WO2018221482A1 - 糸状菌ペレットの製造方法 - Google Patents

糸状菌ペレットの製造方法 Download PDF

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WO2018221482A1
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pellet
filamentous fungus
filamentous
culture
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岳史 坂本
裕 入江
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花王株式会社
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing filamentous fungal pellets.
  • Filamentous fungi are useful microorganisms that are indispensable in industry for the microbiological production of useful substances such as organic acids and enzymes.
  • filamentous fungi When filamentous fungi are subjected to liquid culture, the form changes to a fibrous, lump or pellet form depending on the amount of spore inoculation, the pH of the culture, the flow conditions, and the like.
  • Filamentous fungal pellets have the advantage that they can be easily separated from the medium after fermentation (for example, Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 reports that a specific nonionic surfactant is added to a culture solution to form a filamentous fungus pellet. Further, Non-Patent Document 2 reports the formation of Aspergillus niger mycelium aggregates.
  • Patent Document 1 JP-A-6-253871
  • Non-Patent Document 1 Journal of Industrial Microbiology, 4, 1989, p. 155-161
  • Non-Patent Document 2 48th Chemical Engineering Society Poster, LQ268
  • the present invention provides a method for producing a filamentous fungal pellet including a step of germinating spores of filamentous fungi in a culture solution containing a cationic polymer, and a filamentous fungal pellet having a high mycelial density.
  • the present invention relates to providing a method for producing high-density filamentous fungal pellets.
  • a filamentous fungal pellet having a high mycelial density can be obtained by germinating filamentous fungal spores in a culture solution containing a cationic polymer to form a pellet. It was.
  • a high-density filamentous fungus pellet can be obtained.
  • the method for producing a filamentous fungus pellet of the present invention is a production method including a step of germinating spores of a filamentous fungus in a culture solution containing a cationic polymer to form a pellet.
  • filamentous fungus used in the present invention examples include microorganisms belonging to the genus Rhizopus, the genus Trichoderma, the genus Aspergillus and the genus Mucor.
  • examples of the genus Rhizopus include Rhizopus delemar, Rhizopus oryzae, Rhizopus ariz, , Rhizopus tonkinensis, Rhizopus tritici and the like.
  • Examples of the genus Trichoderma include Trichoderma atroviride, Trichoderma harzianum, Trichoderma coningi (Trichoderma coningi). Etc. Examples of Aspergillus spp.
  • Aspergillus oryzae Aspergillus niger, Aspergillus terreus, and the like.
  • Examples of the genus Mucor include Mucor mandshuricus. These filamentous fungi may be used alone, but may be used in combination of two or more. Of these, Rhizopus sp. Or Trichoderma sp. Is preferred, and Rhizopus deremer and Rhizopus oryzae are more preferred from the viewpoints of productivity and handleability of useful substances. Useful substances in this specification will be described later.
  • the filamentous fungal spore can be prepared as a spore suspension in which the filamentous fungal spore is inoculated into a medium such as potato dextrose agar medium (PDA medium) and statically cultured, and the culture is suspended in a liquid. .
  • the spore suspension can be appropriately diluted to adjust the desired spore count.
  • the culture temperature is preferably 10 ° C or higher, more preferably 25 ° C or higher, and preferably 40 ° C or lower, More preferably, it is 30 degrees C or less.
  • the culture days are preferably 7 days or more and 10 days or less. The number of spores in the spore suspension can be measured with a cell counter described later.
  • pellet refers to a mycelial mass having a size of about several hundred ⁇ m to several mm formed spontaneously by liquid culture.
  • the number of filamentous fungi inoculated into the culture solution is preferably 1 ⁇ 10 1 -spore / mL-more than the culture solution, more preferably 1 ⁇ 10 2 -spore / From the same viewpoint as above, it is preferably 1 ⁇ 10 8 cells / spore / mL or less, more preferably 1 ⁇ 10 4 cells / spore / mL / culture solution. It is as follows.
  • the culture solution may be any of a synthetic medium, a natural medium, and a semi-synthetic medium obtained by adding natural components to a synthetic medium as long as it is a liquid medium capable of growing filamentous fungi.
  • a potato dextrose medium PDB medium
  • Luria-Bertani medium LB medium
  • Nutrient Broth NB medium
  • Sabouraud medium SB medium
  • the culture solution can contain a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other necessary nutrient sources. Examples of the carbon source include saccharides.
  • saccharide examples include monosaccharides such as glucose, fructose, and xylose, and disaccharides such as sucrose, lactose, and maltose.
  • the saccharide may be an anhydride or a hydrate. These can be used alone or in combination of two or more. Among these, glucose is preferable from the viewpoint of productivity.
  • the initial carbon source concentration in the culture solution is preferably 0.1% (w / v) or more and 30% (w / v) or less.
  • nitrogen source include nitrogen-containing compounds such as urea, ammonium sulfate, ammonium nitrate, potassium nitrate, and sodium nitrate.
  • the initial nitrogen source concentration in the culture solution is preferably 0.1% (w / v) or more and 1% (w / v) or less.
  • inorganic salts include sulfates, magnesium salts, zinc salts and the like.
  • the sulfate include magnesium sulfate, zinc sulfate, potassium sulfate, sodium sulfate and the like.
  • the initial sulfate concentration in the culture solution is preferably 0.1% (w / v) or more and 1% (w / v) or less.
  • the magnesium salt include magnesium sulfate, magnesium nitrate, and magnesium chloride.
  • the initial magnesium salt concentration in the culture medium is preferably 0.0001% (w / v) or more and 0.5% (w / v) or less.
  • Examples of the zinc salt include zinc sulfate, zinc nitrate, and zinc chloride.
  • the initial zinc salt concentration in the culture solution is preferably 0.0001% (w / v) or more and 0.5% (w / v) or less.
  • spore germination and pelleting are performed in a culture solution containing a cationic polymer.
  • the “cationic polymer” used in the present invention refers to a polymer that is positively charged when mixed with water.
  • Specific examples of the cationic polymer include a monomer having a cationic group, or a polymer of a monomer having an amino group that is cationic in water, and a copolymer or condensation polymer of these monomers and other monomers. Is preferred.
  • the cationic group include a quaternary amino group and a hydrazino group.
  • Examples of the amino group exhibiting cationicity in water include a primary amino group, a secondary amino group, and a tertiary amino group. It is done.
  • the charge density of the cationic polymer is preferably 0.1 meq / g or more, more preferably 1 meq / g or more, still more preferably 2 meq / g or more, and even more preferably 10 meq / g or more. It is. Further, from the same viewpoint as above, it is preferably 100 meq / g or less, more preferably 50 meq / g or less, and more preferably 30 meq / g or less.
  • the charge density of the cationic polymer is preferably 0.1 meq / g to 100 meq / g, more preferably 1 meq / g to 50 meq / g, more preferably 2 meq / g to 30 meq / g, and even more preferably. Is 10 meq / g to 30 meq / g.
  • the cationic charge density refers to the ratio of the number of positive charges on the polymer to the molecular weight of the polymer (excluding the weight of the counter ion of the cationic group). Multiplying the cationic charge density by the polymer molecular weight gives the number of positively charged sites in a given polymer chain.
  • Cationic charge density is further defined as the number of milliequivalents (meq / g) of positive charges (cationic nitrogen atoms) per gram of polymer.
  • the value of the cation charge density can be determined according to the following formula (1), for example.
  • Cationic charge density (meq / g) 1 ⁇ (unit molecular weight including one cationic nitrogen atom in the cationic polymer) ⁇ 1000 Formula (1)
  • the weight average molecular weight (hereinafter also simply referred to as molecular weight) of the cationic polymer is preferably 1,000 or more, more preferably 1,600 or more, and preferably 1 from the viewpoint of good growth of the filamentous fungus pellet. , 000,000 or less, more preferably 500,000 or less, more preferably 300,000 or less, and even more preferably 200,000 or less.
  • the molecular weight of the cationic polymer is preferably 1,000 to 1,000,000, more preferably 1,000 to 500,000, more preferably 1,000 to 300,000, and still more preferably 1,600 to 200,000. 000.
  • the weight average molecular weight of the cationic polymer is preferably 1,000 or more, more preferably 2,000 or more, more preferably 5,000 or more, more preferably 100,000 or more, from the viewpoint of operability during culture. Moreover, Preferably it is 500,000 or less.
  • the average molecular weight is measured by a known measuring method such as gel permeation chromatography (GPC) and the measuring apparatus is not limited, but examples include HLC-8220 series manufactured by Tosoh.
  • the cationic polymer is preferably a water-soluble polymer.
  • the “water-soluble polymer” refers to a polymer whose dissolved amount exceeds 10 g when a polymer dried at 105 ° C. for 2 hours is dissolved in 100 g of water at 25 ° C.
  • the amount of the cationic polymer dissolved in 100 g of water is preferably 20 g or more, more preferably 100 g or more.
  • Examples of the cationic polymer include a polymer containing a primary amine, a polymer containing a secondary amine, a polymer containing a tertiary amine, and a polymer containing a quaternary amine.
  • Examples of the polymer containing a primary amine include polyallylamine, allylamine salt polymer, and allylamine amide salt polymer.
  • Examples of the polymer containing a secondary amine include polydiallylamine, diallylamine salt polymer, and diallylamine salt / acrylamide copolymer.
  • Examples of the polymer containing a tertiary amine include an alkyl diallylamine salt polymer and an alkyl diallylamine amide salt polymer.
  • polymer containing a quaternary amine examples include a diallyldialkylammonium salt polymer, a diallyldialkylammonium ethylsulfate polymer, and a diallyldialkylammonium salt / acrylamide copolymer.
  • polyethyleneimine, methyl glycol chitosan, amine-epichlorohydrin copolymer, cationized polyvinyl alcohol, cationized cellulose, cationized starch, cationized guar gum, and dicyandiamide-based polymer are exemplified.
  • Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group.
  • Examples of the salt include sulfate, hydrochloride, and acetate.
  • Examples of the allylamine salt polymer include allylamine hydrochloride polymer.
  • Examples of the allylamine amide salt polymer include allylamine amide sulfate polymer.
  • Examples of the diallylamine salt polymer include diallylamine hydrochloride polymer.
  • Examples of the alkyl diallylamine salt polymer include methyl diallylamine hydrochloride polymer and methyl diallylamine acetate polymer.
  • alkyl diallylamine amide salt polymer examples include methyl diallylamine amide sulfate polymer.
  • diallyldialkylammonium salt polymers polydiallyldimethylammonium chloride, polydiallylmethylethylammonium chloride, polyacrylic acid-co-diallyldimethylammonium chloride, polyacrylamide-co-diallyldimethylammonium chloride, polyacrylamide-co-acrylic acid- Examples thereof include co-diallyldimethylammonium chloride, polydiallyldimethylammonium ethyl sulfate, and polydiallylmethylethylammonium ethyl sulfate.
