CN107523512B - 一种高芽孢率的地衣芽孢杆菌发酵方法 - Google Patents

一种高芽孢率的地衣芽孢杆菌发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高地衣芽孢杆菌的芽孢率的发酵方法，分为下述两个阶段：在pH7.0‑7.5的培养基中接种地衣芽孢杆菌，于36‑38℃发酵培养20‑26h；然后调节并控制发酵液至pH8.0‑8.5，于36‑38℃继续发酵培养，至从接种时起30‑36h时停止发酵，收获菌体，其芽孢率达到85％以上。

Description

一种高芽孢率的地衣芽孢杆菌发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵工程领域，涉及一种地衣芽胞杆菌的发酵方法，具体涉及一种提高地衣芽孢杆菌的芽孢率的发酵方法。
背景技术
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是最常用的一种活菌制剂菌种之一，是芽孢杆菌属的一种，单个细胞，0.6～0.8×1.5～3微米，细胞形态和排列呈杆状、单生，可产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。地衣芽孢杆菌可促使机体产生抗菌物质、杀灭致病菌，既能产生抗菌物质，又具有独特的生物脱氧作用机制，能抑制致病菌(大肠杆菌、产气荚膜梭菌)的生长繁殖，有效地调理胃肠道功能紊乱。地衣芽孢杆菌能产生多种活性酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等，同时还能产生多种酶促因子，增强消化酶的活性，促进胃肠消化功能，增加食欲，刺激肠蠕动，改善排便功能；另外，可给肠胃内的生理性厌氧菌如双歧杆菌、乳酸菌、消化链球菌等有益微生物的生长繁殖创造有利条件，促进其生长繁殖，而双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌等有益菌在繁殖过程汇中产生大量乙酸、乳酸，使肠道酸化，可中和大便碱性，使大便软化，促进排便。
作为益生菌药物制剂，地衣芽孢杆菌主要通过所含的活菌及芽孢来达到调节体内微生物平衡的作用，如果运输存储过程中活菌数量降低，会影响芽孢杆菌的质量及相应制剂产品的品质。地衣芽孢杆菌形成芽孢以后抗逆性增强，耐热，不易死亡，易储存，提高了地衣芽孢杆菌的稳定性。所以在地衣芽孢杆菌发酵过程中不仅要做到菌体产量的提高，如何提高成孢率也是发酵生产过程的一个研究重点。
一般认为，芽孢是在地衣芽孢杆菌生长后期、营养物质缺乏、环境恶劣时形成的，是适应不良环境的产物。近年来的研究表明，许多种类的细菌在高细胞密度条件下能通过化学信号(自体诱导物)传递帮助细胞监控细菌群体浓度的变化，这一现象称为“群体感应调节”，群体感应能让细菌细胞感知细胞密度变化，从而引发其在高细胞密度下异常的、多样的细胞行为模式。芽孢杆菌中感受态和芽孢的形成与其群体密度有关。枯草芽孢杆菌也能利用群体感应调节系统对自身发育进行调控，当群体密度高时，信号分子响应细菌浓度增高而启动了芽孢形成基因的表达。
细菌发酵过程中受到培养基配方、水分、温度等诸多影响因素，但是目前地衣芽孢杆菌的发酵文献研究仅局限在发酵温度、溶解氧等影响条件的调控(参见CN103205388A)，芽孢率均不理想。
发明内容
为了提高地衣芽孢杆菌的活菌比率和芽孢率，发明人对于地衣芽孢杆菌的发酵工艺进行了探索，惊讶地发现通过控制菌株发酵不同时间段的发酵液pH，可以显著地影响菌体的芽孢率和活菌比率。
因此，本发明的第一个目的在于提供提高地衣芽孢杆菌的芽孢率的发酵方法。
本发明的第二个目的在于提供一种高芽孢率和高活菌比率的菌体。
本发明包括如下技术方案：
一种提高地衣芽孢杆菌的芽孢率的发酵方法，分为下述两个阶段：在pH7.0-7.5的培养基中接种地衣芽孢杆菌，于36-38℃发酵培养至20-26h；然后调节并控制发酵液至pH8.0-8.5，于36-38℃继续发酵培养，至从接种时起30-36h时停止发酵，收获菌体。
具体而言，地衣芽孢杆菌的发酵包括如下步骤：
a)种子活化培养：将地衣芽孢杆菌菌种接种于pH7.0-7.5、优选大约pH7.0-7.4、更优选大约pH7.0-7.3、更优选大约pH7.0-7.2的种子活化培养基中，于36-38℃、优选37℃摇床培养4-10h、优选6-10h、更优选6-8h，得种子活化培养液；
