CN102220244B - 一种哈茨木霉菌株及其用该菌株制备右旋糖酐酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一株高酶活的右旋糖酐酶产生菌及用该菌株制备右旋糖酐酶的方法。其特征在于该菌株是从土壤中分离得到的哈茨木霉F1002(Hypocrea lixii)，该菌株由中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4725。本发明成功的利用哈茨木霉F1002发酵制备右旋糖酐酶，并且能够产生高酶活性的右旋糖酐酶，同时产生的右旋糖酐酶为胞外酶。利用哈茨木霉F1002发酵法制备的右旋糖酐酶的特征在于它的最适作用温度为25℃到30℃，最适pH为5.0到5.5，稳定pH为4.0到6.5。哈茨木霉F1002发酵产右旋糖酐酶的水平为大于60U/ml。
Description
技术领域：
本发明涉及微生物技术和发酵工程领域，具体地说是一种产右旋糖酐酶的哈茨木霉菌株的分离，以及利用该菌株发酵制备高酶活性的右旋糖酐酶的工艺。
背景技术：
在医药工业中，分子量70kDa、40kDa、20kDa的右旋糖酐是目前公认的优良血浆代用品，有增加血容量、改善微循环的作用，临床主要用于治疗失血性休克等。目前我国90％以上的右旋糖酐制造企业多采用盐酸水解高分子右旋糖酐的工艺，先利用右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，再利用盐酸进行水解得到中分子、小分子药用级右旋糖酐。由于此工艺利用盐酸进行水解生产药用级右旋糖酐，所制备的右旋糖酐含有大量的氯化物及氮化物而严重影响了产品的质量，产品在临床使用过程中常出现过敏反应，可引起皮肤反应、严重的呼吸和循环衰竭，甚至导致死亡。同时由于利用盐酸水解需要高温高酸等恶劣条件，不利于环保、低碳。如果采用本发明的哈茨木霉产生的右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐，通过控制反应条件调控催化水解的右旋糖酐分子量，就能减少氯化物对产品质量的影响，同时由于本发明制备的右旋糖酐酶在水解高分子右旋糖酐时，能够优先降解大分子量的右旋糖酐，然后再进一步降解中小分子量的右旋糖酐，如此便能够得到分子量分布较集中的右旋糖酐，得到高品质的右旋糖酐，目前国内外的右旋糖酐酶主要是从薄青霉(Penicillium lilacinum)和细丽毛壳属(Chaetomium sp.)等菌株培养得到，上述菌株产生的右旋糖酐酶在水解高分子右旋糖酐时不具备优先降解大分子糖酐的能力，得到的产品分子量分布不集中，同时上述两种菌株制备的右旋糖酐酶酶活力较低，且制备成本高，目前尚未有大量利用右旋糖酐酶水解高分子糖制备药用级右旋糖酐的报道。而本发明的哈茨木霉制备的右旋糖酐酶活力高，且成本也较低。利用本发明制备的右旋糖酐酶生产右旋糖酐反应条件温和、能耗低、酶的使用量小、成本低，从而实现了中、小分子量多糖生产工艺的绿色、环保、低碳的目标，同时提升产品品质、提升竞争力。
在制糖工业中，葡聚糖的存在会增加制糖过程困难，主要体现在糖液粘度增加、过滤困难、能耗增加等，同时还会直接造成糖分的损失。因此这些问题是我国糖业界一个迫切需要的解决的问题。利用本发明制备的右旋糖酐酶能够催化水解葡聚糖中的α-1，6糖苷键，并释放出异麦芽糖和低聚异麦芽糖，最终的水解产物为异麦芽糖，由于本发明制备的右旋糖酐酶酶活力高，能够高效的催化水解葡聚糖，成本较低，从而能快速的葡聚糖转化为小分子的寡糖，降低粘度，提高糖的品质，增加了蔗糖的回收率等。目前国内外的右旋糖酐酶主要是从薄青霉(Penicillium lilacinum)和细丽毛壳属(Chaetomium sp.)等菌株培养得到，由于制备得到的右旋糖酐酶酶活力较低、制备成本高，因此尚未有大量应用于制糖工业的报道。因此利用本发明的高酶活性的右旋糖酐酶对制糖行业的清洁生产、技术进步具有显著的积极意义。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术存在的不足之处，提供一种从土壤中筛选出的高产右旋糖酐酶的哈茨木霉菌株以用于制备高酶活性的右旋糖酐酶。
本发明解决技术问题采用如下方案：
本发明提供一种从土壤中筛选出的高产右旋糖酐酶的哈茨木霉(Hypocrea lixii)菌株，该菌株保藏名称为：哈茨木霉(Hypocrea lixii)F1002，分类命名及拉丁文名为Trichodermaharzianum，保藏单位：中国微生物菌种保藏中心，保藏日期：2011年03月31日，保藏号为CGMCC No.4725。
本发明的微生物F1002菌株具有下述性质：
形态特征：
菌株F1002在菌株在PDA培养基(配方：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂1.6g)上28℃恒温培养2d后肉眼可看到清晰的菌丝体，菌丝较粗而长。培养5d菌落较大，生长没有局限性，菌落可以扩展到整个培养皿。分生孢子面为青色，反面略带黄色，菌落呈现或紧或松的蛛网状。在显微镜下观察分生孢子梗从菌丝体侧枝生长出来，垂直分枝生长，其直径为2.5μm-3.5μm。分生孢子为圆形，其直径为3.0μm-4.5μm。菌株在发酵培养基(配方：Dextran 70kDa 1.5g，蛋白胨1.0g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，琼脂1.6g，水100ml，pH5.0～5.5)上28℃恒温培养5d后，菌落分生孢子面为青绿色，反面略带黄色。菌落呈现绒毛状和棉絮，菌落与培养基的连接紧密。
