CN102703550B - 一种从蜡样芽孢杆菌高密度发酵液中提取蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从蜡样芽孢杆菌高密度培养液提取蛋白质的方法，依次包括高密度发酵培养、冷冻离心、硫酸铵分级沉淀，冷冻离心、取沉淀，用缓冲液溶解，透析、再依次进行浓缩、冷冻干燥步骤。本发明从蜡样芽孢杆菌发酵液中提取蛋白质的方法，建立了一种简单的操作流程，得到不同组分分子量的蛋白质和多肽。通过对提取出的蛋白质进行抑菌作用测定，发现部分组分蛋白质具有一定的抑制病原菌的作用。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及蛋白质的提取方法，具体涉及一种高活力蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348高密度发酵液中提取蛋白质的方法。
背景技术
蜡样芽孢杆菌（B.cereus）是一种杆状需氧的革兰氏阳性细菌，主要分布于空气、尘埃、土壤、水及植物中，能产生抗逆性内生芽孢。与营养体细胞相比，芽孢对热的抗性高105倍或更多，对紫外线和离子辐射的抗性高100多倍，对抗菌素及其他化学药品的抗性也高，能够抵御各种不良环境。众多研究发现，蜡样芽孢杆菌是土壤中优势菌，对植物根际有促生、防病等功效。大多数菌种与动植物关系密切并形成良好的共生体系，能产生多种生物活性物质，作为生物防治中研究和应用比较广泛的一株拮抗细菌，蜡样芽孢杆菌及其产生的代谢物正越来越受到人们的重视。蜡样芽孢杆菌不但其本身可以被制成微生物菌剂和微生物肥料，其产生的生理活性物质也是种类丰富，其中包括细菌素、多肽抗生素、酶类、杀虫外毒素、激素、溶血素等。
代谢产物的合成是靠菌来完成的。菌量越多，自然产量也越大，条件是菌的生产力能保持在最佳状态和具备适当的生产条件。细胞高密度培养一般是指微生物沉没培养时其细胞密度达到100g/L-200g/L的水平。最早应用于生产单细胞蛋白、乙醇。细胞高密度培养曾成功地应用于各种代谢产物的生产，这也是它为什么一直受到重视的原因。菌体发酵液中含有多种成分复杂、未知的蛋白质，而且多数微生物能够产生至少两种以上的抗菌物质。在这样一种混合体系中，抑菌物质的分离纯化程度要根据研究工作的类型而定。常规的蛋白质分离提取技术对于抗菌蛋白的提取是可行的，然而作为性质特异的物质如环肽，脂肽等，结构性质方面差异很大，分子量通常比较小，某些常规的蛋白层析、电泳技术并不适合或需要进一步改进，因此给抗菌蛋白的分离纯化工作带来了难度。
本发明中为了便于沉淀后较好地分离出蛋白质，选择了硫酸铵盐析法，与陶黎明等人用有机溶剂沉淀分离提取蛋白质相比较，有机溶剂沉淀蛋白质需要在低温条件下进行，而该提取法只需在常温下进行，便于操作。针对当前蜡样芽孢杆菌制剂普遍存在产品有效期不长、货架期短的问题，从蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus CGMCC4348发酵液中提取蛋白质，获得生产所需要的活性物质，为新型微生态制剂的生产提供模板。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的不足之处，而提供了一种工艺简单、提取率高，且提高了不同分子量蛋白质的得率的一种从蜡样芽孢杆菌高密度发酵液中提取蛋白质的方法。
本发明的技术方案为：一种从蜡样芽孢杆菌高密度发酵液中提取蛋白质的方法，其具体步骤如下：
1）、高密度发酵培养：将蜡样芽孢杆菌（其分类命名为蜡状芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacillus cereus，参据的微生物：NJYH 63305，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4348。）菌株接种于肉汤琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子培养液培养基的锥形瓶中，锥形瓶装液量为锥形瓶体积的17～23%，置于摇床中培养16～20h得种子液；再移取发酵培养基体积分数比为3～9%的种子液培养基接入发酵罐中发酵培养，其中发酵罐装液量为发酵罐体积的30～50%，控制温度、通气量、搅拌速率和pH，培养36～48h得发酵液；
2）、冷冻离心：将步骤1）中的发酵液装入离心管中，置于4～8℃冷冻离心机中离心得到液相和沉淀，沉淀灭菌后丢弃；
3）、硫酸铵分级沉淀：首先，将步骤2）中的液相置于搅拌仪上，在5～28℃温度下加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到相应温度下的20～30%，充分搅拌60～120min后，离心收集第一级沉淀物和第一级上清液；将此离心获得的第一级上清液转入另一个容器中，以硫酸铵饱和度15～25%为梯度，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，即离心收集到含蛋白组分的第二、三级沉淀物；
