CN101693910A - 一种微生物酶法生产纤维低聚糖新工艺 - Google Patents
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Abstract
一种微生物酶法生产纤维低聚糖工艺，以经过预处理的纤维素为原料、真菌纤维素酶为初始酶制剂，采用纤维素“底物原位吸附-固液分离拆分-定向水解”法酶解制备纤维低聚糖，由于拆分去除了纤维素酶系中大量的β-葡萄糖苷酶，水解体系中的β-葡萄糖苷酶含量大大降低，提高了纤维低聚糖的得率，降低了产品中无生理活性的单糖葡萄糖含量。与未拆分处理的普通纤维素酶解工艺相比，水解产物中纤维低聚糖占总糖的百分数可以提高1倍左右，为微生物酶法纤维低聚糖制备工艺提供了一个低成本的新途径。
Description
一、技术领域
本发明属生物化学中的微生物酶解制糖技术领域，具体涉及纤维素废弃物原料经微生物分泌的酶生物降解后，制备功能性食品或饲料添加剂--纤维低聚糖的技术。
二、背景技术
低聚糖，是由2～10个单糖通过糖苷键连接而成的低聚合度糖类。低聚糖分普通低聚糖和功能性低聚糖两类，功能性低聚糖是指具有特殊的生物学功能，尤其能够显著促进人或动物肠道内双歧杆菌增殖，有益于人或动物健康的一类低聚糖，即所谓的双歧因子。除了能够促进肠道内双歧杆菌等有益菌特异性增殖外，功能性低聚糖另一个重要的生物学功能是刺激人或动物体内的免疫系统，从而提高人或动物体的免疫力。功能性低聚糖主要作为添加剂应用于食品或饲料领域，近年来，随着人们对自身健康和动物食品安全的关注，功能性低聚糖类食品或饲料添加剂的开发和应用越来越受到重视。功能性低聚糖的种类很多，目前进入商业化的品种主要包括低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚壳聚糖、大豆低聚糖、帕拉金糖、低聚木糖等。
纤维低聚糖是由2～10个葡萄糖通过β-1，4-糖苷键结合而成的低聚合度糖类，是功能性低聚糖的一种。纤维低聚糖主要通过水解纤维质原料中的纤维素制备得到。纤维质原料的水解主要有两种方法：(1)化学降解法，包括浓酸法和稀酸法；(2)酶降解法。浓酸催化水解几乎不产生副产物，但是酸消耗大，产物提取费用高，环境污染大。稀酸水解反应速度不易控制，而且能引起糖的分解和缩合反应，导致纯度和得率下降。同时酸水解对设备和技术的要求都比较高。而酶水解法可克服上述缺点。酶降解法具有转化率高、专一性强、不会对环境造成污染，并且还具有条件温和、操作简单等特点，工业应用前景广阔。
纤维素酶是一种降解纤维素成葡萄糖的复合酶系，该复合酶系主要包括内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素是在这三种酶组分的协同作用下彻底水解成葡萄糖的。纤维素酶水解纤维素成葡萄糖普遍公认的机理为：内切葡聚糖酶首先作用于长链纤维素的无定形区，随机切断纤维素分子链中的β-1，4-糖苷键，生成不溶的短链纤维素和可溶的纤维低聚糖；随后外切葡聚糖酶主要作用于内切葡聚糖作用于纤维素生成的产物短链纤维素和可溶性纤维低聚糖的非还原末端，释放纤维二糖，部分微生物来源的外切葡聚糖酶也能对纤维素的还原末端有一定的进攻生成纤维二糖；最后可溶的纤维低聚糖尤其是纤维二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下被彻底水解成葡萄糖。从纤维素水解机理可看出，纤维低聚糖是纤维素水解成葡萄糖过程的中间产物，因此控制水解过程中中间产物纤维低聚糖的累积，是获得高得率纤维低聚糖的关键。从纤维素水解协同机理不难看出，如果纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶的量越低，则纤维素水解过程中中间产物纤维低聚糖进一步水解成葡萄糖的量则越少，纤维素水解成纤维低聚糖的得率就越高，产品中无生理活性的单糖葡萄糖的比例就越少。
大多数有工业应用潜力的、能合成纤维素酶的微生物，其分泌的纤维素酶系中都含有一定数量的β-葡萄糖苷酶。而纤维低聚糖的制备，对纤维素酶的要求是其β-葡萄糖苷酶含量(或活力)越低越好，即要求是低β-葡萄糖苷酶活力的纤维素酶。为了在微生物酶法制备纤维低聚糖的工艺中，尽可能地降低β-葡萄糖苷酶的活力，国内外主要采取以下途径开展研究并取得了一定的进展：