  • diallyldialkylammonium ethyl sulfate polymer examples include diallylmethylethylammonium ethyl sulfate. Further, poly 2- (methacryloyloxy) ethyl trimethyl ammonium chloride may be mentioned.
  • a cationic polymer can also be used individually or in combination of 2 or more types. Among them, polyethyleneimine, polyallylamine, allylamine salt polymer, diallyldialkylammonium salt polymer, diallyldialkylammonium ethylsulfate polymer, methyl glycol chitosan, and cationized polyvinyl alcohol are preferable from the viewpoint of increasing the density of pellets. More preferred are polyethyleneimine, polyallylamine, allylamine salt polymer and diallyldialkylammonium salt polymer, and more preferred are polyethyleneimine, polyallylamine and diallyldialkylammonium salt polymer.
  • the content of the cationic polymer in the culture solution is preferably 0.0001% (w / v) or more, more preferably 0.001% (w / v) or more, from the viewpoint of increasing the density of the pellet. Preferably it is 0.0015% (w / v) or more. From the same viewpoint as described above, it is preferably 2% (w / v) or less, more preferably 1% (w / v) or less, still more preferably 0.5% (w / v) or less.
  • the content of the cationic polymer in the culture solution is preferably 0.0001 to 2% (w / v), more preferably 0.001 to 1% (w / v), and still more preferably 0.0015 to 0.00. 5% (w / v).
  • Culture may be performed according to a normal procedure. Culture is usually performed under aerobic conditions.
  • the culture temperature is preferably 20 ° C or higher, more preferably 25 ° C or higher, and preferably 40 ° C or lower, more preferably 30 ° C or lower.
  • the initial pH of the medium is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and preferably 7 or less, more preferably 5 or less, from the viewpoint of good growth of the bacterial cells.
  • the culture period is preferably 30 minutes or more, more preferably 0.5 days or more after inoculating filamentous fungal spores in the culture solution, and preferably within 7 days, more preferably within 6 days, still more preferably. Is within 5 days.
  • a conventionally well-known thing can be employ
  • a flask, an aeration stirring type culture tank, a bubble column type culture tank, etc., and a fluidized bed culture tank are mentioned.
  • the stirring condition is preferably 80 r / min or more, more preferably 100 r / min or more, and preferably 250 r / min or less, more preferably 200 r / min or less.
  • the volume average particle size of the filamentous fungus pellet is preferably 150 ⁇ m or more, more preferably 250 ⁇ m or more, and preferably 3000 ⁇ m or less, more preferably from the viewpoint of high productivity of useful substances and separability when repeatedly using the catalyst. Is 1500 ⁇ m or less.
  • the volume average particle diameter is measured by image analysis by microscopic observation described later.
  • a step of further culturing and growing the filamentous fungus pellet may be performed.
  • the culture solution used for the growth of the filamentous fungus pellet is not particularly limited, but it is preferable to use a culture solution different from the culture solution in the step of germinating the spores of the filamentous fungus.
  • the inorganic culture solution containing glucose normally used is mentioned. Specifically, glucose is 7.5 to 30% (w / v), ammonium sulfate is 0.05 to 2% (w / v), and potassium dihydrogen phosphate is 0.03 to 0.6%.
  • W / v) a medium containing 0.01 to 0.1% (w / v) magnesium sulfate, and 0.005 to 0.05% (w / v) zinc sulfate.
  • the salt may be a hydrate.
  • the culture temperature is preferably 20 ° C or higher, more preferably 25 ° C or higher, and preferably 40 ° C or lower, more preferably 30 ° C or lower.
  • the pH of the medium is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and preferably 7 or less, more preferably 5 or less, from the viewpoint of growth of bacterial cells and productivity of useful substances.
  • the pH of the culture solution can be controlled using a base such as calcium hydroxide, sodium hydroxide, calcium carbonate or ammonia, or an acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid.
  • the culture period is preferably 30 minutes or longer, more preferably 6 hours or longer, more preferably 0.5 days or longer, and preferably 3 days or shorter, more preferably 2 days or shorter, more preferably 1 day or shorter. is there.
  • a conventionally well-known thing can be employ
  • the filamentous fungal pellet After culturing, the filamentous fungal pellet can be extracted from the culture tank together with the culture solution, and separated and recovered by a simple operation such as filtration or centrifugation. It is also possible to use the filamentous fungus pellet for substance production in the same culture tank while leaving the filamentous fungus pellet in the culture tank.
  • the filamentous fungal pellet thus obtained has a high mycelial density. Therefore, the filamentous fungus pellet is useful for improving the fermentation productivity of useful substances.
  • the density of the filamentous fungal pellet is 0.04 g-dry cell / cm 3 or more, more preferably 0.1 g-dry cell / cm 3 or more, and 0.5 g-dry from the viewpoint of productivity of useful substances.
  • the density is determined by the method described in Examples described later.
  • the useful substance in the present specification is a compound produced from a carbon source by the process of culturing filamentous fungi.
  • a compound include at least one selected from organic acids, enzymes, oils and fats, and alcohols.
  • Suitable useful substances that can be produced using the filamentous fungal pellets of the present invention are organic acids, ethanol or enzymes.
  • the organic acid include fumaric acid, lactic acid, itaconic acid, malic acid, and pyruvic acid. Of these, at least one selected from fumaric acid, pyruvic acid, lactic acid and malic acid is preferable, fumaric acid and lactic acid are more preferable, and fumaric acid is more preferable.
  • the enzyme include protease, oxygenase, amylase, cellulase, and isomerase.
  • the culture solution used in the production of useful substances usually contains a carbon source.
  • the culture solution may contain a nitrogen source, inorganic salts, other phosphorus sources, necessary nutrient sources such as vitamins, and the like.
  • the carbon source to be used contains the above nutrient source at a concentration suitable for culture, it is possible to use only the carbon source.
  • the carbon source, nitrogen source, and inorganic salts include the compounds described in the above [0014] paragraph.
  • a sugar solution containing a saccharide can also be used as a carbon source.
  • Examples thereof include sugar liquid obtained from starch, molasses, waste molasses, and sugar liquid obtained from lignocellulosic biomass. These can be used alone or in combination of two or more.
  • “lignocellulose-based biomass” in the present specification means biomass mainly composed of cellulose, hemicellulose, and lignin.
  • Specific examples of lignocellulosic biomass include inawara, rice husk, straw, bagasse, coconut shell, corn cob, weed, wood, and pulp and paper produced therefrom.
  • examples of starch include extracts of millet such as corn and beans such as soybean, and examples of molasses include those derived from sugar cane and sugar beet.
  • the initial carbon source concentration in the culture solution is preferably 1% (w / v) or more, more preferably 2% (w / v) or more, and further preferably 3% (w / v). In addition, it is preferably 40% (w / v) or less, more preferably 30% (w / v) or less, and still more preferably 20% (w / v) or less.
  • the initial carbon source concentration in the culture medium is preferably 1 to 40 (w / v)%, more preferably 2 to 30 (w / v)%, and further preferably 3 to 20 (w / v)%. It is.
  • the initial nitrogen source concentration in the culture solution is preferably 0.001% (w / v) or more, more preferably 0.002% (w / v) or more, more preferably 0, from the viewpoint of productivity. 0.004% (w / v) or more, preferably 0.5% (w / v) or less, more preferably 0.3% (w / v) or less, more preferably 0.1% (w / V) or less. From the viewpoint of productivity, the initial sulfate concentration in the culture solution is preferably 0.001% (w / v) or more, more preferably 0.005% (w / v) or more, more preferably 0.01.
  • the initial magnesium salt concentration in the culture solution is preferably 0.001% (w / v) or more, more preferably 0.002% (w / v) or more, and further preferably 0.003.
  • % (W / v) or more preferably 0.5% (w / v) or less, more preferably 0.2% (w / v) or less, still more preferably 0.1% (w / v).
  • the initial zinc salt concentration in the culture solution is preferably 0.00001% (w / v) or more, more preferably 0.00003% (w / v) or more, and further preferably 0.00005. % (W / v) or more, and preferably 0.1% (w / v) or less, more preferably 0.05% (w / v) or less, still more preferably 0.01% (w / v) or less. It is.
  • the culture temperature during production of the useful substance is preferably 20 ° C. or higher, more preferably 30 ° C. or higher, and preferably 40 ° C. or lower, more preferably 37 ° C. or lower.
  • the pH of the culture solution is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and preferably 7 or less, more preferably 5 or less, from the viewpoint of the growth of bacterial cells and the productivity of useful substances.
  • the pH can be controlled using a base such as calcium hydroxide, sodium hydroxide, calcium carbonate or ammonia, or an acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid.
  • As the gas used for the culture air or oxygen-enriched gas can be selected.
  • the ventilation conditions are preferably 0.1 vvm or more, more preferably 0.2 vvm or more, and preferably 2 vvm or less, more preferably 1 vvm or less.
  • a conventionally known culture tank can be appropriately used as a culture tank for culturing. From the viewpoint of high fumaric acid productivity, an aeration-stirring culture tank, a bubble column culture tank, and a fluidized bed culture tank are used. Preferably used.
  • the culture may be performed in any of batch, semi-batch and continuous methods. For example, when it is carried out in a semi-batch manner, the microbial cells and the fermentation broth can be separated, and a medium can be added to the separated and recovered microbial cells for further fermentation.
  • the method of extracting the same quantity of fermented liquids is employable.
  • the liquid level may be controlled by a liquid level sensor or the like so that the liquid level in the fermenter is kept constant.
  • Separation of bacterial cells and fermentation broth after culturing may be carried out by solid-liquid separation with a filter in the fermenter, or once extracted outside the tank and subjected to solid-liquid separation such as liquid cyclone or filtration, only the bacterial cells are separated. You may return in a fermenter.
  • the fermentation broth obtained after the separation is used as it is or after concentrating the fermentation broth, by a crystallization method, an ion exchange method, a solvent extraction method, or a method in which the precipitate is acid-decomposed after precipitation as an alkaline earth metal salt.
  • the product can be separated and recovered from the fermentation broth.
  • the present invention further discloses the following manufacturing method regarding the above-described embodiment.
  • a method for producing a filamentous fungus pellet comprising a step of germinating spores of a filamentous fungus in a culture solution containing a cationic polymer.
