酵生产蜡样芽孢杆菌的方法，特别对加工及贮存过程中蜡样芽孢杆菌活力的保持进行深入研究，为其他微生态制剂的发酵生产提供模板。
发明内容
本发明目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌；本发明的另一目的还提供了多阶段发酵方法在蜡样芽孢杆菌培养中的应用。
本发明的技术方案为：一种蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacillus cereus，参据的微生物：NJYH63305，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4348。
本发明还提供了多阶段发酵方法在蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348培养中的应用。
一种利用上述的蜡样芽孢杆菌，多阶段发酵生产的方法，其具体步骤如下：利用蜡样芽孢杆菌培养发酵种子液；将发酵培养基进行接种前准备灭菌；然后将发酵种子液按发酵培养基体积的2-10％比例接种于发酵培养基中，通过控制葡萄糖的浓度进行有氧多阶段发酵，得到蜡样芽孢杆菌的菌体。
所述的发酵种子液为从肉汤培养基上挑1-2个蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus菌落到装种子培养基的三角瓶中(装液量为三角瓶体积的10-20％)，在温度30-40℃，pH为6.5-8.5，转速为160-200rpm的摇床中培养10-20h，得到种子培养液。
上述的种子培养基组成为(g/L)：蛋白胨5.0-10.0，酵母膏3.0-8.0，NaCl 3.0-8.0，葡萄糖5.0-20.0。
所述的发酵培养基接种前准备为：将发酵培养基溶于60-80℃热水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％；其中所述的发酵培养基的组分(g/L)：蛋白胨5.0-15.0，酵母膏3.0-8.0，NaCl 3.0-8.0，葡萄糖5.0-20.0，KH2PO4 1-5，MgSO4·7H2O0.1-1.5，CaCO3 1.0-5.0，FeSO4·7H2O 0.005-0.025，ZnSO4·7H2O 0.005-0.025，MnCl2·4H2O0.001-0.005，CoCl2·6H2O 0.001-0.005。
所述的接种过程中发酵培养基的培养温度30-40℃，控制pH6.5-8.5，调节好转速、空气流量及罐压以校正溶氧DO达100％；所述的有氧多阶段发酵为：发酵过程的前4～18h为菌体生长阶段，空气流量为10-15L/min，搅拌速度为300-400rpm，溶氧水平DO控制在50-100％；位于发酵过程的18h之后是芽孢形成阶段，当细胞光密度(OD600)水平达到25-32时，转入微氧发酵阶段，调节空气流量为16.0-20.0L/min，搅拌速度为200-300rpm，溶解氧水平控制在20-30％。
在有氧多阶段发酵过程中，当葡萄糖浓度低于2g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2-3g/L范围内发酵8-15h；其中流加底物组成为(g/L)：葡萄糖250-350，酵母膏100-200，KH2PO4 5-10。
上述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus参据的微生物NJYH 63305是由本实验室从南京郊区三月龄健康家养鸡肠道中分离得到。
80℃预处理肠道内容物30min；人工胃液、人工肠液处理、胆碱盐实验初筛得到18株菌；经摇瓶复筛，进行耐受高铜试验、生物好氧实验、抑菌试验，获得一株菌，通过生理生化特性实验和16S rDNA序列相似性分析，获得一株分类鉴定命名为蜡样芽孢杆菌，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理保藏中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.4348。以此菌种作为生产菌株。
CGMCC No.4348菌株具有下述性质：
1、培养特征：
在肉汤培养基上生长浑浊并产生菌膜；在营养琼脂上37℃培养24h，形成圆形凸起菌落，菌落边缘整齐，呈乳白色、不透明，菌落表面呈毛玻璃状，迎光呈白蜡样。
2、菌体及芽孢的形态特征：
在固体平板上37℃培养，15-30h形成脱落的芽孢，到30-40h芽孢大部分脱落。菌体呈链状杆菌，菌体大小1.0um×3.0um，椭圆形芽孢，芽孢位于杆菌中心或稍微偏向一端，大小1.0um×1.8um。
3、生理生化性质：
表1 CGMCC No.4348菌株的生理生化性质
+：为可利用；-：为不可利用
4、16S rDNA序列分析
用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用引物(BSF8/27AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；BSR1522/1541CTACGGCTACCTTGTTACGA)进行16SrDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后交由TAKARA公司进行测序。所测的16S rDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较，菌株Bacillus cereusNJYH 4348(CGMCC No.4348)的16S rDNA序列与已注册的蜡样芽孢杆菌序列进行比对，最高同源性为99％。菌株Bacillus cereus CGMCC No.4348的16S rDNA序列已经提交GenBank，接收号为HM136776(Accession number：HM136776)。
测得16S rDNA大部分序列1443bp，具体如SEQ ID NO.1。
有益效果：
采用本发明的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348多阶段发酵的方法，经过种子的培养、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段，这是一个有氧、微氧等多阶段集成发酵，实现蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348的多阶段培养，使Bacilluscereus CGMCC No.4348活力有大幅度提高。本发明成本低，操作简易，蜡样芽孢杆菌活力较高，有利于工业化生产。