(1)采用物理、化学诱变或基因工程的方法改造微生物，以期获得新的突变株或工程菌，它们可以分泌低β-葡萄糖苷酶含量的纤维素酶系；
(2)通过调控发酵的手段改变微生物的培养条件，以降低微生物对β-葡萄糖苷酶的分泌；
(3)采用亲和层析的方法将纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶分离除去，该法成本高，只适合于实验室研究，工业应用前景不大。
三、发明内容
本技术的发明目的是：针对一般的真菌木霉(Trichoderma)和曲霉(Aspergillus)分泌的纤维素酶在制备纤维低聚糖时的不足，寻找一种微生物酶法生产纤维低聚糖的新工艺。
研究发现，不同聚合度的葡聚糖分子对纤维素酶系中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的亲和作用不同。长链纤维素和不溶性短链纤维素对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的亲和力强，而对β-葡萄糖苷酶的亲和力弱。在纤维质原料和纤维素酶的混合体系中，如果控制适当的吸附条件，则可控制纤维素酶组分中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶在底物纤维素上的吸附行为。内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶主要吸附在底物纤维素上，β-葡萄糖苷酶由于与纤维素的亲和力弱，主要溶解在液相中。
如果能够选择在适当的时候进行固液分离，将溶解在液相中的β-葡萄糖苷酶除去，即可实现纤维素酶系中大量β-葡萄糖苷酶的拆分。将固液分离后获得的固体渣继续水解，即可实现高效、优质生产功能性纤维低聚糖的目标。
本发明的技术解决方案为：一种微生物酶法生产纤维低聚糖新工艺，以经过预处理的纤维素为原料、真菌纤维素酶为初始酶制剂，其特征如下：
a.底物原位吸附--将纤维素原料与真菌纤维素酶混合，加入水，pH缓冲液或酸、碱，混合至固液重量比为1∶7～50，pH值为6～8，每克纤维素的纤维素酶用量为5～25FPIU/g，于5～25℃条件下摇或机械搅拌10～60min；
b.固液分离拆分，弃去上清液；
c.定向水解--在上述固液分离得到的渣中补加水，pH缓冲液或酸、碱，控制固液重量比为1∶7～50，pH值为4～6，在45～55℃的条件下摇或机械搅拌12～36h；
将定向水解物再次进行固液分离，所获得的上清液即为葡萄糖含量低的纤维低聚糖溶液。
上述方法中，纤维素原料可以是木聚糖生产废渣、低聚木糖生产废渣、木糖渣、糠醛渣，或经过适当预处理的其他纤维质原料。预处理的目的是提高纤维质原料中纤维素对纤维素酶的可及度，可以采用物理、化学、生物或以上几种方法联合应用的预处理方法。
真菌纤维素酶是里氏木霉(Trichoderma reesei)或黑曲霉(Aspergillusniger)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)分泌的纤维素酶。
所使用的pH缓冲液或酸、碱，可以是磷酸/磷酸钠缓冲液、醋酸/醋酸钠缓冲液、柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液或硫酸，氢氧化钠、氢氧化钾，。
固液分离可以采用离心法或板框过滤法等。
本发明的有益效果：采用底物原位吸附-固液分离拆分纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶以后，由于水解体系中的β-葡萄糖苷酶大大降低，降解纤维素成纤维低聚糖的选择性大大增加，从而提高了纤维素降解成纤维低聚糖的得率和降解产物中纤维低聚糖的含量，降低了产物中无生理活性的单糖葡萄糖的含量。采用纤维素“底物原位吸附-固液分离拆分-定向水解”法酶解制备纤维低聚糖，与未拆分处理的普通纤维素酶解工艺相比，水解产物中纤维低聚糖占总糖的百分数可以提高1倍左右。为微生物酶法纤维低聚糖制备工艺提供了一个低成本的新途径。
四、附图说明
图1为温度对底物吸附内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的影响曲线，其实验条件为：底物浓度固液比1∶20，酶用量15FPIU/g纤维素，pH值4.8，吸附时间2h；
