CN106381320A

CN106381320A - 纤维低聚糖的制备方法

Info

Publication number: CN106381320A
Application number: CN201610852061.XA
Authority: CN
Inventors: 曹吉祥
Original assignee: Jinan Meter Duo Tan New Energy Technology Co Ltd
Current assignee: Jinan Meter Duo Tan New Energy Technology Co Ltd
Priority date: 2016-09-27
Filing date: 2016-09-27
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2036-09-27
Also published as: CN106381320B

Abstract

本发明公开了一种纤维低聚糖的制备方法，属于生物技术领域。本发明使用特殊的蛋白酶、特殊的淀粉酶高效脱除纤维素原料中残存的蛋白质、淀粉，使用碱液脱除残存的半纤维素、木质素、灰分硅质等，得到了纯净纤维素；在此基础上，使用特殊培养基发酵木霉生成的纤维素酶，在该特殊的培养基中，木霉的生长减慢9.1%，但二种葡聚糖酶的分泌量和酶活力没有发生任何变化；而BG的分泌量和酶活力减少了97%。因而，在使用该特殊培养基发酵木霉所生成的纤维素酶系组成中，主要为本发明所需要的二种葡聚糖酶，从而可以高得率、高效地获得优质纤维低聚糖。本发明技术成熟、工艺衔接性好，对设备要求较低、投入少、得率高、易于工业化生产。

Description

纤维低聚糖的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种纤维低聚糖的制备方法。

背景技术

纤维低聚糖（Cello-oligosaccharides, 简称COS）是由天然纤维素水解制备的由2-10个葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接形成的混合物，又称纤维寡糖。COS不被胃肠酶消化，像低聚木糖、低聚果糖等低聚糖一样，具有特殊生物学、生理学功能，能够促进肠内双歧杆菌、乳酸杆菌的增值，且热稳定性、化学稳定性都高，应用前景非常广阔。

不同于纤维素，COS溶于水；作为水溶性膳食纤维，COS可减缓消化速度和最快速排泄胆固醇，所以可让血液中的血糖和胆固醇控制在最理想的水准；还可以帮助糖尿病患者降低胰岛素和三酸甘油脂；因此，COS生理活性比非水溶性的膳食纤维素要广、要高。因而，由纤维素制备COS，经济效益非常显著。

但是现有技术中制备纤维低聚糖设备及人工成本高、工艺复杂且得率低、所得纤维低聚糖纯度低、质量差。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种绿色环保、工艺简单、设备及人工成本低且得率高，所得纤维低聚糖纯度高、质量佳的纤维低聚糖的制备方法。

本发明的技术方案为：

一种纤维低聚糖的制备方法，包括步骤：

1）将粗纤维素置于汽爆分离器中，加入粗纤维素质量1-20倍的水，并加入复合蛋白酶，间歇1-3分钟，通入惰性气体，酶解10-80分钟；随后加入常温型α-淀粉酶，酶解10-80分钟；然后通入蒸汽升温至60-70℃，保温2-20分钟，灭活酶的活性；所述复合蛋白酶由具备内肽酶活性的碱性蛋白酶和具备端肽酶活性的蛋白酶K组成；所述常温型α-淀粉酶由微波诱导所得变异地衣芽孢杆菌分泌所得α-淀粉酶，所述常温型α-淀粉酶的适宜温度为22-35℃；

2）灭酶后，向汽爆分离器中加入碱至碱液质量浓度为5-25%，接着向汽爆分离器中通入水蒸汽至温度升至85-95℃后，停止通水蒸汽；向汽爆分离器中通入惰性气体，将汽爆分离器内空气排净，封口；然后间歇性向汽爆分离器内通入水蒸汽以及惰性气体，以维持汽爆分离器内温度为80-110℃、压力为0.5-2MPa，保温保压10-120分钟后喷放；

3）喷放浆状物趁热固液分离，得滤渣一和滤液一；

4）采用酸性的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液对滤渣一反复洗涤、分离，得滤渣二和滤液二；向滤渣二中加入1-5质量倍数的所述Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，滤渣二于悬浮状态保存、备用；