保藏信息
上述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348是由本实验室选育并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理保藏中心(北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.4348，保藏日期是：2010年11月15日。
具体实施方式
本发明提供一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348多阶段发酵方法，下面列举实施例予以进一步说明。
实例一：
①种子的培养
从肉汤培养基上挑1个蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348菌落到装液25mL种子培养基的250mL摇瓶中，在温度30℃，pH为6.5，转速为160rpm的摇床中培养10h，得到种子培养液。
其种子培养基组成为(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏8.0，NaCl 3.0，葡萄糖5.0。
②接种前准备
洗净发酵罐，组装好温度计，pH计(已校正)和泡沫传感器，将发酵培养基溶于60℃热水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。
其发酵培养基的组成为(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏8.0，NaCl 3.0，葡萄糖5.0，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.1，CaCO3 1.0，FeSO4·7H2O 0.005，ZnSO4·7H2O 0.005，MnCl2·4H2O 0.001，CoCl2·6H2O 0.001。
③接种
在火焰圈保护下，以2％接种量将蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348接种于3L自动控制发酵罐中，装液量1.5L，空气流量10L/min，搅拌转速为300r/min，培养温度30℃，校正溶氧100％，自动流加氨水控制pH7.0±0.5，调节好转速、空气流量及罐压。
④多阶段溶氧控制
蜡样芽孢杆菌发酵过程分为菌体生长和芽孢形成两个阶段。菌体生长阶段为发酵过程的前18h，这一阶段需要大量氧，初始空气流量为10L/min，搅拌速度为300rpm，溶氧水平DO控制在50-100％；芽孢形成阶段位于发酵过程的18h之后，当细胞光密度(OD600)水平达到28时，转入微氧发酵阶段。但是由于发酵液粘度较高，氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加氧的供给会对菌体造成机械损伤，将加大空气流量与增加搅拌强度相结合有助于解决此问题。此阶段调节空气流量为16.0L/min，搅拌速度为200rpm，溶解氧水平控制在20-30％。
⑤分批补料发酵
菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期。当营养物质的不断消耗，葡萄糖浓度低于2g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2-3g/L范围内发酵12h。
其流加底物组成为(g/L)：葡萄糖250，酵母膏100，K2HPO4 5。
最终测得蜡样芽孢杆菌活菌数为8.5×109cfu/mL。
实例二：
①种子的培养
从肉汤培养基上挑2个蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348菌落到装液35mL种子培养基的250mL摇瓶中，在温度35℃，pH为7.5，转速为180rpm的摇床中培养15h，得到种子培养液。
其种子培养基组成为(g/L)：蛋白胨7.0，酵母膏3.0，NaCl 5.0，葡萄糖12.0。
②接种前准备
洗净发酵罐，组装好温度计，pH计(已校正)和泡沫传感器，将发酵培养基溶于70℃热水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。
其发酵培养基的组成为(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏3.0，NaCl 5.0，葡萄糖12.0，KH2PO43，MgSO4·7H2O 1.0，CaCO3 3.0，FeSO4·7H2O 0.015，ZnSO4·7H2O 0.015，MnCl2·4H2O 0.003，CoCl2·6H2O 0.003。
③接种
在火焰圈保护下，以6％接种量将蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348接种于3L自动控制发酵罐中，装液量1.5L，空气流量13L/min，搅拌转速为350r/min，培养温度35℃，校正溶氧100％，自动流加氨水控制pH7.5±0.5，调节好转速、空气流量及罐压。
④多阶段溶氧控制
蜡样芽孢杆菌发酵过程分为菌体生长和芽孢形成两个阶段。菌体生长阶段为发酵过程的前18h，这一阶段需要大量氧，初始空气流量为13L/min，搅拌速度为350rpm，溶氧水平DO控制在50-100％；芽孢形成阶段位于发酵过程的18h之后，当细胞光密度(OD600)水平达到32时，转入微氧发酵阶段。但是由于发酵液粘度较高，氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加氧的供给会对菌丝体造成机械损伤，将加大空气流量与增加搅拌强度相结合有助于解决此问题。此阶段调节空气流量为18.0L/min，搅拌速度为250rpm，溶解氧水平控制在20-30％。
⑤分批补料发酵
菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期。当营养物质不断消耗，葡萄糖浓度低于2g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2-3g/L范围内发酵10h。
其流加底物组成为(g/L)：葡萄糖300，酵母膏150，K2HPO4 10。
最终测得蜡样芽孢杆菌活菌数为1.40×1010cfu/mL。