4）、透析：分别将上述含蛋白组分的第二、三级沉淀物的离心管固定好，分别将沉淀物重悬于含15～25%体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5～10mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的40～50%，将透析袋两头扎死，在4～8℃温度条件下，用蒸馏水透析4～8h，期间换液1～3次，再转至缓冲液中；相同温度条件下（4～8℃）继续透析24～36h；将透析好的蛋白质冷冻干燥后保存。
优选步骤1）种子液培养基的组分：蛋白胨5.0～15.0g/L，牛肉膏3.0～8.0g/L，NaCl 3.0～8.0g/L，葡萄糖5.0～20.0g/L，控制pH7.0～7.5；用0.5～1mol/L NaOH调节培养基的pH在7.0～7.5的范围内。优选发酵培养基的组分：蛋白胨5.0～15.0g/L，牛肉膏3.0～8.0g/L，NaCl 3.0～8.0g/L，葡萄糖5.0～20.0g/L，KH2PO41～5g/L，MgSO4·7H2O 0.1～1.5g/L，MnCl2·4H2O 0.001～0.005g/L。
优选步骤1）发酵培养过程中温度控制在30～37℃，通入无菌空气，通气量为7～15L/（L·min），搅拌速率300～450rpm，pH控制在7.0～7.5。
优选所述步骤4）缓冲液的成分：8～10mmol/L Tris-HCl、0.1～0.25mol/LNaCl、0.8～1.2mmol/L乙二醇-双-（2-氨基乙醚）四乙酸。
优选步骤2）中冷冻离心时间为5～10min，冷冻离心的转速控在：7000～10000rmp；步骤3）离心过程中控制转速为10000～12000rmp、离心时间为15～20min。
抑菌活性检测：取采用上述方法提取的第二、三级蛋白质沉淀物A、B，各称取5～10μg溶于蒸馏水中，制备出浓度为5～10μg/mL的溶液。两块中心接有棉花枯萎病病菌和黄瓜枯萎病病菌菌碟的PDA平板培养48h后，于上下左右距离培养皿边缘2cm处各用打孔器（d=6mm）各打一个孔，在其中三个孔中注入10～20μL的蜡样芽孢杆菌菌液，另一个孔中以无菌发酵培养基做为对照。27～32℃培养42～48h，观察发现A、B蛋白组分具有显著的抑菌效果。
本专利选用的蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡状芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacillus cereus，参据的微生物：NJYH 63305，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4348。该菌株具有下述性质：
1、培养特征：
在肉汤培养基上生长浑浊并产生菌膜；在营养琼脂上37℃培养24h，形成圆形凸起菌落，菌落边缘整齐，呈乳白色、不透明，菌落表面呈毛玻璃状，迎光呈白蜡样。
2、菌体及芽孢的形态特征：
在固体平板上37℃培养，15～30h形成脱落的芽孢，到30～40h芽孢大部分脱落。菌体呈链状杆菌，菌体大小1.0um×3.0um，椭圆形芽孢，芽孢位于杆菌中心或稍微偏向一端，大小1.0um×1.8um。
3、生理生化性质：
表1 CGMCC No.4348菌株的生理生化性质
+：为可利用；-：为不可利用
有益效果：
本发明中为了便于沉淀后较好地分离出蛋白质，选择了硫酸铵盐析法，与用有机溶剂沉淀分离提取蛋白质相比较，有机溶剂沉淀蛋白质需要在低温条件下进行，而该提取法只需在常温下进行，便于操作。针对当前蜡样芽孢杆菌制剂普遍存在产品有效期不长、货架期短的问题，从蜡状芽孢杆菌Bacillus cereusCGMCC4348发酵液中提取蛋白质，获得生产所需要的活性物质，为新型微生态制剂的生产提供模板。
采用本发明的方法从蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348发酵液中提取拮抗蛋白，经过发酵培养、冷冻离心、硫酸铵分级沉淀，冷冻离心、取沉淀，用缓冲液溶解，透析、再依次进行浓缩、冷冻干燥后保存，实现蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348代谢物的分离提取，对其在农业杀虫抑菌作用的深入研究提供了理论基础。本发明成本低，操作简易，在分离纯化的同时还将拮抗蛋白进行了浓缩，蛋白质不易失活，有利于工业化生产。
保藏信息
上述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348是由本实验室选育并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理保藏中心（北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物所），其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.4348，保藏日期是：2010年11月15日。
具体实施方式
实例1
1、发酵培养：将蜡样芽孢杆菌菌株接种于肉汤琼脂培养基后，在32℃的恒温培养箱中培养28h至菌落生长良好；选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子培养液培养基的锥形瓶中，置37℃、180r/min摇床中培养16h得种子液；再移取体积比（种子液培养基/发酵培养基）为4%的种子液接入发酵罐中，通入无菌空气，通气量7L/（L·min），控制温度37℃，调节pH 7.0，搅拌速率400r/min，培养36h得发酵液；