图2为pH值对底物吸附内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的影响曲线，其实验条件为：底物浓度固液比1∶20，酶用量15FPIU/g纤维素，温度10℃，吸附时间2h；
图3为吸附时间对底物吸附内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的影响曲线，其实验条件为：底物浓度固液比1∶20，酶用量15FPIU/g纤维素，温度10℃，pH值7.0。
五、具体实施方式
实施例提及的产纤维素酶微生物及由产纤维素酶微生物发酵制备纤维素酶的方法均为本领域技术人员公知的技术。
实施例1：用里氏木霉制备获取纤维素酶
1.里氏木霉(T.reesei)菌丝体培养基成分(g/L)：葡萄糖10.0；蛋白胨1.0；硫酸铵1.4；尿素0.3；磷酸二氢钾2.0；无水氯化钙0.3；七水硫酸镁0.3；七水硫酸亚铁0.005；七水硫酸锰0.0016；七水硫酸锌0.0014；氯化钴0.002。培养基用0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲液调节pH值4.8。
2.里氏木霉纤维素酶合成培养基成分(g/L)：葡萄糖1.0；纸浆10.0；蛋白胨1.0；硫酸铵1.4；尿素0.3；磷酸二氢钾2.0；无水氯化钙0.3；七水硫酸镁0.3；七水硫酸亚铁0.005；七水硫酸锰0.0016；七水硫酸锌0.0014；氯化钴0.002。培养基用0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲液调节pH值4.8。
3.里氏木霉菌丝体的培养：50ml菌丝体培养基置于250ml三角瓶中，于121℃下灭菌30min，冷却至室温，接入适量保藏于试管斜面的里氏木霉孢子，摇瓶置于恒温摇床中于30±1℃、170转/分条件下培养36h后备用。
4.里氏木霉纤维素酶的制备：培养基于121℃下灭菌30min，冷却至室温，接入上述培养36h的里氏木霉菌丝体，置于恒温摇床中于170转/分条件下培养，培养温度第一天控制在30±1℃，以后控制在28±1℃。
5.培养4天，用离心机在3000转/分条件下离心10min将培养液中的固体物质(菌体和未被利用的纸浆纤维)分离除去，即得纤维素酶液。
滤纸酶活力的测定：采用国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法测定。实验条件：底物Whatman滤纸50mg，加入适当稀释倍数的酶液和缓冲液，使反应体系pH值为4.8，于50℃、振荡频率80次/分的往复式恒温振荡器中反应60min，测定反应生成的葡萄糖量。一个滤纸酶活力的单位(FPIU)定义为标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖的酶量。
内切葡聚糖酶活力的测定：内切葡聚糖酶活力通常用羧甲基纤维素酶活力表示。实验条件：底物1％(w/v)的羧甲基纤维素悬浮液，加入适当稀释倍数的酶液和缓冲液，使反应体系pH值为4.8，于50℃、振荡频率80次/分的往复式恒温振荡器中反应30min，测定反应生成的葡萄糖量。一个羧甲基纤维素酶活力的单位(IU)定义为标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖的酶量。
β-葡萄糖苷酶活力的测定：采用对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物测定。0.1ml适当稀释的酶液与0.9ml 5mmol/L的pNPG溶液(由0.05mol/L、pH值为4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制)混合后，于50℃、振荡频率80次/分的往复式恒温振荡器中反应10min后立即加入2ml 1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，再加入10ml蒸馏水，摇匀。于400nm下测定吸光度。以0.1ml蒸馏水代替酶液作空白对照。每个样品做2～3个平行样，取平均值。一个β-葡萄糖苷酶活力单位(IU)定义为标准反应条件下每分钟生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量。