5）将步骤4）所得滤渣二的悬浮液置于酶解罐，并向所述酶解罐中继续加入所述Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，调节pH为4.5-5.5；然后加入采用新型培养基发酵木霉所得到的纤维素酶，于30-65℃下酶解8-30小时，酶解完毕后灭酶；所述新型培养基的组成为马铃薯汁、碳酸钙；

6）去除步骤5）酶解后混合物中的颗粒物，得上清液；所述上清液经活性炭和硅藻土组成的层析柱过滤，分别以水以及梯度浓度的乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；

7）去除所述洗脱液中的无机盐以及分子量小于300并大于2000的组份，然后经浓缩、干燥，即得纤维低聚糖晶体。

作为优选方案，步骤1）中，所述微波诱导所得变异地衣芽孢杆菌的获取步骤具体为：将地衣芽孢杆菌的培养液置于微波发生器，设置微波功率为850-950W，脉冲频率为2300MHz，微波处理20s，冷却20s，依此往复25-35次；将微波处理后的培养液涂布在固体培养基上，30℃条件下培养1-2天，由存活下来的菌落中筛选四株常温下α-淀粉酶活性高的地衣芽孢杆菌的变异菌株。

进一步的，选出常温下α-淀粉酶活性最高的地衣芽孢杆菌的变异菌株扩大培养，从而获得所述常温型α-淀粉酶。采用该方法获得的常温型α-淀粉酶，在常温下即可高效酶解淀粉，既降低了能耗，又避免了副反应的发生。

作为优选方案，所述复合蛋白酶中具备内肽酶活性的碱性蛋白酶与具备端肽酶活性的蛋白酶K的比例为1:1-3；所述复合蛋白酶的加入量满足每千克干基粗纤维素400-800U，所述常温型α-淀粉酶的加入量满足每千克干基粗纤维素300-700U。

作为优选方案，步骤2）中，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或氢氧化钙。

作为优选方案，所述新型培养基的组成为马铃薯汁1000mL、碳酸钙20g。当用平板固体培养时，再加琼脂20g。

作为优选方案，步骤5）中，所述纤维素酶的加入量为每千克干基纤维素100-800U。

作为优选方案，步骤6）中，所述活性炭和硅藻土组成的层析柱中活性炭与硅藻土的质量比为2-8：8-2。

作为优选方案，步骤7）中，通过微滤、纳滤、超滤、反渗透的方法去除所述洗脱液中的无机盐以及分子量小于300并大于2000的组份。

作为优选方案，步骤1）中，所述粗纤维素为由秸秆、林木或其副产品制得的纤维素

作为优选方案，步骤7）中，所述干燥为喷雾干燥、热风干燥、流化床干燥或冷冻干燥。

作为优选方案，所述惰性气体为氮气、氦气或氩气。优选为氮气，氮气成本低。

本发明优选使用由稻草、小麦、玉米等秸秆制备的粗纤维素作为生产COS的原料，一方面这类秸秆资源相当丰富；另一方面这类秸秆纤维短小、杂细胞多，不能成为优质浆粕用于其它用途；其纤维短小的特点表现在纤维素结构上反而成了优点：其纤维素分子中结晶区占比很小，且很容易在外力作用下结晶区的氢键被破解；因而有助于酶与底物的接触、有利于后续酶促反应的进行和COS的生成。

本发明的有益效果为：

本发明使用特殊的蛋白酶、特殊的淀粉酶高效脱除纤维素原料中残存的蛋白质、淀粉，使用碱液脱除残存的半纤维素、木质素、灰分硅质等，得到了纯净纤维素；在此基础上，使用特殊培养基发酵木霉生成的纤维素酶，在该特殊的培养基中，木霉的生长减慢9.1%，但二种葡聚糖酶的分泌量和酶活力没有发生任何变化；而BG的分泌量和酶活力减少了97%。因而，在使用该特殊培养基发酵木霉所生成的纤维素酶系组成中，主要为本发明所需要的二种葡聚糖酶（CBH、EG），从而可以高得率、高效地获得优质的纤维低聚糖结晶。