ITS rDNA基因序列：
利用ITS rDNA特异引物对菌株进行PCR扩增得到560bp的目的DNA片段，利用Blast软件将测序结果与GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中的相关序列进行同源性比较，结果显示菌株F1002的560bp的目的DNA序列与哈茨木霉的基因序列相似性最高，同源性高达99％。同时将得到的菌株F1002的560bp的目的DNA片段的序列提交到GenBank上，获得GenBank登陆号为HQ647326。
本发明还提供了哈茨木霉(Hypocrea lixii)菌株F1002在制备高酶活性的右旋糖酐酶中的应用。
本发明的微生物F1002菌株的分离方法是：
在99ml无菌水中加入1g土样(土样分别取自安徽合肥、安徽蚌埠、四川成都)制备土壤稀释液，在PDA培养基内加入青霉素溶液(100ml加入50μl)，倒入培养皿中，静止冷却成平板。采用稀释涂布法将稀释后的土壤溶液分别涂布于平板上，然后倒置于28℃恒温培养箱中培养，待菌长出后，用接种针将菌株挑取到另一灭菌的筛选培养基(配方：DextranT2000 1g，NaNO3 0.3g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O0.001g，琼脂1.6g，水100ml，pH5.0～5.5)上进行划线分离，然后将能够在筛选培养基上生长的单菌落挑取下来，转接到发酵培养基(配方：Dextran 70kDa 1.5g，蛋白胨1.0g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，水100ml，pH5.0～5.5)上，于28℃、220r/min恒温继续发酵培养6天。将发酵液用于平半透明圈法。
经过平板透明圈法，将菌株发酵后的上清液经过纤维素酯微孔滤膜(规格
孔径0.22μm)无菌过滤处理。在右旋糖酐琼脂平板上打孔，将筛选菌株的培养液150μL加入孔中，同时在每一块检测平板中，以无菌水(150μL)作为阴性对照，以商业右旋糖酐酶液(150μL)做阳性对照。在28℃条件下放置24h后，观察孔周围产生的透明圈大小，透明圈越大表明培养液所含的右旋糖酐酶酶活力越高。选择能产生较大透明圈的菌株进行DNS比色法复筛。
将初筛得到的活性菌株的发酵培养液用DNS比色法检测酶活力大小。在酶反应体系中加入待测液，测定酶活，右旋糖酐酶的活力测定为将4mL 0.02mol/L pH 5.0的醋酸盐缓冲液配制的5％右旋糖酐70kDa溶液置于25℃保温10min，再加入适当稀释的酶液1mL保温30min后，利用3，5二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖。以在上述条件下每小时产生1mg还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。最后筛选出能产生较高右旋糖酐酶酶活性的菌株。
通过初筛及复筛分离纯化得到单菌落纯培养哈茨木霉F1002。
本发明的微生物F1002菌株的培养方法是：
先采用固体PDA培养基，所述固体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂1.6g；将上述菌株在试管斜面培养基上接种后，于28℃-30℃下活化培养，两天后，再采用液体PDA培养基培养，液体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g；将试管斜面活化的菌株接种在锥形瓶PDA液体培养基中30℃、220r/min恒温培养5天。
利用本发明的微生物液体发酵制备右旋糖酐酶的方法按以下步骤进行：
1)菌株活化：采用灭菌固体PDA培养基，将F1002菌株接种在试管培养基上，28-30℃下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备；
2)菌株种子发酵培养：种子培养基组分为每100ml水中含有Dextran 70kDa 1g，蛋白胨0.5g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH5.0～5.5，将步骤1)中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上28-30℃，转速220r/min下培养48-72小时作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶；