结果表明，里氏木霉以纸浆为碳源合成纤维素酶，培养4天，滤纸酶活力为2.57FPIU/ml，羧甲基纤维素酶活力为3.42IU/ml，β-葡萄糖苷酶活力为1.09IU/ml。
也可以用黑曲霉(A.niger)或绿色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)采用相似的方法制备获取纤维素酶。
实施例2：纤维素原料的获取
玉米芯提取木聚糖后的残渣，主要成分为纤维素，其含量为79.21％(干基)，水分含量为59.92％，是一种很好的纤维素资源。同时，玉米芯碱抽提木聚糖的过程实际上也是一个纤维质原料碱预处理的过程。因此，玉米芯经碱抽提后，无需再预处理就可以作为纤维低聚糖生产的原料，直接进行纤维素酶的水解。其原料的获取过程如下：
1.称取50g NaOH充分溶解于702ml蒸馏水中，加入粉碎粒度为0.5-1cm的风干玉米芯112g(绝干100g)，于90℃下反应3h。
2.上述反应物真空抽滤除去木聚糖抽提液，用500ml水抽滤洗涤，弃去洗涤液。
3.上述滤渣中加入300ml蒸馏水，用40％(w/v)的硫酸中和至pH值6-7，真空抽滤，并用900ml蒸馏水分3次洗涤、抽滤，得到木聚糖生产废渣。
该木聚糖生产废渣就是本技术所需要的纤维低聚糖生产原料；也可以用其他低聚木糖生产废渣、木糖渣、糠醛渣，或经过适当预处理的其他纤维质原料；预处理的目的是提高纤维质原料中纤维素对纤维素酶的可及度，可以采用物理、化学、生物或以上几种方法联合应用的预处理方法。
实施例3：吸附条件对纤维素原料吸附纤维素酶系中内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的影响
1.分别称取实施例2的木聚糖生产废渣6.31g(绝干重2.53g，其中纤维素2.0g，水分3.78g)于250ml三角瓶中，加入纤维素酶液11.67ml(酶加量15FPIU/g纤维素)，加入缓冲液和蒸馏水，控制吸附体系水分体积为40ml、pH3～8，置于150转/分的摇床中于pH值3～8、温度10～50℃条件下吸附0.25～6h。
2.吸附结束后，于3000转/分下离心10min，得到上清液，测定液相中羧甲基纤维素酶活力和β-葡萄糖苷酶活力，计算木聚糖生产废渣对内切葡聚糖和β-葡萄糖苷酶活力的吸附率。吸附温度、pH值和吸附时间对吸附率的影响结果如附图1～3。
底物木聚糖生产废渣对内切葡聚糖和β-葡萄糖苷酶的吸附率计算方法为：
吸附率(％)＝[(初始酶活力-吸附体系液相中酶活力)/初始酶活力]×100
其中初始酶活力、吸附体系液相中酶活力以含有的总活力表示，单位IU。
附图1～3表明，木聚糖生产废渣对纤维素酶系中的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的吸附作用受吸附条件(温度、pH值、时间)影响很大。以对内切葡聚糖酶吸附率最大而对β-葡萄糖苷酶吸附率最小为考察指标，最适宜的吸附条件为温度10℃、pH值7.0、吸附时间30min.。在此条件下，木聚糖生产废渣对内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的吸附率分别为83.14％和9.36％。吸附后固液分离，大量β-葡萄糖苷酶可随液体的分离而除去。
底物对纤维素酶系中内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的吸附情况(以底物对酶的吸附率表示)如表1。
表1纤维素底物对纤维素酶系中内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的吸附
| 内切葡聚糖酶活力 | β-葡萄糖苷酶活力 | |
| 吸附前 | 0 | 0 |
| 吸附后 | 83.14％ | 9.36％ |
当采用其它纤维素原料，如低聚木糖生产废渣、木糖渣、糠醛渣，或经过适当预处理的其他纤维质原料时，吸附效果基本相同。
实施例4：木聚糖生产废渣“底物原位吸附-固液分离拆分-定向水解”法制备纤维低聚糖
1.底物原位吸附--称取实施例2的木聚糖生产废渣31.55g(绝干重12.65g，其中纤维素10.0g，水分18.9g)于500ml三角瓶中，加入纤维素酶液58.37ml(酶加量15FPIU/g纤维素)，加入蒸馏水102.73ml，加入Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浓液20ml(稀释10倍后pH值7.0)，使吸附体系pH值为7.0。置于10℃、150转/分的摇床中吸附30min。