本发明技术成熟、工艺衔接性好，对设备要求较低，投入少，得率高，所得产物纯度极高，易于工业化生产。

具体实施方式

实施例1

一种纤维低聚糖的制备方法，包括步骤：

1）将由玉米秸秆制得的粗纤维素置于汽爆分离器中，加入粗纤维素质量10倍的水，并加入复合蛋白酶（500U/千克干基粗纤维素），间歇1分钟，通入氮气，酶解40分钟；随后加入常温型α-淀粉酶（400U/千克干基粗纤维素），酶解30分钟；然后通入蒸汽升温至65℃，保温12分钟，灭活酶的活性。

其中，复合蛋白酶由具备内肽酶活性的碱性蛋白酶和具备端肽酶活性的蛋白酶K组成，复合蛋白酶中具备内肽酶活性的碱性蛋白酶与具备端肽酶活性的蛋白酶K的比例为1: 1；该复合蛋白酶可以在常温下高效水解蛋白质。

常温型α-淀粉酶由微波诱导所得变异地衣芽孢杆菌分泌所得α-淀粉酶；微波诱导所得变异地衣芽孢杆菌的获取步骤具体为：将地衣芽孢杆菌的培养液置于微波发生器，设置微波功率为900W，脉冲频率为2300MHz，微波处理20s，冷却20s，依此往复30次；将微波处理后的培养液涂布在固体培养基上，30℃条件下培养1-2天，由存活下来的菌落中筛选四株常温下α-淀粉酶活性高的地衣芽孢杆菌的变异菌株。选出常温下α-淀粉酶活性最高的地衣芽孢杆菌的变异菌株扩大培养，从而获得常温型α-淀粉酶；常温型α-淀粉酶在22-35℃温度下高效率地水解淀粉，不必像目前大多采用的高温型α-淀粉酶需要高温（80-90℃）条件，因而减少了能耗也降低了对设备的要求，同时极大减少了副反应的发生。

此处用酶法可以柔和地将蛋白质、淀粉水解成小分子的肽类、氨基酸、麦芽糖、葡萄糖等进入滤液中，从而成功脱除蛋白质和淀粉；以保证纤维素的纯度。

2）灭酶后，向汽爆分离器中加入氢氧化钾至氢氧化钾溶液的质量浓度为16%，接着向汽爆分离器中通入水蒸汽至温度升至90℃后，停止通水蒸汽；向汽爆分离器中通入氮气，将汽爆分离器内空气排净，封口；然后间歇性向汽爆分离器内通入水蒸汽以及惰性气体，以维持汽爆分离器内温度为105℃、压力为1.5MPa，并使物料分布均匀，保温保压40分钟后喷放。

该步骤中，用碱液脱除原料纤维素残存的半纤维素、木质素、灰分硅质等无机盐。

此处采用较低蒸煮温度、惰性气体环境，目的在于避免纤维素分子基团的分解、氧化、脱水、剥皮、酯化等反应；在较高罐内压力下，纤维素分子中结晶区氢键被破解，利于酶促反应的进行。

3）喷放浆状物趁热卧螺离心分离，得滤渣一和滤液一；滤渣一即为纯净纤维素的浆料，滤液一为脱除的残余半纤维素、木质素、灰分硅质等。

4）采用酸性的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液对滤渣一反复洗涤、卧螺分离，得滤渣二和滤液二（滤渣二即为纯净的纤维素）；向滤渣二中加入3质量倍数的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，滤渣二于悬浮状态保存、备用。

步骤4）中，将纤维素置于酸性环境中，可以有效避免纤维素分子结晶区氢键的再度形成，为酶促反应做准备。

5）将步骤4）所得滤渣二（纯净纤维素）的悬浮液置于酶解罐，并向酶解罐中继续加入Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，调节pH为4.7；然后加入采用新型培养基发酵木霉所得到的纤维素酶（纤维素酶的加入量满足500U/千克干基纤维素），于50℃下酶解20小时，酶解完毕后，升温至95℃，灭酶；新型培养基的组成为马铃薯汁1000mL、碳酸钙20g和琼脂20g（琼脂用于平板固体培养）。