3)发酵制备右旋糖酐酶：发酵培养基组分为每100ml水中含有Dextran 70kDa 1.5g，蛋白胨1.0g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH5.0～5.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2)中的种子液按5％的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上28-30℃，转速220r/min下培养6天得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，然后将发酵液用于分离纯化；
4)右旋糖酐酶的分离纯化：将步骤3)中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后选择适当的超滤膜截留，先用8万分子量截留，除去8万分子量以上的杂质，再利用5万分子量截留，得到较纯的右旋糖酐酶，浓缩发酵液，再进行低压冷冻干燥，得到右旋糖酐酶酶粉。
本发明哈茨木霉F1002能够产生高酶活性的右旋糖酐酶，并且产生的右旋糖酐酶为胞外酶。利用哈茨木霉F1002发酵法制备的右旋糖酐酶的特征在于它的最适作用温度为25℃到30℃，最适pH为5.0到5.5，稳定pH为4.0到6.5。哈茨木霉F1002发酵产右旋糖酐酶的水平为大于60U/ml。利用F1002菌发酵制备得到高酶活性的右旋糖酐酶。将高酶活性的右旋糖酐酶用于工业制备右旋糖酐，一方面能够提高中、小分子右旋糖酐的质量。另一方面由于用酶法制备右旋糖酐，反应条件温和、能耗低，从而可实现了中、小分子量右旋糖酐生产工艺的绿色、环保、低碳的目标。
本发明能够用于酶法制备药用级右旋糖酐，实现节能降耗、提升产品质量，提升右旋糖酐在市场上的竞争力。同时该酶还可以用于消除葡聚糖在制糖行业的问题，对制糖行业的清洁生产和促进产业发展具有显著的积极意义。
保藏信息
菌株名称：哈茨木霉(Hypocrea lixii)F1002
保藏日期：2011年03月31日
保藏单位：中国微生物菌种保藏中心
保藏编号：CGMCC No.4725。
具体实施方式：
下面将结合实施例对本发明作进一步详细的说明：
酶活定义为：一个酶活力单位(U)表示为在pH5.0，温度25℃下，每小时分解右旋糖酐70kDa所产生1mg还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量。
实施例1
一株产右旋糖酐酶高酶活性菌株F1002的分离方法，其包括如下步骤：
在99ml无菌水中加入1g土样(土样分别取自安徽合肥、安徽蚌埠、四川成都)制备土壤稀释液，在PDA培养基内加入青霉素溶液(100ml加入50μl)，倒入培养皿中，静止冷却成平板。采用稀释涂布法将稀释后的土壤溶液分别涂布于平板上，然后倒置于28℃恒温培养箱中培养，待菌长出后，用接种针将菌株挑取到另一灭菌的筛选培养基(配方：DextranT2000 1g，NaNO3 0.3g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O0.001g，琼脂1.6g，水100ml，pH5.0～5.5)上进行划线分离，然后将能够在筛选培养基上生长的单菌落挑取下来，转接到发酵培养基(配方：Dextran 70kDa 1.5g，蛋白胨1.0g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，水100ml，pH5.0～5.5)上，于28℃、220r/min恒温继续发酵培养6天。将发酵液用于平半透明圈法。
经过平板透明圈法，将菌株发酵后的上清液经过纤维素酯微孔滤膜(规格
孔径0.22μm)无菌过滤处理。在右旋糖酐琼脂平板上打孔，将筛选菌株的培养液150μL加入孔中，同时在每一块检测平板中，以无菌水(150μL)作为阴性对照，以商业右旋糖酐酶液(150μL)做阳性对照。在28℃条件下放置24h后，观察孔周围产生的透明圈大小，透明圈越大表明培养液所含的右旋糖酐酶酶活力越高。同时选择能产生较大透明圈的菌株进行DNS比色法复筛。
将初筛得到的活性菌株的发酵培养液用DNS比色法检测酶活力大小。在酶反应体系中加入待测液，测定酶活，右旋糖酐酶的活力测定为将4mL 0.02mol/L pH 5.0的醋酸盐缓冲液配制的5％右旋糖酐70kDa溶液置于25℃保温10min，再加入适当稀释的酶液1mL保温30min后，利用3，5二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖。以在上述条件下每小时产生1mg还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。最后筛选出能产生较高右旋糖酐酶酶活性的菌株。
通过初筛及复筛分离纯化得到单菌落纯培养哈茨木霉F1002。
实施例2
上述菌株F1002的培养方法，其包括以下步骤：
先采用固体PDA培养基，所述固体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂1.6g；将上述菌株在试管斜面培养基上接种后，于28℃-30℃下活化培养，两天后，再采用液体PDA培养基培养，液体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g；将试管斜面活化的菌株接种在锥形瓶PDA液体培养基中30℃、220r/min恒温培养5天。
实施例3
一种利用本发明的微生物液体发酵制备右旋糖酐酶的工艺，其包括以下步骤进行：