  • the filamentous fungus is preferably one or more selected from microorganisms belonging to the genus Rhizopus, the genus Trichoderma, the genus Aspergillus and the genus Mucor, more preferably Rhizopus delemar (Rhizopus delemar), Rhizopus oryzae (Rhizopus oryzae), Rhizopus Arizusu (Rhizopus arrhizus), Rhizopus chinensis (Rhizopus chinensis), Rhizopus nigricans (Rhizopus nigricans), Rhizopus Tonkinenshisu (Rhizopus tonkinensis), Rhizopus ⁇ Rhizopus tritici, Trichoderma atrobi Ride (Trichoderma atroviride), Trichoderma harzianum (Trichoderma harzianum), Trichoderma Koningi (Trichoderma koningii), Trichoderma reesei (Trichoderma ressei), Trichoderma viride (
  • the filamentous fungus is preferably a genus Rhizopus or a genus Trichoderma, more preferably Rhizopus delemar, Rhizopus oryzae dseri
  • Spores of filamentous fungi are preferably 1 ⁇ 10 1 cells / spore / mL-culture solution or more, more preferably 1 ⁇ 10 2 cells / spore / mL-culture solution or more, preferably 1 ⁇ Inoculate a culture solution containing a cationic polymer at a number of spores of 10 8 spores / mL-culture medium or less, more preferably 1 ⁇ 10 4 spores / mL-culture solution or less to germinate spores.
  • the method for producing a filamentous fungus pellet according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • the initial nitrogen source concentration in the culture solution is preferably 0.1% (w / v) or more and 1% (w / v) or less, and the initial sulfate concentration is preferably 0.1. % (W / v) or more and 1% (w / v) or less, and the initial magnesium salt concentration is preferably 0.0001% (w / v) or more and 0.5% (w / v) or less.
  • the content of the cationic polymer in the culture solution is preferably 0.0001% (w / v) or more, more preferably 0.001% (w / v) or more, and further preferably 0.0015% ( w / v) or more, preferably 2% (w / v) or less, more preferably 1% (w / v) or less, still more preferably 0.5% (w / v) or less, Preferably 0.0001 to 2% (w / v), more preferably 0.001 to 1% (w / v), and still more preferably 0.0015 to 0.5% (w / v).
  • the charge density of the cationic polymer is preferably 0.1 meq / g or more, more preferably 1 meq / g or more, further preferably 2 meq / g or more, more preferably 10 meq / g or more, and preferably 100 meq / g or less, more preferably 50 meq / g or less, still more preferably 30 meq / g or less, preferably 0.1 meq / g to 100 meq / g, more preferably 1 meq / g to 50 meq / g, more preferably Is 2 meq / g to 30 meq / g, more preferably 10 meq / g to 30 meq / g.
  • the weight average molecular weight of the cationic polymer is preferably 1,000 or more, more preferably 1,600 or more, preferably 1,000,000 or less, more preferably 500,000 or less, more preferably Is 300,000 or less, more preferably 200,000 or less, preferably 1,000 to 1,000,000, more preferably 1,000 to 500,000, more preferably 1,000 to 300,000.
  • the weight average molecular weight of the cationic polymer is preferably 1,000 or more, more preferably 2,000 or more, more preferably 5,000 or more, more preferably 100,000 or more, and preferably 500. 1,000 to 500,000, preferably 1,000 to 500,000, more preferably 2,000 to 500,000, still more preferably 5,000 to 500,000, still more preferably 100,000 to 500,000.
  • ⁇ 11> The method for producing a filamentous fungus pellet according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, wherein the cationic polymer is preferably a water-soluble cationic polymer.
  • the cationic polymer is preferably a polydiallyldialkylammonium salt or copolymer thereof, polyethyleneimine, polyallylamine or salt thereof, methyl glycol chitosan, amine-epichlorohydrin copolymer, cationized polyvinyl alcohol, cationized cellulose, One or more selected from cationized starch, cationized guar gum, dicyandiamide polymer, and poly 2- (methacryloyloxy) ethyltrimethylammonium chloride, more preferably polyallylamine or a salt thereof, methyl glycol chitosan, Any one of ⁇ 1> to ⁇ 11> selected from polydiallyldialkylammonium salt or a copolymer thereof, polyethyleneimine and cationized polyvinyl alcohol Method for producing a filamentous fungus pellets described.
  • a polydiallyldialkylammonium salt or a copolymer thereof is preferably polydiallyldimethylammonium chloride, polydiallylmethylethylammonium chloride, polyacrylic acid-co-diallyldimethylammonium chloride, polyacrylamide-co-diallyldimethylammonium chloride.
  • ⁇ 12> which is one or more selected from polyacrylamide-co-acrylic acid-co-diallyldimethylammonium chloride, polydiallyldimethylammonium ethyl sulfate, and polydiallylmethylethylammonium ethyl sulfate A method for producing filamentous fungal pellets.
  • the culture temperature is preferably 20 ° C. or higher, more preferably 25 ° C. or higher, and preferably 40 ° C. or lower, more preferably 30 ° C. or lower. Any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>
  • the initial pH of the culture solution containing the cationic polymer is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and preferably 7 or less, more preferably 5 or less ⁇ 1> to ⁇ 14> The manufacturing method of the filamentous fungus pellet of any one of these.
  • the culture period is preferably 30 minutes or longer, more preferably 0.5 days or longer, preferably 7 days or less, more preferably 6 days or less, even more preferably 5 days or less ⁇ 1>
  • the volume average particle diameter of the filamentous fungus pellet is preferably 150 ⁇ m or more, more preferably 250 ⁇ m or more, and preferably 3000 ⁇ m or less, more preferably 1500 ⁇ m or less, and any one of ⁇ 1> to ⁇ 16> 2.
  • the culture solution used for the growth of the filamentous fungal pellet is preferably 7.5-30% (w / v) glucose, 0.05-2% (w / v) ammonium sulfate, potassium dihydrogen phosphate 0.03-0.6% (w / v), magnesium sulfate heptahydrate 0.01-0.1% (w / v), and zinc sulfate heptahydrate 0.005-
  • the culture temperature in the step of growing the filamentous fungal pellet is preferably 20 ° C. or higher, more preferably 25 ° C.
  • the pH of the culture solution in the step of growing the filamentous fungal pellet is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and preferably 7 or less, more preferably 5 or less ⁇ 18> to ⁇ 20
  • the culture period in the step of growing the filamentous fungus pellet is preferably 30 minutes or more, more preferably 6 hours or more, more preferably 0.5 days or more, and preferably 3 days or less, more preferably
  • the density of the filamentous fungal pellet is preferably 0.04 g-dry cell / cm 3 or more, more preferably 0.1 g-dry cell / cm 3 or more, and preferably 0.5 g-dry cell / cm 3.
  • the filamentous fungus pellet according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 22> which is cm 3 or less, more preferably 0.3 g-dry cell / cm 3 or less, more preferably 0.25 g-dry cell / cm 3 or less.
  • Manufacturing method. ⁇ 24> A method for producing at least one selected from an organic acid and ethanol using a filamentous fungus pellet obtained by the production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 23> in a culture solution containing a carbon source .
  • the organic acid is preferably at least one selected from fumaric acid, lactic acid, itaconic acid, malic acid and pyruvic acid, more preferably at least selected from fumaric acid, pyruvic acid, lactic acid and malic acid It is 1 type, More preferably, they are fumaric acid and lactic acid, More preferably, it is fumaric acid, The method as described in ⁇ 24>.
  • the initial carbon source concentration in the culture solution is preferably 1% (w / v) or more, more preferably 2% (w / v) or more, and further preferably 3% (w / v) or more.
  • the culture solution preferably contains a nitrogen source and inorganic salts.
  • the initial nitrogen source concentration in the culture solution is preferably 0.001% (w / v) or more, more preferably 0.002% (w / v) or more, more preferably 0.004% (w / V) or more, preferably 0.5% (w / v) or less, more preferably 0.3% (w / v) or less, more preferably 0.1% (w / v) or less.
  • the initial sulfate concentration is preferably 0.001% (w / v) or more, more preferably 0.005% (w / v) or more, more preferably 0.01% (w / v) or more.
  • the salt concentration is preferably 0.001% (w / v) or more, more preferably 0.002% (w / v) or more. More preferably, it is 0.003% (w / v) or more, preferably 0.5% (w / v) or less, more preferably 0.2% (w / v) or less, still more preferably 0.00.
  • the initial zinc salt concentration is preferably 0.00001% (w / v) or more, more preferably 0.00003% (w / v) or more, and still more preferably 0.0. 00005% (w / v) or more, preferably 0.1% (w / v) or less, more preferably 0.05% (w / v) or less, still more preferably 0.01% (w / v) ⁇ 27>
  • the culture temperature when producing at least one selected from organic acids and ethanol is preferably 20 ° C or higher, more preferably 30 ° C or higher, and preferably 40 ° C or lower, more preferably 37 ° C.
  • the pH of the culture solution is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and preferably 7 or less, more preferably 5 or less, according to any one of ⁇ 24> to ⁇ 29> Method.
  • the ⁇ 31> density is preferably 0.04 g-dry cell / cm 3 or more, more preferably 0.1 g-dry cell / cm 3 or more, and preferably 0.5 g-dry cell / cm 3 or less. More preferably 0.3 g-dry cell / cm 3 or less, more preferably 0.25 g-dry cell / cm 3 or less.
  • [Cationic polymer] The following polymers were used in Examples 1-16. ⁇ Polyethyleneimine (PEI, molecular weight 10,000, charge density 23.2meq / g, manufactured by Alfa Asesar) ⁇ Polyallylamine (PAA-01, molecular weight 1,600, charge density 17.5meq / g, manufactured by Nittobo Medical) ⁇ Polyallylamine (PAA-05, molecular weight 5,000, charge density 17.5meq / g, manufactured by Nittobo Medical) ⁇ Polyallylamine (PAA-15c, molecular weight 15,000, charge density 17.5meq / g, manufactured by Nittobo Medical) ⁇ Polyallylamine (PAA-25, molecular weight 25,000, charge density 17.5meq / g, manufactured by Nittobo Medical) ⁇ Polyallylamine hydrochloride (PAA-HCl-01, molecular weight 1,600, charge density 10.7meq / g, manufactured by Nittobo Medical) ⁇
  • Example 1 ⁇ Preparation of filamentous fungus pellet> (Preparation of spore suspension)
  • the strain is a filamentous fungus R. cerevisiae obtained from the National Institute of Technology and Evaluation (NITE). delmar JCM5557 was used. Filamentous fungi are streaked / applied on PDA medium (Difco Potato Dextose Agar, manufactured by Becton, Dickinson and Company) prepared in a petri dish, statically cultured at 30 ° C, and periodically subcultured. went.
  • PDA medium Difco Potato Dextose Agar, manufactured by Becton, Dickinson and Company
  • spores were collected from the petri dish, and the spores were suspended in 40 mL of a spore collection solution (NaCl 0.85%, Tween 80 0.05%). Thereafter, a spore suspension was prepared by diluting with a sterile spore collection solution (NaCl 0.85%, Tween 80 0.05%) to 1 ⁇ 10 7 spores / mL. The spore concentration was measured with a fully automatic cell counter (TC20 TM , manufactured by Bio-Rad Laboratories).