需要说明的是：

工业上制备纤维素酶的常用菌种为木霉（Trichoderma reesei），可以分泌生成纤维素酶系组成中的全部三种酶，即外切葡聚糖酶（CBH）、内切葡聚糖酶（EG）和β-葡萄糖苷酶（BG）。而BG专门将纤维二糖分解成二个葡萄糖分子；本发明的目的在于制备纤维低聚糖而不是葡萄糖；因而BG的活性或功能越弱化越好。

在木霉培养基经典PDA配方（马铃薯汁1000ml、葡萄糖20g、琼脂20g）中，将碳源物质由水溶性的葡萄糖（20g）更换为水不溶性的碳酸钙（20g）。对比试验表明，在修改的培养基中，木霉的生长减慢9.1%，但二种葡聚糖酶的分泌量和酶活力没有发生任何变化；而BG则不同，BG的分泌量和酶活力减少了97%。因而，在使用修改培养基发酵木霉所生成的纤维素酶系组成中，主要为本发明所需要的二种葡聚糖酶（CBH、EG），这是完成本发明的关键所在。

6）卧螺离心，除去颗粒物，得上清液，酶解产物即在上清液中；上清液经活性炭和硅藻土（活性炭与硅藻土5：5）组成的层析柱过滤，分别以水以及梯度浓度的乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；先用水洗脱，则单糖首先洗脱出来，然后逐步增大乙醇浓度，纤维低聚糖逐渐被洗脱出来；

7）依次通过微滤、纳滤、超滤、反渗透对洗脱液进行纯化，去除洗脱液中的无机盐以及分子量小于300并大于2000的组分（如单糖或高聚糖），然后经蒸发浓缩、喷雾干燥，即得纤维低聚糖。经检测，COS得率57.7%（相对原料纤维素干基质量），所得COS纯度为97.9%。

其中，粗纤维素的获取方法为：

秸秆经去杂、除尘、揉丝、切段、清洗后置入置于汽爆分离器中，加入秸秆质量10倍的水，加入氢氧化钾至碱液质量浓度为12%，向汽爆分离器中通入水蒸汽至温度升至85℃后，停止通水蒸汽；向汽爆分离器中通入惰性气体，将汽爆分离器内空气排净，封口；然后间歇性向汽爆分离器内通入水蒸汽以及惰性气体，以维持汽爆分离器内温度为95℃、压力为1.2MPa，保温保压50分钟后喷放；将喷放浆状物移至研磨磨中研磨，研磨完毕过40目筛，筛除浆液中的短小纤维；固液分离，所得滤渣即为粗纤维素。

实施例2

一种纤维低聚糖的制备方法，包括步骤：

1）将由小麦秸秆制得的粗纤维素置于汽爆分离器中，加入粗纤维素质量8倍的水，并加入复合蛋白酶（600U/千克干基粗纤维素），间歇1分钟，通入氮气，酶解50分钟；随后加入常温型α-淀粉酶（500U/千克干基粗纤维素），酶解40分钟；然后通入蒸汽升温至65℃，保温12分钟，灭活酶的活性。

其中，复合蛋白酶由具备内肽酶活性的碱性蛋白酶和具备端肽酶活性的蛋白酶K组成，复合蛋白酶中具备内肽酶活性的碱性蛋白酶与具备端肽酶活性的蛋白酶K的比例为1:2；该复合蛋白酶可以在常温下高效水解蛋白质。

2）灭酶后，向汽爆分离器中加入氢氧化钾至氢氧化钾溶液的质量浓度为12%，接着向汽爆分离器中通入水蒸汽至温度升至95℃后，停止通水蒸汽；向汽爆分离器中通入氮气，将汽爆分离器内空气排净，封口；然后间歇性向汽爆分离器内通入水蒸汽以及惰性气体，以维持汽爆分离器内温度为100℃、压力为1.2MPa，并使物料分布均匀，保温保压30分钟后喷放。

