CN103045569B - 添加高聚木糖提高纤维素酶生产效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了添加高聚木糖提高纤维素酶生产效率的方法，通过在真菌纤维素酶发酵生产过程中添加高聚木糖的手段来快速缩短发酵纤维素内切酶的时间，提高纤维素酶的整体酶活。本发明方法简单易行，提高纤维素酶整体酶活效果明显，大幅度缩短产纤维素内切酶的发酵时间，适用范围广，可用于工业化发酵生产纤维素酶。

Description

添加高聚木糖提高纤维素酶生产效率的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及在真菌纤维素酶发酵生产的过程中添加高聚木糖来提高纤维素酶酶活生产效率的方法。
技术背景
纤维素是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的高聚多糖分子。纤维素酶具备水解木质纤维素成糖的能力，这使得其具有广泛的应用前景，广泛地应用于造纸、食品、纺织、饲料、生物能源等领域。纤维素酶为复合酶，由三类酶组成：内切葡聚糖酶(EG，内切酶)、外切葡聚糖酶(CBH，外切酶)和β葡萄糖苷酶(BG，β酶)。EG作用于不溶性纤维素的表面，破坏其晶体结构，将内部的纤维素链暴露出来使其易于水解；CBH将暴露出来的纤维素链水解为2～4个单位的寡糖；BG最终将其降解为葡萄糖单糖。纤维素酶水解纤维素能力是通过多种酶的协同作用发挥的，因此纤维素酶整体酶的效果不仅取决于各个酶的自身酶活，同时取决于协同作用中酶的种类及酶之间的比例。在造纸行业，使用纤维素内切酶对浆料进行处理后制成的纸张的耐破指数、撕裂指数和抗张强度基本保持不变的情况下，滤水性能得到大幅度改善，有利于造纸成型部的脱水，提高了车速，同时处理后浆料的结晶度得到提高。在纤维素酶的生产中，目前主要局限于利用传统的方法来提高纤维素酶酶活，包括利用基因改造和诱变手段得到高产菌株，优化培养基配方等方法，在提高产率方面得到了一定的成果。但是还是有必要开发出新的方法来进一步提高纤维素酶的活力。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种添加高聚木糖提高纤维素酶生产效率的方法，方法简单，操作容易，提高纤维素酶整体酶活，缩短纤维素内切酶生产时间。
本发明的技术解决方案是该提高纤维素生产效率的方法包括以下步骤：
（1）  培养基：纤维素物质为碳源，包括稻草秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆；纤维素物质30~60g/L，微晶纤维素3~8g/L，其余营养物质蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 2~5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，MnSO4·7H2O 1.6mg/L配制培养基，于121℃灭菌20min，冷却待接种；
（2）  种子液：按培养基质量的5~10%接种，30℃摇床培养1-3天，转速160rpm，得种子液；
（3）  发酵：按培养基质量的5~10%接种种子液，发酵罐发酵，发酵温度30℃，溶氧量不低于20%，通气量0.1~0.3vvm，发酵前期转速为250rpm，中期为350rpm，后期为200rpm；发酵前期加入高聚木糖，高聚木糖的添加量为2~10g/L。
其中，产纤维素酶真菌包括里氏木霉、斜卧青霉、黑曲霉。
其中，添加高聚木糖不仅是指高聚木糖纯物质，还包括含有高聚木糖成分的物质。
本发明的特征效果是：利用高聚木糖会抑制纤维素酶酶制剂的活力现象，在纤维素酶发酵中添加高聚木糖来刺激生物菌体更快更多的分泌纤维素内切酶和纤维素酶，导致更高的纤维素酶酶活和更快的纤维素内切酶，高聚木糖的添加量少，纤维素酶整体酶活显著提高，大幅缩短了纤维素内切酶的生产时间，实际操作简便可行，经济效益显著；通过添加高聚木糖可以使里氏木霉产纤维素内切酶的时间缩短至传统方法的发酵时间的15%左右，在保持传统发酵时间的情况下纤维素酶整体酶活提高了约20%。
附图说明
图1为里氏木霉发酵产酶曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步详细地描述本发明。本领域技术人员应当理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