  • ⁇ Measurement of density per filamentous fungus pellet> After completion of the culture, 100 mL of the culture solution containing the cells was sampled for weight measurement, and the filamentous fungus pellet was separated by filtration using a nylon membrane filter (aperture 180 ⁇ m, manufactured by Millipore). Next, the separated filamentous fungus pellet was immersed in 200 mL of distilled water and stirred for 15 minutes at 170 r / min-27 ° C. using a shaker (PRXYg-98R, manufactured by Pris), and further the nylon membrane filter. And separated by filtration. This washing operation was performed three times.
  • the filamentous fungus pellet after washing was filtered again with a nylon membrane filter, and allowed to stand in a drier at 105 ° C. for 1 day to obtain dry cells.
  • the weight of the dry cells was measured, and the dry cell weight concentration [g-dry cell / L] was determined.
  • the pellet particle number concentration [number / L] was obtained by visually counting the number of pellets present per mL after washing.
  • the pellet volume per unit [cm 3 / piece] was determined by observing filamentous fungal pellets by image analysis (KEYENCE VHX-1000) after washing, and determining the volume average particle size for 100 pellets. The volume [cm 3 / piece] was calculated.
  • the density per filamentous fungus pellet was calculated from the following formula (1).
  • Filamentous pellet density [g-dry cell / cm 3 ] Dry cell weight concentration [g-dry cell / L] / Pellet particle number concentration [number / L] / Volume per filamentous fungal pellet [cm 3 / piece] (1)
  • Example 2 to [Example 12] Filamentous fungal pellets were obtained in the same manner as in Example 1 except that the cationic polymer shown in Table 1 was used.
  • Example 13 Example 1 except that polyallylamine hydrochloride (molecular weight: 120,000 to 200,000, charge density: 10.7, manufactured by Alfa Assar) was used as the cationic polymer, and the addition concentration was 0.5% (w / v). A filamentous fungus pellet was obtained in the same manner as described above.
  • Example 14 to [Example 15] Filamentous fungal pellets were obtained in the same manner as in Example 13 except that the addition concentration of polyallylamine hydrochloride was changed to 0.1% (w / v) or 0.01% (w / v).
  • Example 16 ⁇ Preparation of filamentous fungus pellet> [Spore recovery and preparation of frozen stock] As a strain, the filamentous fungus Trichoderma ressei was used. Filamentous fungi are streaked / coated on PDA medium (Difco Potato Dextose Agar, Becton, Dickinson and Company) prepared in a petri dish, and statically cultured at 30 ° C. for 7 days. Formed. After static culture, spores were collected from the petri dish, and the spores were suspended in a spore collection solution (NaCl 0.9%, Tween 80 0.03%).
  • PDA medium Difco Potato Dextose Agar, Becton, Dickinson and Company
  • the spore concentration was measured with a fully automatic cell counter (TC20 TM , manufactured by Bio-Rad Laboratories). After preparing a spore suspension, the suspension and an aqueous glycerol solution (40 vol%) were mixed at a volume ratio of 3: 1, and the mixture was stored at ⁇ 80 ° C. in an ultra-low temperature freezer (manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.). And used as a frozen stock.
  • TC20 TM fully automatic cell counter
  • Comparative Example 4 Filamentous fungus pellets were obtained in the same manner as in Comparative Example 3 except that sodium polyacrylate (0.5% (w / v)) was used as an additive.
  • Tables 1 and 2 show the results of Examples 1 to 16 and Comparative Examples 1 to 5.
  • the filamentous fungal pellets prepared in Examples 1 to 16 had higher mycelial density than the filamentous fungal pellets of Comparative Examples 1 to 5.
  • Example 17 ⁇ Preparation of filamentous fungus pellet> (Preparation of spore suspension) A spore suspension was prepared in the same manner as in Example 1 above.
  • the filamentous fungus pellet was prepared by the following two-stage culture.
  • the first stage culture is a spore germination and pelletization process
  • the second stage culture is a pellet growth process.
  • a PDB medium which is a pellet forming medium
  • a 30 L aeration / stirring tank manufactured by Mitsuwa Frontech Co., Ltd.
  • heat sterilized and then sterilized polyallylamine (molecular weight: 15,000).
  • the volume of the medium was adjusted to 15 L by adding sterilized water, and the culture was performed for 3 days under the conditions where the liquid temperature was 27 ° C., the stirring speed was 300 r / min, the pressure in the tank was 0.040 MPa, the air was supplied and the DO was controlled to 1.0 ppm. It was. Further, an antifoaming sensor (1% KM-72F (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co.)) was controlled using an antifoaming sensor during foaming.
  • the supernatant of the culture broth was drained from the 30 L aeration and agitation tank through a 250 ⁇ m aperture metal filter. Then, after putting the sterilized growth medium in the tank, sterilized distilled water was added so that the amount of liquid in the tank was 15 L, and each compound was added so that the medium concentration was as follows.
  • Medium concentration is 6% (w / v) glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), magnesium sulfate heptahydrate 0.025% (w / v), zinc sulfate heptahydrate 0.009% (w / v) v), ammonium sulfate 0.1% (w / v), monopotassium dihydrogen phosphate 0.06% (w / v).
  • the culture was carried out for 12 hours under the conditions of 27 ° C., stirring speed 300 r / min, tank internal pressure 0.040 MPa, air was supplied and DO was controlled to 2 ppm.
  • the pH during the culture was maintained at 4 by adding 7N sodium hydroxide as appropriate. Further, as in the first-stage culture, control was performed so that an antifoaming agent (1% KM-72F) was added during foaming.
  • the filamentous fungus pellet culture obtained by the above operation was filtered with a nylon mesh filter for several tens of seconds until the filtrate drip settled to obtain a wet filamentous fungus pellet.
  • the pellets obtained in the second stage were immediately subjected to fermentability evaluation. Some were washed by the same method as in Example 1, and then the filamentous fungus pellet density [g-dry cell / cm 3 ] was calculated.
  • the medium composition at this time was 10% (w / v) glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.025% (w / v) magnesium sulfate heptahydrate, 0.009% zinc sulfate heptahydrate (W / v), ammonium sulfate 0.1% (w / v), and the rest were water, so that the occupied volume of the filamentous fungal pellet relative to the medium was 36 vol%.
  • sampling at the 0th hour of culture was performed, and then the culture was performed under the conditions of supplying high concentration oxygen (> 90%) at 35 ° C., stirring speed 500 r / min, aeration speed 0.3 to 1.0 vvm. It was. Thereafter, the cells were cultured for 5 hours while sampling over time.
  • the pH was maintained at pH (35 ° C.) 4 by appropriately adding 7N sodium hydroxide solution.
  • HPLC analysis conditions are as follows. ⁇ Column: ICSep ICE-ION-300 Eluent: 0.0085 normal sulfuric acid, 0.4 mL / min ⁇ Detection method: RI (HITACHI, L-2490) -Column temperature: 40 ° C -Injection volume: 20 ⁇ L -Holding time: 40 min
  • the filamentous fungus pellet was prepared by the following two-stage culture. In the first stage of culture, 0.5% (w / v) sorbitan monolaurate and PDB medium and 0.5% (w / v) sorbitan monolaurate were added in a 30 L aeration and agitation tank (Mitsuwa Corporation). After sterilization by heat and sterilization, the spore suspension was inoculated to 1 ⁇ 10 4 spores / mL.
  • the volume of the medium was adjusted to 15 L by adding sterilized water, and the culture was performed for 3 days under the conditions where the liquid temperature was 27 ° C., the stirring speed was 300 r / min, the pressure in the tank was 0.040 MPa, the air was supplied and the DO was controlled to 1.0 ppm. It was. Further, an antifoaming sensor (1% KM-72F (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co.)) was controlled using an antifoaming sensor during foaming.
  • the second stage culture was performed in the same manner as in Example 17.
  • Example 17 After completion of the culture, a wet filamentous fungal pellet was obtained by the same method as in Example 17 and immediately subjected to fermentability evaluation. For some, the filamentous fungus pellet density [g-dry cell / cm 3 ] was calculated.