2.固液分离拆分--上述体系吸附完成后，于3000转/分下离心10min，得到上清液124.5ml，弃去。
3.定向水解--取上述离心分离后的沉淀物，加入蒸馏水114.5ml、1mol/L柠檬酸缓冲液10ml，充分混合，使反应体系pH值为4.8。置于50℃、150转/分的摇床中水解24h，水解结束后水解物于3000转/分条件下离心10min，得到的清液即为纤维低聚糖水解糖液。实验结果如表2。
纤维低聚糖水解糖液中葡萄糖浓度采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下：色谱仪：Agillent1100高效液相色谱仪；色谱柱：Bio-Rad AminexHPX-87H；流动相：0.005mol/L硫酸，流速：0.6ml/min；柱温：55℃；检测器：示差折光检测器；进样量：10μL。外标法测定。
纤维低聚糖水解糖液中纤维低聚糖浓度测定方法：用4％(w/v)的硫酸于121℃条件下水解纤维低聚糖水解糖液60min，使糖液中的纤维低聚糖水解成葡萄糖，用HPLC法测定经稀硫酸水解后的葡萄糖浓度；用纤维低聚糖经稀硫酸水解后的葡萄糖浓度减去糖液中初始葡萄糖浓度之差除以1.1(纤维低聚糖与单糖葡萄糖之间的转换系数)即可得到纤维低聚糖的浓度。
纤维低聚糖占总糖百分率指纤维低聚糖水解糖液中纤维低聚糖量除以纤维低聚糖和葡萄糖量之和。
本例中所使用的pH缓冲液可以是磷酸/磷酸钠缓冲液、醋酸/醋酸钠缓冲液、柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液等。酸是硫酸，碱是氢氧化钠或氢氧化钾。
比较例：未经过底物原位吸附-固液分离拆分β-葡萄糖苷酶的纤维素酶水解木聚糖生产废渣制备纤维低聚糖
直接使用实施例1中用里氏木霉制备获取的纤维素酶水解纤维素原料制备纤维低聚糖。实验方法如下：
称取实施例2的木聚糖生产废渣31.55g(绝干重12.65g，其中纤维素10.0g，水分18.9g)于500ml三角瓶中，加入纤维素酶液58.37ml(酶加量15FPIU/g纤维素)，加入蒸馏水112.73ml、1mol/L柠檬酸缓冲液10ml，充分混合，使反应体系pH值为4.8。置于50℃、150转/分的摇床中水解24h，水解结束后反应物于3000转/分条件下离心10min，得到的清液即为纤维低聚糖水解糖液。实验结果如表2。
表2纤维素酶经“底物原位吸附-固液分离”拆分前后的酶水解效果比较
结果表明：经底物原位吸附-固液分离法拆分β-葡萄糖苷酶以后获得的低β-葡萄糖苷酶活力纤维素酶，降解纤维素成纤维低聚糖的选择性大大增加。与未拆分处理的原纤维素酶液相比，水解产物中纤维低聚糖的比例从拆分前的27.58％提高到57.63％。
Claims (4)
1.一种微生物酶法生产纤维低聚糖新工艺，以经过预处理的纤维素为原料、真菌纤维素酶为初始酶制剂，其特征如下：
a.底物原位吸附——将纤维素原料与真菌纤维素酶混合，加入水，pH缓冲液或酸、碱，混合至固液重量比为1∶7～50，pH值为6～8，每克纤维素的纤维素酶用量为5～25FPIU/g，于5～25℃条件下摇或机械搅拌10～60min；
b.固液分离拆分，弃去上清液；
c.定向水解——在上述固液分离得到的渣中补加水，pH缓冲液或酸、碱，控制固液重量比为1∶7～50，pH值为4～6，在45～55℃的条件下摇或机械搅拌12～36h；
将定向水解物再次进行固液分离，所获得的上清液即为葡萄糖含量低的纤维低聚糖溶液。
2.如权利要求1所述的微生物酶法生产纤维低聚糖工艺，其特征是纤维素原料是木聚糖生产废渣或低聚木糖生产废渣、木糖渣、糠醛渣，或经过预处理的其他纤维质原料。
3.如权利要求1所述的微生物酶法生产纤维低聚糖工艺，其特征是真菌纤维素酶是里氏木霉(T.reesei)或黑曲霉(A.niger)、绿色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)分泌的纤维素酶。
4.如权利要求1所述的微生物酶法生产纤维低聚糖工艺，其特征是固液分离采用离心法或板框过滤法。
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