b)种子培养：将步骤a)得到的种子活化培养液以体积分数1-10％、优选2-10％、优选4-10％、优选5-10％、更优选8-10％的接种量接种于pH7.0-7.5、优选大约pH7.0-7.4、更优选大约pH7.0-7.3、更优选大约pH7.0-7.2的种子培养基中，于36-38℃、优选37℃培养4-10h、优选6-10h、更优选6-8h，得种子培养液；
c)发酵培养：将步骤b)得到的种子培养液以体积分数10-30％、、优选15-30％、优选20-30％、优选25-30％的接种量接种到pH7.0-7.5、优选大约pH7.0-7.4、更优选大约pH7.0-7.3、更优选大约pH7.0-7.2的发酵培养基中，于36-38℃、优选37℃培养大约为20-26h比如大约21h、22h、23h、24h或25h；
d)后期发酵培养：调节并控制发酵液至pH8.0-8.5、优选大约pH8.0-8.4、优选大约pH8.0-8.3、优选大约pH8.0-8.2，于大约36-38℃、优选大约37℃继续培养，直至从接种起大约30-36h，比如大约31h、32h、33h、34h或35h；停止发酵，收获菌体。
优选地，步骤a)中所述种子活化培养基为营养肉汤培养基，组成如下：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L。
优选地，步骤b)中所述种子培养基为营养肉汤培养基，组成如下：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L。
优选地，步骤c)中所述发酵培养基是营养肉汤培养基，组成如下：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L。
在优选的实施方式中，上述步骤a)的种子活化培养中，摇床转速一般为120-180rpm。
在优选的实施方式中，上述步骤b)的种子培养可采用摇床培养、或者发酵罐培养。若是摇床培养，摇床转速一般为120-180rpm。
在优选的实施方式中，在上述步骤c)和d)的发酵培养中，溶氧保持在20-50％，比如为25-50％、30-45％、30-40％。
在优选的实施方式中，在上述步骤d)的发酵培养中，pH调节剂选自磷酸、盐酸、氨水，采用流加方式加入发酵液中。
当停止发酵后，可采用离心方式收集菌体，比如将发酵液10000rpm离心15-20min，弃去上清液，即可得到菌体。
在优选的实施方式中，所述地衣芽孢杆菌是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心、保藏编号为CGMCC NO.0183的菌。该菌株已在中国发明专利号201010578718.0(授权公告号CN102120972B)和中国发明专利号92113318.9(授权公告号CN1044324C)中有报道，为编号63516的菌株。本领域技术人员应当理解，本发明的发酵方法同样适用于其他地衣芽孢杆菌。
通过本发明的发酵方法生产的地衣芽孢杆菌的芽孢率可达85％以上。
通过本发明的发酵方法生产的地衣芽孢杆菌由于活菌数量高、芽孢率高，可以用于制备益生菌药物。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
应理解，本文中在表述数值特征时，术语“约”或者“大约”是指所表示的本数可以有±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的误差范围或浮动范围。
在本发明中，术语“溶氧”代表发酵液中的氧气含量水平，一般通过通气量、搅拌转速来控制，采用溶氧电极监测。溶氧电极在空气中校正100％，在饱和Na2CO3溶液中校正0％。
本发明中的术语“通气比”也称为通风比，或简称通风量，表示空气流量，通常以一分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V·m)。在优选的实施方式中，通气比控制在1：0.5-1V/V·m、比如为1：0.8-1V/V·m。具体数值的选择可根据溶氧、不同发酵时间进行调节。
在本发明中，发酵液的pH主要通过流加pH调节剂的方式进行控制，其中pH调节剂包括无机酸比如磷酸或盐酸、无机碱比如氨水。
用于活化的菌种可以事先保藏在安瓿管、甘油管、或琼脂斜面中。使用时，按本领域技术人员熟知的常规方法接种于摇瓶中。
在本发明中，培养基的灭菌处理按本领域技术人员熟知的常规方法进行，灭菌条件比如是121℃、20-30min。
本发明优化了不同发酵时间段的pH控制，意外地提高了地衣芽孢杆菌的芽孢率，并且得到了高菌体量。
实施例
芽孢率检测方法：美兰染色法，即湿菌体以美蓝(亚甲基蓝)染色后，油镜镜检。
实施例1