  • Table 3 shows the evaluation results of Example 17 and Comparative Example 6. In addition, the result adopted the speed

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Abstract

高密度な糸状菌ペレットを製造する方法の提供。　糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させる工程を含む、糸状菌ペレットの製造方法。

Description

糸状菌ペレットの製造方法
　本発明は、糸状菌ペレットの製造方法に関する。
　糸状菌は、有機酸や酵素類等の有用物質の微生物学的生産に産業上欠かせられない有用微生物である。糸状菌を液体培養すると、胞子接種量、培養液のｐＨ、流動条件等によりその形態は繊維状、塊状又はペレット状等に変化する。糸状菌ペレットは発酵後の培地からの分離が容易等の利点を有する（例えば、特許文献１）。
　非特許文献１では、培養液に特定のノニオン界面活性剤を添加し、糸状菌ペレットを形成させることが報告されている。また、非特許文献２では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒの菌糸凝集体を形成させることが報告されている。
　　（特許文献１）特開平６－２５３８７１号公報
　　（非特許文献１）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４、１９８９年、ｐ．１５５－１６１
　　（非特許文献２）第４８回化学工学会ポスター、ＬＱ２６８
　本発明は、糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させる工程を含む、糸状菌ペレットの製造方法、及び、菌糸密度の高い糸状菌ペレットを提供するものである。
発明の詳細な説明
　本発明は、高密度な糸状菌ペレットを製造する方法を提供することに関する。
　本発明者は、糸状菌のペレット化について検討した結果、カチオン性ポリマーを含む培養液中で糸状菌胞子を発芽させ、ペレットを形成させると、菌糸密度の高い糸状菌ペレットが得られることを見出した。
　本発明によれば、高密度な糸状菌ペレットが得られる。
　本発明の糸状菌ペレットの製造方法は、糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させ、ペレットを形成させる工程を含む、製造方法である。
（糸状菌）
　本発明に用いられる糸状菌としては、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物等が挙げられる。
　リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌としては、例えば、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾプス・キネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・ニグリカンス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、リゾプス・トンキネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｔｒｉｔｉｃｉ）等が挙げられる。
　トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌としては、例えば、トリコデルマ・アトロビリデ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）等が挙げられる。
　アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌としては、例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）等が挙げられる。
　ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属菌としては、ムコール・マンドシュリクス（Ｍｕｃｏｒ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）等が挙げられる。
　これらの糸状菌は、単独で使用すればよいが、２種以上組み合わせて使用することもできる。
　なかでも、有用物質の生産性、取扱性の観点から、リゾプス属菌又はトリコデルマ属菌が好ましく、リゾプス・デレマー、リゾプス・オリザエがより好ましい。本明細書における有用物質については後述する。
（糸状菌の胞子と胞子懸濁液の調整）
　糸状菌の胞子は、糸状菌の胞子をポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）等の培地に接種して静置培養を行い、培養物を液体に懸濁した胞子懸濁液として調製することができる。胞子懸濁液は、適宜希釈して所望の胞子数に調整することができる。
　胞子懸濁液を調製するための静置培養の条件としては、胞子増殖の観点から、培養温度は、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。培養日数は、好ましくは７日以上、１０日以下である。
　胞子懸濁液中の胞子数は、後述するセルカウンターにて計測することができる。
（胞子の発芽とペレット化の工程）
　胞子懸濁液を、培養液に接種して培養することで、胞子は発芽し、菌糸体へと成長して、ペレットを形成する。
　ここで、本明細書において「ペレット」とは、液体培養により菌糸が自発的に形成した数百μｍ～数ｍｍ程度の大きさの菌糸塊をいう。
　培養液に接種する糸状菌の胞子数は、糸状菌ペレットの良好な生育の観点から、好ましくは１×１０1個－胞子／ｍＬ－培養液以上、より好ましくは１×１０2個－胞子／ｍＬ－培養液以上であり、また、上記と同様の観点から、好ましくは１×１０8個－胞子／ｍＬ－培養液以下であり、より好ましくは１×１０4個－胞子／ｍＬ－培養液以下である。
　培養液は、糸状菌を生育可能な液体培地であれば、合成培地、天然培地及び天然成分を合成培地に添加した半合成培地のいずれでもよい。例えば、ポテトデキストロース培地（ＰＤＢ培地）、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ（ＮＢ培地）、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ培地（ＳＢ培）等を利用することができる。
　培養液には、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源等を含有することができる。
　炭素源としては、糖類が挙げられる。糖類としては、グルコース、フルクトース、キシロース等の単糖類、スクロース、ラクトース、マルトース等の二糖類が挙げられる。糖類は無水物又は水和物であってもよい。これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。なかでも、生産性の観点から、グルコースが好ましい。培養液中の当初の炭素源濃度は、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、３０％（ｗ／ｖ）以下である。
　窒素源としては、例えば、尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物が挙げられる。培養液中の当初の窒素源濃度は、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、１％（ｗ／ｖ）以下である。
　無機塩としては、硫酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。
　硫酸塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。培養液中の当初の硫酸塩濃度は、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、１％（ｗ／ｖ）以下である。
　マグネシウム塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。培養液中の当初のマグネシウム塩濃度は、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以下である。
　亜鉛塩としては、例えば、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化亜鉛等が挙げられる。培養液中の当初の亜鉛塩濃度は、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以下である。
（カチオン性ポリマー）
　本発明では、胞子の発芽とペレット化は、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で行われる。
　本発明に用いられる「カチオン性ポリマー」とは、水と混合された場合、正に帯電するポリマーをいう。カチオン性ポリマーの具体的な事例は、カチオン性基を有するモノマー、あるいは水中でカチオン性を示すアミノ基を有するモノマーの重合体、及び、これらのモノマーと他のモノマーの共重合体又は縮重合体が好ましい。
　カチオン性基としては、第４級アミノ基、ヒドラジノ基等が挙げられ、水中でカチオン性を示すアミノ基としては、例えば第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基が挙げられる。
　カチオン性ポリマーの電荷密度は、ペレットの密度を高める観点から、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｇ以上であり、より好ましくは１ｍｅｑ／ｇ以上、更に好ましくは２ｍｅｑ／ｇ以上、更に好ましくは１０ｍｅｑ／ｇ以上である。また、上記と同様の観点から、好ましくは１００ｍｅｑ／ｇ以下であり、より好ましくは５０ｍｅｑ／ｇ以下であり、より好ましくは３０ｍｅｑ／ｇ以下である。
　カチオン性ポリマーの電荷密度は、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｇ～１００ｍｅｑ／ｇであり、より好ましくは１ｍｅｑ／ｇ～５０ｍｅｑ／ｇであり、より好ましくは２ｍｅｑ／ｇ～３０ｍｅｑ／ｇであり、更に好ましくは１０ｍｅｑ／ｇ～３０ｍｅｑ／ｇである。
　ここで、カチオン電荷密度とは、ポリマー上の正電荷の数と該ポリマーの分子量（カチオン基の対イオンの重量は除く）の比を指す。カチオン電荷密度にポリマー分子量を乗じると、所与のポリマー鎖における正に荷電した部位の数が求められる。カチオン電荷密度は更に、ポリマーのグラム当たりの正電荷（カチオン性を有する窒素原子）のミリ当量の数（ｍｅｑ／ｇ）として定義される。
　カチオン電荷密度の値は、たとえば、以下の式（１）に従い求めることができる。
カチオン電荷密度（ｍｅｑ／ｇ）＝１÷（カチオンポリマー中のカチオン性を有する窒素原子を１つ含む単位分子量）×１０００　・・・　式（１）
　カチオン性ポリマーの重量平均分子量（以下、単に分子量ともいう）は、糸状菌ペレットの良好な生育の観点から、好ましくは１，０００以上、より好ましくは１，６００以上であり、また、好ましくは１，０００，０００以下、より好ましくは５００，０００以下、より好ましくは３００，０００以下、更に好ましくは２００，０００以下である。カチオン性ポリマーの分子量は、好ましくは１，０００～１，０００，０００、より好ましくは１，０００～５００，０００、より好ましくは１，０００～３００，０００、更に好ましくは１，６００～２００，０００である。
　また、カチオン性ポリマーの重量平均分子量は、培養時の操作性の観点から、好ましくは１，０００以上、より好ましくは２，０００以上、より好ましくは５，０００以上、より好ましくは１００，０００以上であり、また、好ましくは５００，０００以下である。
　なお、平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）等の公知の測定方法により測定され、測定装置は拘らないが、例としては、東ソー製ＨＬＣ－８２２０シリーズ等が挙げられる。
　カチオン性ポリマーは、水溶性ポリマーであることが好ましい。ここで、「水溶性ポリマー」とは、１０５℃で２時間乾燥させたポリマーを、２５℃の水１００ｇに溶解させたときに、その溶解量が１０ｇを超えるポリマーをいう。カチオン性ポリマーの水１００ｇへの溶解量は、好ましくは２０ｇ以上、より好ましくは１００ｇ以上である。
　カチオン性ポリマーとしては、例えば、１級アミンを含むポリマー、２級アミンを含むポリマー、３級アミンを含むポリマー、４級アミンを含むポリマーが挙げられる。１級アミンを含むポリマーとして、ポリアリルアミン、アリルアミン塩重合体、アリルアミンアミド塩重合体が挙げられる。２級アミンを含むポリマーとして、ポリジアリルアミン、ジアリルアミン塩重合体、ジアリルアミン塩/アクリルアミド共重合体が挙げられる。３級アミンを含むポリマーとして、アルキルジアリルアミン塩重合体、アルキルジアリルアミンアミド塩重合体が挙げられる。４級アミンを含むポリマーとして、ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体、ジアリルジアルキルアンモニウムエチルサルフェイト重合体、ジアリルジアルキルアンモニウム塩/アクリルアミド共重合体が挙げられる。また、前記のポリマー以外にも、ポリエチレンイミン、メチルグリコールキトサン、アミン－エピクロルヒドリン共重合体、カチオン化ポリビニルアルコール、カチオン化セルロース、カチオン化澱粉、カチオン化グアーガム、ジシアンジアミド系高分子が挙げられる。上記のアルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基が挙げられる。また、上記の塩としては硫酸塩、塩酸塩、酢酸塩が挙げられる。
　アリルアミン塩重合体は、アリルアミン塩酸塩重合体が挙げられる。アリルアミンアミド塩重合体はアリルアミンアミド硫酸塩重合体が挙げられる。ジアリルアミン塩重合体は、ジアリルアミン塩酸塩重合体が挙げられる。アルキルジアリルアミン塩重合体はメチルジアリルアミン塩酸塩重合体、メチルジアリルアミン酢酸塩重合体が挙げられる。アルキルジアリルアミンアミド塩重合体として、メチルジアリルアミンアミド硫酸塩重合体が挙げられる。ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体として、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリジアリルメチルエチルアンモニウムクロライド、ポリアクリル酸－ｃｏ－ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアクリルアミド－ｃｏ－ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアクリルアミド－ｃｏ－アクリル酸－ｃｏ－ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリジアリルジメチルアンモニウムエチルサルフェイト、ポリジアリルメチルエチルアンモニウムエチルサルフェイトが挙げられる。
　ジアリルジアルキルアンモニウムエチルサルフェイト重合体としてジアリルメチルエチルアンモニウムエチルサルフェイトが挙げられる。また、ポリ２－（メタクリロイルオキシ）エチルトリメチルアンモニウムクロライドが挙げられる。
　カチオン性ポリマーは、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することもできる。
　なかでも、ペレットの密度を高める観点から、好ましくはポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、アリルアミン塩重合体、ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体、ジアリルジアルキルアンモニウムエチルサルフェイト重合体、メチルグリコールキトサン、カチオン化ポリビニルアルコールであり、より好ましくはポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、アリルアミン塩重合体、ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体であり、より好ましくはポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体である。
　培養液中のカチオン性ポリマーの含有量は、ペレットの密度を高める観点から、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００１５％（ｗ／ｖ）以上である。また、上記と同様の観点から、好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下である。培養液中のカチオン性ポリマーの含有量は、好ましくは０．０００１～２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００１～１％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．００１５～０．５％（ｗ／ｖ）である。
（胞子の発芽とペレット化時の培養方法）
　培養は、通常の手順にて行えばよい。培養は、通常、好気的条件で行われる。
　培養温度は、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。