2、冷冻离心：将步骤1中的发酵液装入离心管中，置于4℃冷冻离心机中，以7000rmp转速离心5min得到液相和沉淀，沉淀灭菌后丢弃；
3、硫酸铵分级沉淀：首先，将步骤2中的液相置于搅拌仪上，在20℃的室温下加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到20%，充分搅拌120min后，以10000rmp为转速离心15min收集沉淀物；将此离心获得的上清液转入另一个容器中，加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到45%，同样条件下离心收集到沉淀物组分A，继续加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到70%，离心收集沉淀物组分B。
4、透析：将上述含有不同组分的沉淀物A和B的离心管固定好，将沉淀物重悬于含21%体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5mg/mL。再将悬液移至透析袋中，排出空气，透析袋中装液量（V/V）为45%，将透析袋两头扎死，首先在4℃温度条件下，用蒸馏水透析8h，期间换液二次，再转至缓冲液中，同样温度条件下继续透析24h。将透析好的蛋白质A和B冷冻干燥后保存。
5、抑菌活性检测：将上述蛋白质A和B分别称取6μg溶于蒸馏水中，制备出浓度为6μg/mL的溶液。两块中心接有棉花枯萎病病菌和黄瓜枯萎病病菌菌碟的PDA平板培养48h后，于上下左右距离培养皿边缘2cm处各用打孔器（d=6mm）各打一个孔，在其中三个孔中注入15μL的蜡样芽孢杆菌菌液，另一个孔中以无菌发酵培养基做为对照。28℃培养47h，观察发现蛋白质A、B的抑制率分别为62%、54%。
实例2
1、发酵培养：将蜡样芽孢杆菌菌株接种于肉汤琼脂培养基后，在35℃的恒温培养箱中培养27h至菌落生长良好；选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子培养液培养基的锥形瓶中，置32℃、200r/min摇床中培养18h得种子液；再移取体积比（种子液培养基/发酵培养基）为7%的种子液接入发酵罐中，通入无菌空气，通气量11L/（L·min），控制温度32℃，调节pH 7.2，搅拌速率450r/min，培养40h得发酵液；
2、冷冻离心：将步骤1中的发酵液装入离心管中，置于7℃冷冻离心机中以8500rmp为转速离心8min得到液相和沉淀（灭菌后丢弃）；
3、硫酸铵分级沉淀：首先，将步骤2中的液相置于搅拌仪上，在25℃的室温下加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到30%，充分搅拌70min后，以11000rmp为转速离心18min收集沉淀物；将此离心获得的上清液转入另一个容器中，加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到50%，同样条件下离心收集到沉淀物组分A，继续加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到70%，离心收集沉淀物组分B。
4、透析：将上述含有不同组分的沉淀物A和B的离心管固定好，将沉淀物重悬于含18%体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到7mg/mL。再将悬液移至透析袋中再将悬液移至透析袋中，排出空气，，透析袋中装液量（V/V）为40%，将透析袋两头扎死，首先6℃温度条件下，用蒸馏水透析6h，期间换液三次，再转至缓冲液中，同样温度条件下继续透析30h。将透析好的蛋白质A和B冷冻干燥后保存。
5、抑菌活性检测：将上述蛋白质A和B分别称取10μg溶于蒸馏水中，制备出浓度为10μg/mL的溶液。两块中心接有棉花枯萎病病菌和黄瓜枯萎病病菌菌碟的PDA平板培养48h后，于上下左右距离培养皿边缘2cm处各用打孔器（d=6mm）各打一个孔，在其中三个孔中注入20μL的蜡样芽孢杆菌菌液，另一个孔中以无菌发酵培养基做为对照。30℃培养45h，观察发现蛋白质A、B的抑制率分别为51%、42%。
实例3
1、发酵培养：将蜡样芽孢杆菌菌株接种于肉汤琼脂培养基后，在35℃的恒温培养箱中培养25h至菌落生长良好；选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，置36℃、170r/min摇床中培养18h得种子液；再移取体积比（种子液培养基/发酵培养基）为9%的种子液接入发酵罐中，通入无菌空气，通气量15L/（L·min），控制温度36℃，调节pH 7.5，搅拌速率350r/min，培养38h得发酵液；
2、冷冻离心：将步骤1中的发酵液装入离心管中，置于8℃冷冻离心机中以10000rmp为转速离心10min得到液相和沉淀，沉淀灭菌后丢弃；