1)种子活化培养：将安瓿管保存的地衣芽孢杆菌CGMCC NO.0183菌种用无菌生理盐水溶解后，接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2)中，150rpm、37℃摇床培养6h，得种子活化培养液。
2)种子培养：将步骤1)得到的种子活化培养液以1％的接种量接种于盛有1000mL营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2)的摇瓶中，37℃、150rpm培养6h，得种子培养液。
3)发酵培养：将步骤2)得到的种子培养液以20％的接种量接种于15L发酵罐中，发酵罐中装有10L营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2)，37℃培养。初始通气比1：1，当溶氧低于20％时增加通气比，当溶氧高于50％时降低通气比；转速200-600rpm，根据溶氧值调节转速，当溶氧升高时降低转速，当溶氧降低时增加转速。培养32h。其中，0-24h的发酵以磷酸调节pH维持7.2；24h时调节pH维持8直至32h。
4)发酵结束后，发酵液10000rpm离心10min，获得湿菌体5.2g/L，以美兰染色后油镜镜检，芽孢率87％。
实施例2
将上述实施例1中步骤2)得到的种子培养液以10％的接种量接种于15L发酵罐中，发酵罐中装有10L营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.0)，37℃培养。初始通气比1：0.5，当溶氧低于20％时增加通气比，当溶氧高于50％时降低通气比；转速200-600rpm，根据溶氧值调节转速，当溶氧升高时降低转速，当溶氧降低时增加转速。培养32h。其中，0-24h的发酵以磷酸调节pH维持7.0；24h时调节pH维持8.5直至32h。
发酵结束后，发酵液10000rpm离心10min，获得湿菌体5.1g/L，以美兰染色后油镜镜检，芽孢率85％。
实施例3
将上述实施例1中步骤2)得到的种子培养液以30％的接种量接种于15L发酵罐中，发酵罐中装有10L营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.5)，37℃培养。初始通气比1：1，当溶氧低于20％时增加通气比，当溶氧高于50％时降低通气比；转速200-600rpm，根据溶氧值调节转速，当溶氧升高时降低转速，当溶氧降低时增加转速。培养32h。其中，0-24h的发酵以磷酸调节pH维持7.5；24h时调节pH维持8直至32h。
发酵结束后，发酵液10000rpm离心10min，获得湿菌体5.3g/L，以美兰染色后油镜镜检，芽孢率88％。
实施例4
将上述实施例1中步骤2)得到的种子培养液以30％的接种量接种于15L发酵罐中，发酵罐中装有10L营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2)，37℃培养。初始通气比1：1，当溶氧低于20％时增加通气比，当溶氧高于50％时降低通气比；转速200-600rpm，根据溶氧值调节转速，当溶氧升高时降低转速，当溶氧降低时增加转速。培养32h。其中，0-24h的发酵以磷酸调节pH维持7.2；24h时调节pH维持8.2直至32h。
发酵结束后，发酵液10000rpm离心10min，获得湿菌体5.2g/L，以美兰染色后油镜镜检，芽孢率86％。
比较例1
1)种子活化培养：将安瓿管保存的地衣芽孢杆菌CGMCC NO.0183菌种用无菌生理盐水溶解后，接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.0)中，150rpm、37℃摇床培养6h，得种子活化培养液。
2)种子培养：将步骤1)得到的种子活化培养液以1％的接种量接种于盛有1000mL营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.0)的摇瓶中，37℃、150rpm培养6h，得种子培养液。
3)发酵培养：将步骤2)得到的种子培养液以20％的接种量接种于15L发酵罐中，发酵罐中装有10L营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.0)，37℃培养。初始通气比1：1，当溶氧低于20％时增加通气比，当溶氧高于50％时降低通气比；转速200-600rpm，根据溶氧值调节转速，当溶氧升高时降低转速，当溶氧降低时增加转速。培养32h，全程pH不调节。
4)发酵结束后，发酵液10000rpm离心10min，获得湿菌体3g/L，以美兰染色后油镜镜检，芽孢率72％。