　培地の初発ｐＨは、菌体の良好な生育の観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である。
　培養期間は、糸状菌の胞子を培養液に植菌後、好ましくは３０分以上、より好ましくは０．５日以上であり、また、好ましくは７日以内、より好ましくは６日以内、更に好ましくは５日以内である。
　培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。例えば、フラスコ、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽等、及び流動床培養槽が挙げられる。撹拌条件は、好ましくは８０ｒ／ｍｉｎ以上、より好ましくは１００ｒ／ｍｉｎ以上であり、また、好ましくは２５０ｒ／ｍｉｎ以下、より好ましくは２００ｒ／ｍｉｎ以下である。
　培養温度、培養期間、撹拌条件等を変更することにより、所望の大きさや外観のペレットを形成することができる。
　糸状菌ペレットの体積平均粒径は、有用物質の高い生産性と触媒繰返し利用時の分離性の観点から、好ましくは１５０μｍ以上、より好ましくは２５０μｍ以上であり、また、好ましくは３０００μｍ以下、より好ましくは１５００μｍ以下である。
　なお、体積平均粒径は後述する顕微鏡観察による画像解析で測定される。
（ペレットの増殖工程）
　本発明では、有用物質の生産性向上の観点から、糸状菌ペレットをさらに培養して増殖させる工程を行ってもよい。
　糸状菌ペレットの増殖に用いられる培養液は特に限定されないが、糸状菌の胞子を発芽させる工程の培養液とは異なる培養液を用いるのが好ましい。例えば、通常使用されるグルコースを含む無機培養液が挙げられる。具体的には、グルコースを７．５以上３０％以下（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウムを０．０５以上２％以下（ｗ／ｖ）、リン酸２水素カリウムを０．０３以上０．６％以下（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウムを０．０１以上０．１％以下（ｗ／ｖ）、及び硫酸亜鉛を０．００５以上０．０５％以下（ｗ／ｖ）含有する培地等が挙げられる。上記の塩は水和物であっても良い。
　培養条件としては、培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。
　また、培地のｐＨは、菌体の生育や、有用物質の生産性の観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である。培養液のｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
　培養期間は、好ましくは３０分以上、より好ましくは６時間以上、より好ましくは０．５日以上であり、また、好ましくは３日以下、より好ましくは２日以下、より好ましくは１日以下である。
　また、培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。具体的には、フラスコ、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床培養槽等が挙げられる。
　培養後、糸状菌ペレットは、培養液と共に培養槽から抜き出して、ろ過、遠心分離等の簡便な操作により分離回収することができる。培養槽に糸状菌ペレットを残したまま、同一培養槽で糸状菌ペレットを物質生産に利用することも可能である。
　かくして得られる糸状菌ペレットは、菌糸密度が高い。従って、当該糸状菌ペレットは、有用物質の発酵生産性向上に有用である。
　糸状菌ペレットの密度は、有用物質の生産性の観点から、０．０４ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上、より好ましくは０．１ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上であり、また、０．５ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．３ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．２５ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下である。当該密度は、後述する実施例に記載の方法で求められる。
　本明細書における有用物質は、糸状菌の培養の過程により炭素源から生産される化合物である。このような化合物としては、例えば、有機酸、酵素、油脂及びアルコールから選ばれる少なくとも１種が挙げられる。本発明の糸状菌ペレットを用いて生産することができる好適な有用物質は、有機酸、エタノール又は酵素である。有機酸としては、例えば、フマル酸、乳酸、イタコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸等が挙げられる。なかでも、好ましくは、フマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはフマル酸、乳酸であり、更に好ましくはフマル酸である。酵素としては、例えば、プロテアーゼ、オキシゲナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、イソメラーゼが挙げられる。
（糸状菌ペレットを用いた有用物質の生産）
　有用物質の生産時に用いられる培養液は、通常、炭素源を含む。培養液には、炭素源の他、窒素源、無機塩類、その他リン源、ビタミン等の必要な栄養源等を含有することができる。使用する炭素源に培養に適切な濃度の上記栄養源が含まれている場合には、炭素源のみを用いることも可能である。炭素源、窒素源、無機塩類としては、前記［００１４］段落記載の化合物が挙げられる。
　有用物質の生産時に用いられる培養液においては、炭素源として、糖類を含有する糖液を使用することもできる。例えば、でんぷんから得られる糖液、糖蜜、廃糖蜜、リグノセルロース系バイオマスから得られる糖液が挙げられる。これらは１種又は２種以上組み合わせて使用することができる。ここで、本明細書において「リグノセルロース系バイオマス」とは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを主成分とするバイオマスを意味する。リグノセルロース系バイオマスとしては、具体例には、イナワラ、籾殻、麦わら、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、雑草、木材、及びそれらから製造されたパルプ及び紙等が挙げられる。また、でんぷんとしては、例えば、トウモロコシ等の雑穀類、大豆等の豆類の抽出物が挙げられ、糖蜜としては、例えば、サトウキビ、テンサイ等に由来するものが挙げられる。
　培養液中の当初の炭素源濃度は、生産性の観点から、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは２％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは３％（ｗ／ｖ）以上であって、また、好ましくは４０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは３０％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは２０％（ｗ／ｖ）以下である。また、培養液中の当初の炭素源濃度は、好ましくは１～４０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは２～３０（ｗ／ｖ）％、更に好ましくは３～２０（ｗ／ｖ）％である。
　また、培養液中の当初の窒素源濃度は、生産性の観点から、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００２％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００４％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．３％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下である。
　培養液中の当初の硫酸塩濃度は、生産性の観点から、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０８％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）以下である。
　培養液中の当初のマグネシウム塩濃度は、生産性の観点から、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００２％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００３％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下である。
　培養液中の当初の亜鉛塩濃度は、生産性の観点から、好ましくは０．００００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００００３％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００００５％（ｗ／ｖ）以上、そして、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以下である。
　有用物質の生産時の培養温度は、好ましくは２０℃以上、より好ましくは３０℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３７℃以下である。
　培養液のｐＨは、菌体の生育や、有用物質の生産性の観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である。ｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
　培養に用いるガスは、空気や酸素富化されたガスを選択できる。通気条件は、好ましくは０．１ｖｖｍ以上、より好ましくは０．２ｖｖｍ以上であり、また、好ましくは２ｖｖｍ以下、より好ましくは１ｖｖｍ以下である。
　また、培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができるが、フマル酸の高い生産性の観点から、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床培養槽が好ましく使用される。
　培養は、回分式、半回分式及び連続式のいずれで行ってもよい。例えば、半回分式で行う場合、菌体と発酵液とを分離し、分離回収した菌体に培地を加えて更に発酵を行うことができる。また、連続式で行う場合、一定量の培地を発酵槽内に一定速度で供給するとともに、同量の発酵液を抜き取るという方法を採用することができる。その場合、発酵槽内の液面高さを一定に保つように、液面高さを液面センサー等により制御してもよい。また、発酵時に炭素源のみを供給することも可能であり、炭素源の供給は、流速で制御しても、グルコース濃度で制御してもよい。
　培養後の菌体と発酵液の分離は、発酵槽内でフィルターにより固液分離してもよいし、一度槽外に抜き出して液体サイクロンやろ過等の固液分離に供した後に菌体のみを発酵槽内に戻してもよい。
（有用物資の回収）
　分離後に得られた発酵液はそのまま、或いは発酵液を濃縮した後、晶析法、イオン交換法、溶剤抽出法、あるいはアルカリ土類金属塩として析出させた後析出物を酸分解する方法等により、発酵液から生成物を分離し回収することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の製造方法を開示する。
＜１＞糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させる工程を含む、糸状菌ペレットの製造方法。
＜２＞糸状菌が、好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属及びムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物から選ばれる１種又は２種以上であり、より好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾプス・キネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・ニグリカンス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、リゾプス・トンキネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｔｒｉｔｉｃｉ）、トリコデルマ・アトロビリデ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）及びムコール・マンドシュリクス（Ｍｕｃｏｒ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）から選ばれる１種又は２種以上である＜１＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜３＞糸状菌が、好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌であり、より好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）又はトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｓｅｉ）である＜１＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜４＞糸状菌の胞子を、好ましくは１×１０1個－胞子／ｍＬ－培養液以上、より好ましくは１×１０2個－胞子／ｍＬ－培養液以上であり、また、好ましくは１×１０8個－胞子／ｍＬ－培養液以下、より好ましくは１×１０4個－胞子／ｍＬ－培養液以下の胞子数で、カチオン性ポリマーを含有する培養液に接種して胞子を発芽させる、＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜５＞培養液が、好ましくは炭素源、窒素源及び無機塩類を含有する＜１＞～＜４＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜６＞培養液中の当初の窒素源濃度が、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、１％（ｗ／ｖ）以下であり、当初の硫酸塩濃度が、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、１％（ｗ／ｖ）以下であり、当初のマグネシウム塩濃度が、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以下であり、当初の亜鉛塩濃度が、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以下である＜５＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜７＞培養液中のカチオン性ポリマーの含有量が、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００１５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下であり、また、好ましくは０．０００１～２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００１～１％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．００１５～０．