1)菌株活化：采用灭菌固体PDA培养基，将F1002菌株接种在试管培养基上，28-30℃下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备；
2)菌株种子发酵培养：种子培养基组分为每100ml水中含有Dextran 70kDa 1g，蛋白胨0.5g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH5.0～5.5，将步骤1)中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上28-30℃，转速220r/min下培养48-72小时作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶；
3)发酵制备右旋糖酐酶：发酵培养基组分为每100ml水中含有Dextran 70kDa 1.5g，蛋白胨1.0g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH5.0～5.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2)中的种子液按5％的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上28-30℃，转速220r/min下培养6天得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，测得发酵液中右旋糖酐酶酶活力为65U/ml，然后将发酵液用于分离纯化；
4)右旋糖酐酶的分离纯化：将步骤3)中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后选择适当的超滤膜截留(先用8万分子量截留，除去8万分子量以上的杂质，再利用5万分子量截留，得到较纯的右旋糖酐酶)、浓缩发酵液，再进行低压冷冻干燥，得到右旋糖酐酶酶粉(测得右旋糖酐酶酶活为60000U/mg)。
Claims (4)
1.一种生产右旋糖酐酶的哈茨木霉（Bacillus amyloiquefaciens）F1002菌株，其保藏号为CGMCC No.4725。
2.权利要求1所述的哈茨木霉F1002菌株在制备高酶活性的右旋糖酐酶中的应用。
3.权利要求1所述的哈茨木霉F1002菌株的培养方法，其特征在于先采用固体PDA培养基，将哈茨木霉菌株在试管斜面培养基上接种后，28℃到30℃下活化培养，两天后再接种到液体PDA培养基中30℃、220r/min恒温培养5天；所述固体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂1.6g；所述液体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g。
4.利用权利要求1所述的哈茨木霉F1002菌株制备右旋糖酐酶的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
1）菌株活化：采用灭菌固体PDA培养基，将F1002菌株接种在试管培养基上，28-30℃下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备；所述固体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂1.6g；
2）菌株种子发酵培养：种子培养基组分为每100ml水中含有Dextran70kDa 1g，蛋白胨0.5g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH5.0~5.5，将步骤1）中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上28-30℃，转速220r/min下培养48-72小时作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶；
3）发酵制备右旋糖酐酶：发酵培养基组分为每100ml水中含有Dextran 70kDa 1.5g，蛋白胨 1.0g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH5.0~5.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2）中的种子液按5%的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上28-30℃，转速220r/min下培养6天得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，然后将发酵液用于分离纯化；
4）右旋糖酐酶的分离纯化：将步骤3）中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后使用超滤膜先截留8万分子量以上杂质，再截留5万分子量以上杂质，得到较纯的右旋糖酐酶，浓缩发酵液，再进行低压冷冻干燥，得到右旋糖酐酶酶粉。
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