实例三：
①种子的培养
从肉汤培养基上挑1个蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348菌落到装液50mL一级种子培养基的250mL摇瓶中，在温度40℃，pH为8.5，转速为200rpm的摇床中培养20h，得到种子培养液。
其种子培养基组成为(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 8.0，葡萄糖20.0。
②接种前准备
洗净发酵罐，组装好温度计，pH计(已校正)和泡沫传感器，将发酵培养基溶于80℃热水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。
其发酵培养基的组成为(g/L)：蛋白胨15.0，酵母膏5.0，NaCl 8.0，葡萄糖20.0，KH2PO45，MgSO4·7H2O 1.5，CaCO3 5.0，FeSO4·7H2O 0.025，ZnSO4·7H2O 0.025，MnCl2·4H2O 0.005，CoCl2·6H2O 0.005。
③接种
在火焰圈保护下，以10％接种量将蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348接种于3L自动控制发酵罐中，装液量1.5L，空气流量15L/min，搅拌转速为400r/min，培养温度40℃，校正溶氧100％，自动流加氨水控制pH8.0±0.5，调节好转速、空气流量及罐压。
④多阶段溶氧控制
蜡样芽孢杆菌发酵过程分为菌体生长和芽孢形成两个阶段。菌体生长阶段为发酵过程的前18h，这一阶段需要大量氧，初始空气流量为15L/min，搅拌速度为400rpm，溶氧水平DO控制在50-100％；芽孢形成阶段位于发酵过程的18h之后，当细胞光密度(OD600)水平达到25时，转入微氧发酵阶段。但是由于发酵液粘度较高，氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加氧的供给会对菌体造成机械损伤，将加大空气流量与降低搅拌强度相结合有助于解决此问题。此阶段调节空气流量为20L/min，搅拌速度为300rpm，溶解氧水平控制在20-30％。
⑤分批补料发酵
菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期。当营养物质的不断消耗，葡萄糖浓度低于2g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2-3g/L范围内发酵8h。
其流加底物组成为(g/L)：葡萄糖350，酵母膏200，K2HPO4 8。
最终测得蜡样芽孢杆菌活菌数为5.0×109cfu/mL。
本发明用于蜡样芽孢杆菌生产，具有广阔的应用前景。通过开发蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus CGMCC No.4348多阶段发酵生产工艺，降低生产成本、提高了蜡样芽孢杆菌的活力，有利于工业化规模生产。
Claims (7)
1.一种蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacilluscereus，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCCNo.4348。
2.一种利用权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌进行多阶段发酵生产的方法；其具体步骤如下：利用蜡样芽孢杆菌培养发酵种子液；将发酵培养基进行接种前准备、灭菌；然后将发酵种子液按发酵培养基体积的2-10％比例接种于发酵培养基，通过控制葡萄糖的浓度进行有氧多阶段发酵，得到蜡样芽孢杆菌的菌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的培养发酵种子液为从肉汤培养基上挑1-2个蜡样芽孢杆菌菌落到装种子培养基的三角瓶中，装液量为三角瓶体积的10-20％，在温度30-40℃，pH为6.5-8.5，转速为160-200rpm的摇床中培养10-20h，得到种子培养液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的种子培养基组成为(g/L)：蛋白胨5.0-10.0，酵母膏3.0-8.0，NaCl 3.0-8.0，葡萄糖5.0-20.0。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基接种前准备为：将发酵培养基溶于60-80℃热水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％；其中所述的发酵培养基的组分(g/L)：蛋白胨5.0-15.0，酵母膏3.0-8.0，NaCl 3.0-8.0，葡萄糖5.0-20.0，KH2PO4 1-5，MgSO4·7H2O 0.1-1.5，CaCO3 1.0-5.0，FeSO4·7H2O 0.005-0.025，ZnSO4·7H2O0.005-0.025，MnCl2·4H2O 0.001-0.005，CoCl2·6H2O 0.001-0.005。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的接种过程中发酵培养基的培养温度30-40℃，控制pH6.5-8.5；调节好转速、空气流量及罐压以及校正溶解氧DO 100％；所述的有氧多阶段发酵为：发酵过程的前4～18h为菌体生长阶段，空气流量为10-15L/min，搅拌速度为300-400rpm，溶解氧DO控制在50-100％；发酵过程的18h之后是芽孢形成阶段，当细胞光密度OD600达到25-32时，转入微氧发酵阶段，调节空气流量为16.0-20.0L/min，搅拌速度为200-300rpm，溶解氧水平控制在20-30％。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于有氧多阶段发酵过程中，当葡萄糖浓度低于2g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在2-3g/L范围内发酵8-15h；其中流加底物组成为(g/L)：葡萄糖250-350，酵母膏100-200，KH2PO45-10。
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