５％（ｗ／ｖ）である＜１＞～＜６＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜８＞カチオン性ポリマーの電荷密度が、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｇ以上、より好ましくは１ｍｅｑ／ｇ以上、更に好ましくは２ｍｅｑ／ｇ以上、更に好ましくは１０ｍｅｑ／ｇ以上であり、また、好ましくは１００ｍｅｑ／ｇ以下、より好ましくは５０ｍｅｑ／ｇ以下、更に好ましくは３０ｍｅｑ／ｇ以下であり、また、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｇ～１００ｍｅｑ／ｇ、より好ましくは１ｍｅｑ／ｇ～５０ｍｅｑ／ｇ、より好ましくは２ｍｅｑ／ｇ～３０ｍｅｑ／ｇであり、更に好ましくは１０ｍｅｑ／ｇ～３０ｍｅｑ／ｇである＜１＞～＜７＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜９＞カチオン性ポリマーの重量平均分子量が、好ましくは１，０００以上、より好ましくは１，６００以上であり、また、好ましくは１，０００，０００以下、より好ましくは５００，０００以下、より好ましくは３００，０００以下、更に好ましくは２００，０００以下であり、また、好ましくは１，０００～１，０００，０００、より好ましくは１，０００～５００，０００、より好ましくは１，０００～３００，０００、更に好ましくは１，６００～２００，０００である＜１＞～＜８＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１０＞カチオン性ポリマーの重量平均分子量が、好ましくは１，０００以上、より好ましくは２，０００以上、より好ましくは５，０００以上、より好ましくは１００，０００以上であり、また、好ましくは５００，０００以下であり、また、好ましくは１，０００～５００，０００、より好ましくは２，０００～５００，０００、更に好ましくは５，０００～５００，０００、更に好ましくは１００，０００～５００，０００である＜１＞～＜８＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１１＞カチオン性ポリマーが、好ましくは水溶性カチオン性ポリマーである＜１＞～＜１０＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１２＞カチオン性ポリマーが、好ましくはポリジアリルジアルキルアンモニウム塩又はその共重合体、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン又はその塩、メチルグリコールキトサン、アミン－エピクロルヒドリン共重合体、カチオン化ポリビニルアルコール、カチオン化セルロース、カチオン化澱粉、カチオン化グアーガム、ジシアンジアミド系高分子、及びポリ２－（メタクリロイルオキシ）エチルトリメチルアンモニウムクロライドから選ばれる１種又は２種以上であり、より好ましくはポリアリルアミン又はその塩、メチルグリコールキトサン、ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩又はその共重合体、ポリエチレンイミン及びカチオン化ポリビニルアルコールから選ばれる１種又は２種以上である＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１３＞ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩又はその共重合体が、好ましくはポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリジアリルメチルエチルアンモニウムクロライド、ポリアクリル酸－ｃｏ－ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアクリルアミド－ｃｏ－ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアクリルアミド－ｃｏ－アクリル酸－ｃｏ－ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリジアリルジメチルアンモニウムエチルサルフェイト、及びポリジアリルメチルエチルアンモニウムエチルサルフェイトから選ばれる１種又は２種以上である＜１２＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１４＞培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である＜１＞～＜１３＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１５＞カチオン性ポリマーを含有する培養液の初発ｐＨが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である＜１＞～＜１４＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１６＞培養期間が、好ましくは３０分以上、より好ましくは０．５日以上であり、また、好ましくは７日以内、より好ましくは６日以内、更に好ましくは５日以内である＜１＞～＜１５＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１７＞糸状菌ペレットの体積平均粒径が、好ましくは１５０μｍ以上、より好ましくは２５０μｍ以上であり、また、好ましくは３０００μｍ以下、より好ましくは１５００μｍ以下である＜１＞～＜１６＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１８＞糸状菌の胞子を発芽させる工程の培養液とは異なる培養液中で糸状菌ペレットを増殖させる工程を更に含む、＜１＞～＜１７＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１９＞糸状菌ペレットの増殖に用いられる培養液が、好ましくはグルコースを７．５～３０％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウムを０．０５～２％（ｗ／ｖ）、リン酸２水素カリウムを０．０３～０．６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物を０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）、及び硫酸亜鉛・７水和物を０．００５～０．０５％（ｗ／ｖ）を含有する培養液である＜１８＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２０＞糸状菌ペレットを増殖させる工程における培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である＜１８＞又は＜１９＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２１＞糸状菌ペレットを増殖させる工程における培養液のｐＨが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である＜１８＞～＜２０＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２２＞糸状菌ペレットを増殖させる工程における培養期間が、好ましくは３０分以上、より好ましくは６時間以上、より好ましくは０．５日以上であり、また、好ましくは３日以下、より好ましくは２日以下、より好ましくは１日以下である＜１８＞～＜２１＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２３＞糸状菌ペレットの密度が、好ましくは０．０４ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上、より好ましくは０．１ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上であり、また、好ましくは０．５ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．３ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．２５ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下である＜１＞～＜２２＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２４＞炭素源を含有する培養液にて＜１＞～＜２３＞のいずれか１に記載の製造方法によって得られる糸状菌ペレットを用い有機酸及びエタノールから選ばれる少なくとも１種を製造する方法。
＜２５＞有機酸が、好ましくはフマル酸、乳酸、イタコン酸、リンゴ酸、及びピルビン酸から選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは、フマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはフマル酸、乳酸であり、更に好ましくはフマル酸である＜２４＞に記載の方法。
＜２６＞培養液中の当初の炭素源濃度が、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは２％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは３％（ｗ／ｖ）以上であって、また、好ましくは４０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは３０％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは２０％（ｗ／ｖ）以下であり、また、好ましくは１～４０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは２～３０（ｗ／ｖ）％、更に好ましくは３～２０（ｗ／ｖ）％である＜２４＞又は＜２５＞に記載の方法。
＜２７＞培養液が、好ましくは窒素源及び無機塩類を含有する＜２４＞～＜２６＞のいずれか１に記載の方法。
＜２８＞培養液中の当初の窒素源濃度が、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００２％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００４％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．３％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下であり、当初の硫酸塩濃度が、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０８％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）以下であり、当初のマグネシウム塩濃度が、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００２％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００３％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下であり、当初の亜鉛塩濃度が、好ましくは０．００００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００００３％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００００５％（ｗ／ｖ）以上、また、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以下である＜２７＞に記載の方法。
＜２９＞有機酸及びエタノールから選ばれる少なくとも１種を製造する時の培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは３０℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３７℃以下である＜２４＞～＜２８＞のいずれか１に記載の方法。
＜３０＞培養液のｐＨが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である＜２４＞～＜２９＞のいずれか１に記載の方法。
＜３１＞密度が、好ましくは０．０４ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上、より好ましくは０．１ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上であり、また、好ましくは０．５ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．３ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．２５ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下である糸状菌ペレット。
＜３２＞体積平均粒径が、好ましくは１５０μｍ以上、より好ましくは２５０μｍ以上であり、また、好ましくは３０００μｍ以下、より好ましくは１５００μｍ以下である＜３１＞記載の糸状菌ペレット。
[カチオン性ポリマー]
　実施例１～１６にて次の高分子を使用した。
・ポリエチレンイミン(PEI、分子量10,000、電荷密度23.2meq/g、Alfa Asesar製)
・ポリアリルアミン(PAA-01、分子量1,600、電荷密度17.5meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン(PAA-05、分子量5,000、電荷密度17.5meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン(PAA-15c、分子量15,000、電荷密度17.5meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン(PAA-25、分子量25,000、電荷密度17.5meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAA-HCl-01、分子量1,600、電荷密度10.7meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAA-HCl-05、分子量5,000、電荷密度10.7meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAA-HCl-3L、分子量30,000、電荷密度10.7meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAA-HCl-10L、分子量150,000、電荷密度10.7meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(PAS-H、分子量200,000、電荷密度6.19meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリジアリルメチルエチルアンモニウムエチルサルフェイト(PAS-24、分子量37,000、電荷密度3.32meq/g、ニットーボーメディカル製)
・メチルグリコールキトサン(MGch、分子量150,080、電荷密度2.67meq/g、和光純薬製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAH、分子量120,000～200,000、電荷密度10.7meq/g、Alfa Asesar製)
・ポリアリルアミン(PAAm、分子量15,000、電荷密度17.5meq/g、Polysciences,Inc.製)
・カチオン化ポリビニルアルコール(ゴーセネックス Ｋ－４３４、C-PVA、分子量 78,000～86,000 、電荷密度 8.23meq/g、日本合成化学工業製)
[界面活性剤]
　比較例１および６にて次の界面活性剤を使用した。
(非イオン性界面活性剤)
・ソルビタンモノラウレート:レオドールSP-L10、分子量346.46、花王(株)製
[ポリマー]
　比較例３～４にて次のポリマーを使用した。
(非イオン性ポリマー)
・ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、分子量100,000、Polysciences,Inc.製）
(アニオン性ポリマー)
・ポリアクリル酸ナトリウム（ＳＰＡ、分子量2,821,200～3,761,600、和光純薬製）
［実施例１］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
　菌株は独立行政法人　製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）より入手した糸状菌Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ　ＪＣＭ５５５７を使用した。糸状菌は、シャーレ内に調製したＰＤＡ培地（Ｄｉｆｃｏ　Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ａｇａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ製）上に菌体を画線／塗布し、３０℃にて静置培養し、定期的に継代を行った。菌体使用時にはシャーレから胞子を回収し、４０ｍＬの胞子回収液（ＮａＣｌ　０．８５％、Ｔｗｅｅｎ８０　０．０５％）に胞子を懸濁させた。その後、無菌の胞子回収液（ＮａＣｌ　０．８５％、Ｔｗｅｅｎ８０　０．０５％）で希釈することで１×１０7個－胞子／ｍＬに調整したものを胞子懸濁液とした。胞子の濃度は全自動セルカウンター（ＴＣ２０TM、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）にて測定した。
〔糸状菌の発芽及びペレット化〕
　熱滅菌済みのＰＤＢ培地（Ｄｉｆｃｏ　Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を２００ｍＬ仕込んだ５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに、熱滅菌済みのポリエチレンイミンを０．００１５％（ｗ／ｖ）になるように含ませた。ＰＤＢ培地に胞子懸濁液を２×１０3個－胞子／ｍＬとなるように植菌して、振とう機（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）にて２７℃、１７０ｒ／ｍｉｎの振盪条件で３日間培養を行い、糸状菌を発芽させ、糸状菌ペレットを得た。
＜糸状菌ペレット１個当たりの密度の測定＞
　培養終了後、菌体を含む培養液を重量測定用に１００ｍＬサンプリングし、ナイロンメンブレンフィルター（目開き１８０μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて糸状菌ペレットをろ過分離した。次いで、分離した糸状菌ペレットを、蒸留水２００ｍＬに浸漬し、振とう機（ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ、プリス社製）を用いて１７０ｒ／ｍｉｎ－２７℃の条件で１５分撹拌し、さらに前記ナイロンメンブレンフィルターでろ過分離した。この洗浄操作を３回行った。