3、硫酸铵分级沉淀：首先，将步骤2中的液相置于搅拌仪上，在15℃的温度下加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到25%，充分搅拌90min后，以12000rmp为转速离心20min收集沉淀物；将此离心获得的上清液转入另一个容器中，加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到40%，同样条件下离心收集到沉淀物组分A，继续加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到55%，离心收集沉淀物组分B。
4、透析：将上述含有不同组分的沉淀物A和B的离心管固定好，将沉淀物重悬于含15%体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到10mg/mL。再将悬液移至透析袋中，排出空气，透析袋中装液量为（V/V）50%，将透析袋两头扎死，首先8℃温度条件下，用蒸馏水透析4h，期间换液一次，再转至缓冲液中，同样温度条件下继续透析36h。将透析好的蛋白质A和B冷冻干燥后保存。
5、抑菌活性检测：将上述蛋白质A和B分别称取8μg溶于蒸馏水中，制备出浓度为8μg/mL的溶液。两块中心接有棉花枯萎病病菌和黄瓜枯萎病病菌菌碟的PDA平板培养42h后，于上下左右距离培养皿边缘2cm处各用打孔器（d=6mm）各打一个孔，在其中三个孔中注入10μL的蜡样芽孢杆菌菌液，另一个孔中以无菌发酵培养基做为对照。32℃培养42h，观察发现蛋白质A、B的抑制率分别为59%、37%。
Claims (5)
1.一种从蜡样芽孢杆菌高密度发酵液中提取蛋白质的方法，其具体步骤如下：
1）、高密度发酵培养：将蜡样芽孢杆菌菌株接种于肉汤琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子培养液培养基的锥形瓶中，锥形瓶装液量为锥形瓶体积的17～23%，置于摇床中培养16～20h得种子液；再移取发酵培养基体积分数比为3～9%的种子液培养基接入发酵罐中发酵培养，其中发酵罐装液量为发酵罐体积的30～50%，控制温度在30～37℃，通入无菌空气，通气量为7～15L/（L·min），搅拌速率300～450rpm，pH控制在7.0～7.5，培养36～48h得发酵液；其中蜡状芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacillus cereus，参据的微生物：NJYH63305，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4348；
2）、冷冻离心：将步骤1）中的发酵液装入离心管中，置于4～8℃冷冻离心机中离心得到液相和沉淀，沉淀灭菌后丢弃；
3）、硫酸铵分级沉淀：首先，将步骤2）中的液相置于搅拌仪上，在5～28℃温度下加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到相应温度下的20～30%，充分搅拌60～120min后，离心收集第一级沉淀物和第一级上清液；将此离心获得的第一级上清液转入另一个容器中，以硫酸铵饱和度15～25%为梯度，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，即离心收集到含蛋白组分的第二、三级沉淀物；
4）、透析：分别将上述含蛋白组分的第二、三级沉淀物的离心管固定好，分别将沉淀物重悬于含15～25%体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5～10mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的40～50%，将透析袋两头扎死，在4～8℃温度条件下，用蒸馏水透析4～8h，期间换液1～3次，再转至缓冲液中；相同温度条件下继续透析24～36h；将透析好的蛋白质冷冻干燥后保存；其中缓冲液的成分：8～10mmol/L Tris-HCl、0.1～0.25mol/L NaCl、0.8～1.2mmol/L乙二醇-双-（2-氨基乙醚）四乙酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤1）种子液培养基的组分：蛋白胨5.0～15.0g/L，牛肉膏3.0～8.0g/L，NaCl3.0～8.0g/L，葡萄糖5.0～20.0g/L，控制pH7.0～7.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤1）发酵培养基的组分：蛋白胨5.0～15.0g/L，牛肉膏3.0～8.0g/L，NaCl3.0～8.0g/L，葡萄糖5.0～20.0g/L，KH2PO41～5g/L，MgSO4·7H2O0.1～1.5g/L，MnCl2·4H2O0.001～0.005g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤2）中冷冻离心时间为5～10min，冷冻离心的转速控在：7000～10000rmp。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤3）离心过程中控制转速为10000～12000rmp、离心时间为15～20min。
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