4）采用酸性的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液对滤渣一反复洗涤、卧螺分离，得滤渣二和滤液二（滤渣二即为纯净的纤维素）；向滤渣二中加入2质量倍数的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，滤渣二于悬浮状态保存、备用。

5）将步骤4）所得滤渣二（纯净纤维素）的悬浮液置于酶解罐，并向酶解罐中继续加入Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，调节pH为5；然后加入采用新型培养基发酵木霉所得到的纤维素酶（纤维素酶的加入量满足600U/千克干基纤维素），于45℃下酶解10小时，酶解完毕后，升温至95℃，灭酶；新型培养基的组成为马铃薯汁1000mL、碳酸钙20g和琼脂20g（琼脂用于平板固体培养）。

需要说明的是：

6）卧螺离心，除去颗粒物，得上清液，酶解产物即在上清液中；上清液经活性炭和硅藻土（活性炭与硅藻土4：6）组成的层析柱过滤，分别以水以及梯度浓度的乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；先用水洗脱，则单糖首先洗脱出来，然后逐步增大乙醇浓度，纤维低聚糖逐渐被洗脱出来；

7）依次通过微滤、纳滤、超滤、反渗透对洗脱液进行纯化，去除洗脱液中的无机盐以及分子量小于300并大于2000的组分（如单糖或高聚糖），然后经蒸发浓缩、喷雾干燥，即得纤维低聚糖。经检测，COS得率55.9%（相对原料纤维素干基质量），所得COS纯度为98.2%。

其中，粗纤维素的获取方法为：

Claims

1.一种纤维低聚糖的制备方法，其特征在于，包括步骤：

3）喷放浆状物趁热固液分离，得滤渣一和滤液一；

2.如权利要求1所述纤维低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述微波诱导所得变异地衣芽孢杆菌的获取步骤具体为：将地衣芽孢杆菌的培养液置于微波发生器，设置微波功率为850-950W，脉冲频率为2300MHz，微波处理20s，冷却20s，依此往复25-35次；将微波处理后的培养液涂布在固体培养基上，30℃条件下培养1-2天，由存活下来的菌落中筛选四株常温下α-淀粉酶活性高的地衣芽孢杆菌的变异菌株。

3.如权利要求2所述纤维低聚糖的制备方法，其特征在于：选出常温下α-淀粉酶活性最高的地衣芽孢杆菌的变异菌株扩大培养，从而获得所述常温型α-淀粉酶。

4.如权利要求1或2所述纤维低聚糖的制备方法，其特征在于：所述复合蛋白酶中具备内肽酶活性的碱性蛋白酶与具备端肽酶活性的蛋白酶K的比例为1:1-3；所述复合蛋白酶的加入量满足每千克干基粗纤维素400-800U，所述常温型α-淀粉酶的加入量满足每千克干基粗纤维素300-700U。

5.如权利要求1所述纤维低聚糖的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或氢氧化钙。

6.如权利要求1所述纤维低聚糖的制备方法，其特征在于：所述新型培养基的组成为马铃薯汁1000mL、碳酸钙20g。

7.如权利要求1或6所述纤维低聚糖的制备方法，其特征在于：步骤5）中，所述纤维素酶的加入量为每千克干基纤维素100-800U。

8.如权利要求1或6所述纤维低聚糖的制备方法，其特征在于：步骤6）中，所述活性炭和硅藻土组成的层析柱中活性炭与硅藻土的质量比为2-8：8-2。

9.如权利要求1所述纤维低聚糖的制备方法，其特征在于：步骤7）中，通过微滤、纳滤、超滤、反渗透的方法去除所述洗脱液中的无机盐以及分子量小于300并大于2000的组份。

10.如权利要求1所述纤维低聚糖的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述粗纤维素为由秸秆、林木或其副产品制得的纤维素。