　洗浄後の糸状菌ペレットを、再びナイロンメンブレンフィルターでろ過し、１０５℃の乾燥器にて１日間静置し乾燥菌体を得た。乾燥菌体の重量を測定し、菌体乾燥重量濃度［ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌ］を求めた。
　ペレット粒子数濃度［個／Ｌ］は、洗浄後、１ｍＬあたりに存在するペレットの個数を目視によりカウントし求めた。
　１個当りのペレット体積［ｃｍ3／個］は、洗浄後、糸状菌ペレットを画像解析（ＫＥＹＥＮＣＥ　ＶＨＸ－１０００）により観察し、ペレット１００個分の体積平均粒径を求め、１個当りのペレット体積［ｃｍ3／個］を算出した。
　糸状菌ペレット１個当たりの密度を以下の式（１）より算出した。
　糸状菌ペレット密度［ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3］
＝菌体乾燥重量濃度［ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌ］／ペレット粒子数濃度［個／Ｌ］／糸状菌ペレット１個当たりの体積［ｃｍ3／個］　　　　　（１）
［実施例２］～［実施例１２］
　表１に示すカチオンポリマーを使用した以外は実施例１と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。
［実施例１３］
　カチオンポリマーとしてポリアリルアミン塩酸塩（分子量１２０，０００～２００，０００、電荷密度１０．７、Ａｌｆａ　Ａｓｅｓａｒ製）を使用し、添加濃度を０．５％（ｗ／ｖ）にした以外は実施例１と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。
［実施例１４］～［実施例１５］
　ポリアリルアミン塩酸塩の添加濃度を０．１％（ｗ／ｖ）又は０．０１％（ｗ／ｖ）にした以外は実施例１３と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。
［実施例１６］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子回収および冷凍ストックの作製〕
　菌株は糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｓｅｉを使用した。糸状菌は、シャーレ内に調製したＰＤＡ培地（Ｄｉｆｃｏ　Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ａｇａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ製）上に菌体を画線／塗布し、３０℃にて７日間静置培養し、胞子を十分に形成させた。静置培養の後、シャーレから胞子を回収し、胞子回収液（ＮａＣｌ　０．９％、Ｔｗｅｅｎ８０　０．０３％）に胞子を懸濁させた。胞子の濃度は全自動セルカウンター（ＴＣ２０TM、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）にて測定した。胞子懸濁液を調製した後、懸濁液とグリセロール水溶液(４０ｖｏｌ％)を体積比３：１で混合し、その混合液を超低温フリーザ(三洋電機製（株）)にて－８０℃で保存し、冷凍ストックとした。
〔糸状菌の発芽及びペレット化〕
　ＰＤＢ培地５０ｍＬおよび０．００４５％（ｗ/ｖ）のカチオン化ポリビニルアルコールを５００ｍＬ容三角フラスコに入れた。三角フラスコを熱滅菌した後に、冷凍しておいた胞子懸濁液を解凍した後に、１×１０4個－胞子／ｍＬとなるように培地に植菌して、振とう機（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）にて２８℃、２２０ｒ／ｍｉｎの振盪条件にて２日間培養を行い、糸状菌ペレットを得た。
＜糸状菌ペレット１個当たりの密度の測定＞
　培養終了後、得られた菌体を含む培養液５０ｍＬについて上記実施例１と同様の手法により洗浄を行った後、糸状菌ペレット密度［ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3］を算出した。
［比較例１］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
　上記実施例１と同様の手法により、胞子懸濁液を調製した。
〔糸状菌のペレット化〕
　ＰＤＢ培地２００ｍＬおよび０．５％（ｗ／ｖ）のソルビタンモノラウレートを５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに入れた。三角フラスコを熱滅菌した後に、胞子懸濁液を２×１０3個－胞子／ｍＬとなるように培地に植菌して、振とう機（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）にて２７℃、１７０ｒ／ｍｉｎの振盪条件にて３日間培養を行い、糸状菌ペレットを得た。
＜糸状菌ペレット１個当たりの密度の測定＞
　培養終了後、上記実施例１と同様の手法により洗浄を行った後、糸状菌ペレット密度［ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3］を算出した。
[比較例２]
　添加剤を用いずに比較例１と同様の手法で培養を行った。
[比較例３]
　添加剤としてポリビニルアルコール（０．５％（ｗ/ｖ））を使用した以外は比較例２と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。
[比較例４]
　添加剤としてポリアクリル酸ナトリウム（０．５％（ｗ/ｖ））を使用した以外は比較３と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。
[比較例５]
　添加剤を用いずに実施例１６と同様の手法で培養を行った。
　実施例１～１６及び比較例１～５の結果を表１及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１及び表２より明らかなように、実施例１～１６で調製した糸状菌ペレットは、比較例１～５の糸状菌ペレットと比較して高い菌糸密度を有していた。
［実施例１７］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
　上記実施例１と同様の手法により、胞子懸濁液を調製した。
〔糸状菌のペレット化〕
　糸状菌ペレットの調製は以下の２段階の培養にて行った。１段目の培養が胞子の発芽とペレット化の工程であり、２段目の培養がペレットの増殖工程である。
　１段目の培養は、ペレット形成培地であるＰＤＢ培地を３０Ｌ容通気撹拌槽（（株）三ツワフロンテック製）に仕込み、熱滅菌を行った後に、滅菌済みのポリアリルアミン（分子量１５，０００、電荷密度１７．５、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．製）を０．００１５％（ｗ／ｖ）になるように含ませ、胞子懸濁液を１×１０4個－胞子／ｍＬとなるように植菌した。培地液量は滅菌水を加え１５Ｌに調整し、液温２７℃、撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、槽内圧力０．０４０ＭＰａ、空気を供給しＤＯを１．０ｐｐｍに制御した条件で３日間培養を行った。また、消泡センサーを用いて発泡時には消泡剤（１％　ＫＭ－７２Ｆ（信越化学製））が添加されるように制御を行った。
　２段目の培養は、まず槽内を加圧した状態で、培養液の上清を槽内に設置した２５０μｍ目開きの金属フィルターを介して、３０Ｌ容通気撹拌槽から抜液した。その後、滅菌済みの増殖培地を槽内に仕込んだ後に、滅菌済みの蒸留水を槽内液量が１５Ｌへとなるように添加し、培地濃度を下記となるよう各化合物を添加した。培地濃度は、グルコース（和光純薬工業社製）　６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物　０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛七水和物　０．００９％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム　０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素一カリウム　０．０６％（ｗ／ｖ）である。培養は２７℃，撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、槽内圧力０．０４０ＭＰａ、空気を供給しＤＯを２ｐｐｍに制御した条件で１２時間培養を行った。培養中のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウムを適宜添加して、４を維持した。また、１段目の培養と同様に発泡時には消泡剤（１％　ＫＭ－７２Ｆ）が添加されるように制御を行った。
〔ペレットの回収〕
　上記の操作で得られた糸状菌ペレット培養液を、ナイロンメッシュフィルターにてろ液のドリップが落ち着くまで数十秒ろ過し、ウエット状態の糸状菌ペレットを得た。２段目で得られたペレットは速やかに発酵性の評価に供した。一部は、上記実施例１と同様の手法により洗浄を行った後、糸状菌ペレット密度［ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3］を算出した。
＜フマル酸及びエタノール生産性の評価＞
〔培養方法〕
　滅菌済みの１Ｌ容通気撹拌槽に滅菌済みの培地と調製した糸状菌ペレット（ウエット状態）を添加した後に、滅菌済みの蒸留水を加え、液量を５００ｍＬに調整した。この際の培地組成は、グルコース（和光純薬工業社製）１０％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物　０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛七水和物　０．００９％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム　０．１％（ｗ／ｖ）、残りは水、であり、培地に対する糸状菌ペレットの占有体積が３６ｖｏｌ％になるようにした。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、３５℃、撹拌速度５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３～１．０ｖｖｍで高濃度酸素（＞９０％）を供給した条件にて培養を行った。その後経時的にサンプリングを行いながら、５時間培養を行った。ｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）４を維持した。
〔高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による各種成分の測定〕
　サンプリングした発酵液を孔径が０．２０μｍのセルロースアセテート製メンブレンフィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過した後、０．００８５Ｎ硫酸水溶液で適宜希釈し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。ＨＰＬＣの分析条件は、次の通りである。
・カラム　　：ＩＣＳｅｐ　ＩＣＥ－ＩＯＮ－３００
・溶離液　　：０．００８５規定硫酸、０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・検出法　　：ＲＩ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｌ－２４９０）
・カラム温度：４０℃
・注入液量　：２０μＬ
・保持時間　：４０ｍｉｎ
　この分析系における各成分の保持時間は、次の通りである。
・グルコース：１６ｍｉｎ
・フマル酸　：２６ｍｉｎ
・エタノール：３４ｍｉｎ
〔生産速度の算出〕
　発酵液の分析値から、（１）糖の消費速度（Ｐ［ｇ／Ｌ／ｈ］）、（２）フマル酸生産速度（Ｑ［ｇ／Ｌ／ｈ］）及び（３）エタノール生産速度（Ｒ［ｇ／Ｌ／ｈ］）の３項目を評価軸とした。ＨＰＬＣ分析結果より各成分の濃度［ｇ／Ｌ］を求めて、以下の式（１）～（３）により速度を算出した。
糖の消費速度
　　Ｐ［ｇ／Ｌ／ｈ］＝（Ｇ0－Ｇ）／　Ｔ　　　　　　　　　（１）
フマル酸生産速度
　　Ｑ［ｇ／Ｌ／ｈ］＝（Ｆ－Ｆ0）／　Ｔ　　　　　　　　　（２）
エタノール生産速度
　　Ｒ［ｇ／Ｌ／ｈ］＝（Ｅ－Ｅ0）／　Ｔ　　　　　　　　　（３）
（式中、Ｇ0、Ｆ0及びＥ0は、培養０時間のグルコース濃度、フマル酸濃度、エタノール濃度を示し、Ｇ、Ｆ及びＥは、培養後のグルコース濃度、フマル酸濃度、エタノール濃度を示し、Ｔは発酵時間（ｈ）を示す。）
［比較例６］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
　上記実施例１と同様の手法により、胞子懸濁液を調製した。
〔糸状菌のペレット化〕
　糸状菌ペレットの調製は以下の２段階の培養にて行った。
　１段目の培養は、ソルビタンモノラウレート０．５％（ｗ／ｖ）およびＰＤＢ培地および０．５％（ｗ／ｖ）のソルビタンモノラウレートを３０Ｌ容通気撹拌槽（（株）三ツワフロンテック製）に仕込み、熱滅菌を行った後に、胞子懸濁液を１×１０4個－胞子／ｍＬとなるように植菌した。培地液量は滅菌水を加え１５Ｌに調整し、液温２７℃、撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、槽内圧力０．０４０ＭＰａ、空気を供給しＤＯを１．０ｐｐｍに制御した条件で３日間培養を行った。また、消泡センサーを用いて発泡時には消泡剤（１％　ＫＭ－７２Ｆ（信越化学製））が添加されるように制御を行った。
　２段目の培養は、実施例１７と同様の手法で行った。
〔ペレットの回収〕
　培養終了後、上記実施例１７と同様の手法によりウエット状態の糸状菌ペレットを得、速やかに発酵性の評価に供した。一部は、糸状菌ペレット密度［ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3］を算出した。
＜フマル酸及びエタノール生産性の評価＞
　上記実施例１７と同様の手法で行った。
　実施例１７及び比較例６の評価結果を表３に示す。なお、結果は培養開始から培養終了５時間までの速度を採用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３より明らかなように、本発明の菌糸密度の高い糸状菌ペレットを利用することにより、フマル酸及びエタノールの生産速度が向上することが確認された。

Claims (12)

  1. 　糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させる工程を含む、糸状菌ペレットの製造方法。
  2. 　培養液中のカチオン性ポリマーの含有量が０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、２％（ｗ／ｖ）以下である請求項１記載の糸状菌ペレットの製造方法。
  3. 　カチオン性ポリマーの電荷密度が０．１ｍｅｑ／ｇ以上、１００ｍｅｑ／ｇ以下である請求項１又は２記載の糸状菌ペレットの製造方法。
  4. 　カチオン性ポリマーの重量平均分子量が１，０００以上、１，０００，０００以下である請求項１～３のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
  5. 　糸状菌の胞子を発芽させる工程の培養液とは異なる培養液中で糸状菌ペレットを増殖させる工程を更に含む、請求項１～４のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
  6. 　糸状菌がリゾプス属菌又はトリコデルマ属菌である請求項１～５のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
  7. 　カチオン性ポリマーがポリアリルアミン又はその塩、メチルグルコールキトサン、ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩、ポリエチレンイミン及びカチオン化ポリビニルアルコールから選ばれる１種以上である請求項１～６のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
  8. 　カチオン性ポリマーを含有する培養液の初発ｐＨが２以上、７以下である請求項１～７のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
  9. 　炭素源を含有する培養液にて請求項１～８のいずれか１項記載の製造方法によって得られる糸状菌のペレットを用い、有機酸及びエタノールから選ばれる少なくとも１種を製造する方法。
  10. 　有機酸がフマル酸、乳酸、イタコン酸、リンゴ酸及びピルビン酸から選ばれる１種以上である請求項９記載の製造方法。
  11. 　密度が０．０４ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上、０．５ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下である糸状菌ペレット。
  12. 　体積平均粒径が１５０μｍ以上、３０００μｍ以下である請求項１１記載の糸状菌ペレット。
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