比较例2
1)种子活化培养：将安瓿管保存的地衣芽孢杆菌CGMCC NO.0183菌种用无菌生理盐水溶解后，接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2)中，150rpm、37℃摇床培养6h，得种子活化培养液。
2)种子培养：将步骤1)得到的种子活化培养液以1％的接种量接种于盛有1000mL营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2)的摇瓶中，37℃、150rpm培养6h，得种子培养液。
3)发酵培养：将步骤2)得到的种子培养液以20％的接种量接种于15L发酵罐中，发酵罐中装有10L营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2)，37℃培养。初始通气比1：1，当溶氧低于20％时增加通气比，当溶氧高于50％时降低通气比；转速200-600rpm，根据溶氧值调节转速，当溶氧升高时降低转速，当溶氧降低时增加转速。培养32h，全程以磷酸调节pH维持7.2。
4)发酵结束后，发酵液10000rpm离心10min，获得湿菌体4g/L，以美兰染色后油镜镜检，芽孢率75％。
比较例3
按照比较例2的方法进行步骤1)和步骤2)，但在步骤3)中全程以磷酸调节pH维持8。发酵32h后，发酵液10000rpm离心10min，获得湿菌体3.8g/L，以美兰染色后油镜镜检，芽孢率70％。
综上所述，本发明通过对地衣芽孢杆菌的发酵过程进行优化，能够显著提高芽孢率，生产出活菌数量和芽孢率更高的益生菌制剂，具有广阔的工业应用前景。

Claims (7)

1.一种提高地衣芽孢杆菌的芽孢率的发酵方法，其特征在于，分为下述两个阶段：在pH7.0-7.5的培养基中接种地衣芽孢杆菌，于36-38℃发酵培养至20-26h；然后调节并控制发酵液至pH8.0-8.5，于36-38℃继续发酵培养，至从接种时起30-36h时停止发酵，收获菌体，发酵液的pH通过流加pH调节剂的方式进行控制，所用pH调节剂选自无机酸、无机碱，所述培养基为营养肉汤培养基，所述地衣芽孢杆菌是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心、保藏编号为CGMCC NO.0183的菌株。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)种子活化培养：将地衣芽孢杆菌菌种接种于pH7.0-7.5的种子活化培养基中，于36-38℃摇床培养4-10h，得种子活化培养液；
b)种子培养：将步骤a)得到的种子活化培养液以体积分数1-10％的接种量接种于pH7.0-7.5的种子培养基中，于36-38℃培养4-10h，得种子培养液；
c)发酵培养：将步骤b)得到的种子培养液以体积分数10-30％的接种量接种到pH7.0-7.5的发酵培养基中，于36-38℃培养20-26h；
d)后期发酵培养：调节并控制发酵液至pH8.0-8.5，于36-38℃继续发酵培养，至从接种时起30-36h时停止发酵，收获菌体。
3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，步骤a)中所述种子活化培养基为营养肉汤培养基，组成如下：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L。
4.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，步骤b)中所述种子培养基为营养肉汤培养基，组成如下：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L。
5.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，步骤c)中所述发酵培养基是营养肉汤培养基，组成如下：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L。
6.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，在步骤c)和d)的发酵培养中，溶氧保持在20-50％。
7.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在步骤d)的发酵培养中，pH调节剂选自磷酸、盐酸、氨水。
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