以下为纤维素酶整体酶活FPA的定义：在50℃、pH 4.8、每分钟水解滤纸产生1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位（u）；纤维素内切酶CMCA的定义：在50℃、pH 4.8、每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMCNa）产生1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位（u）。
实施例1：选用斜卧青霉为生产菌株，配制培养基：微晶纤维素3g/L，玉米秸秆60g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，MnSO4·7H2O 1.6mg/L，培养基于50L发酵罐装液30L，121℃灭菌20min，冷却待接种；按105CFU/mL的孢子终浓度接至液体培养基中，30℃摇床培养3天，转速160rpm，得种子液；以5%的接种量接种培养好的斜卧青霉的种子液3L，通气量0.1vvm，30℃发酵培养；在发酵培养第3天时加入终浓度为10g/L的高聚木糖，发酵7天产酶结束；测定FPA酶活为4.2u/ml，其活力与传统方法斜卧青霉产纤维素酶相比较，FPA提高了约20%。
实施例2：选用黑曲霉为生产菌株，配制培养基：微晶纤维素3g/L，玉米秸秆40g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，MnSO4·7H2O 1.6mg/L，培养基于50L发酵罐装液量30L，121℃灭菌20min，冷却待接种；按105CFU/mL的孢子终浓度接至液体培养基中，30℃摇床培养1天，转速160rpm，得种子液；以5%的接种量接种培养好的斜卧青霉的种子液3L，通气量0.3vvm，30℃发酵培养；在发酵培养第3天时加入终浓度为5g/L的高聚木糖，发酵7天产酶结束；测定FPA酶活为2.8u/ml，其活力与传统方法黑曲霉产纤维素酶相比较，FPA提高了约20%。
实施例3：选用里氏木霉为生产菌株，配制培养基：微晶纤维素8g/L，稻草秸秆30g/L,蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，MnSO4·7H2O 1.6mg/L，培养基于250mL的摇瓶装液量50mL，121℃灭菌20min，冷却待接种；按105CFU/mL的孢子终浓度接至液体培养基中，30℃摇床培养2天，以5%的接种量接种培养好的里氏木霉的种子液2.5mL，30℃发酵培养；分别在第0天和第3天时加入终浓度为2g/L的高聚木糖，发酵8天结束；发酵全程测定CMCA和FPA酶活，最终FPA最高酶活为3.8u/ml，与传统方法里氏木霉产纤维素酶相比较，FPA提高了约20%；CMCA在24小时就已经达到高峰，与传统方法里氏木霉产纤维素内切酶相比较，发酵时间缩短至15%左右；具体产酶曲线如图1所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.添加高聚木糖提高纤维素酶生产效率的方法，该提高纤维素酶生产效率的方法包括以下步骤：
（1）培养基：纤维素物质为碳源，包括稻草秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆；纤维素物质30~60g/L，微晶纤维素3~8g/L，其余营养物质蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 2~5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，MnSO4·7H2O 1.6mg/L配制培养基，于121℃灭菌20min，冷却待接种；
（2）种子液：按培养基质量的5~10%接种，30℃摇床培养1-3天，转速160rpm，得种子液；
（3）发酵：按培养基质量的5~10%接种种子液，发酵罐发酵，发酵温度30℃，溶氧量不低于20%，通气量0.1~0.3vvm，发酵前期转速为250rpm，中期为350rpm，后期为200rpm；发酵前期加入高聚木糖，高聚木糖的添加量为2~10g/L；其特征是：其中，产纤维素酶真菌包括里氏木霉、斜卧青霉、黑曲霉；其中，添加高聚木糖不仅是指高聚木糖纯物质，还包括含有高聚木糖成分的物质。
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