CN104845952B - 一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法 - Google Patents

一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的准备、孢子悬液的制备、摇瓶液体发酵、复合酶制剂的制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂，得到的复合酶制剂酶活力强、可溶于水、无异味、热稳定性好、催化活性强，具有极好的工业化应用前景。

Description

一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素 酶复合酶制剂的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法。
背景技术
阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，ferulicacid esterase，FAE)又称肉桂酸酯酶，是一种新型酶制剂，它主要以阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯、多糖阿魏酸酯和木质素阿魏酸酯为底物，破坏阿魏酸与多糖相连的酯键，从植物细胞壁中释放阿魏酸，让余下的多糖主链易被降解，有效提高了含有大量木质纤维素和阿魏酸的副产品的营养价值。阿魏酸具有多种生理功能如清除自由基、抗紫外线辐射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突变、防癌、增强精子活力以及调节人体免疫等。因此，在食品工业中可利用该酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸秆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，获得功能性食品基料。阿魏酸酯酶在食品工业中具有广阔的应用前景。
在饲料工业中，农作物植物性的纤维原材料经过阿魏酸酯酶处理后，阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，植物材料致密的细胞骨架结构受到破坏，打破了木质素、半纤维素及纤维素之间的连接，这种疏松的植物性原料更容易被牲畜消化吸收利用，可显著提高饲料的利用率。
纤维素酶是一类能降解纤维素中β-1,4 糖苷键的O-糖基化水解酶。在饲料业生产中，纤维素酶作为一种新型的饲料添加剂，添加剂量一般在0.1%-0.3%。由于植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成的，阻止了动物对植物细胞内营养物质的消化吸收，纤维素酶能在动物体内分解结构复杂的纤维素，摧毁植物细胞壁并释放营养物质，生成易于消化的葡萄糖，使饲料的利用率增大，同时增进酸度，激活胃蛋白酶，促进消化吸收；纤维素酶还能显著减少动物肠道内大肠杆菌的数量并促进有益微生物的生长，改善肠道内菌群平衡。
目前已经筛选到多种分泌阿魏酸酯酶和纤维素酶的微生物菌株，包括真菌、细菌和酵母。发现的产阿魏酸酯酶微生物主要有黑曲霉(Aspergillus niger)、链霉菌(如Streptomyces avermitilis)、梭菌(如Clostridium thermocellum)、杆菌(如Bacillus sp.)、乳酸杆菌(Lactobacilli)、假单胞菌(如Pseudomonas fluorescens)等。但绝大多数阿魏酸酯酶从真菌中分离得到，如米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)、黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、青霉类(Penicillium)。
目前，阿魏酸酯酶在饲料工业中的需求很大，而应用于工业的阿魏酸酯酶主要来源于黑曲霉，由于黑曲霉阿魏酸酯酶对高温、酸或碱等条件耐受性不足，在工业生产使用过程中，阿魏酸酯酶酶活损失严重，很大程度上限制了阿魏酸酯酶在工业上的应用。本发明的产阿魏酸酯酶的菌株为深绿木霉(Trichoderma atroviride)，为第一次报道，而且该菌株除了产生阿魏酸酯酶以外，还高产高活性的纤维素酶。同时所产阿魏酸酯酶具有很强的耐热性、耐酸性。这些特性非常适合其在饲料工业中应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的准备、孢子悬液的制备、摇瓶液体发酵、复合酶制剂的制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂，该复合酶制剂耐高温、酸碱稳定性好。
所述的深绿木霉（Trichoderma atroviride）AWS26，已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号：CGMCC No. 8673。
所述三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，包括以下步骤：
步骤1，发酵菌种的准备：将深绿木霉菌种Aws26在PDA活化培养基上划线活化，置于37-40℃恒温培养箱中培养48-72h，得活化菌种；
步骤2，制备深绿木霉孢子悬液：从步骤1活化好的菌种中刮取深绿木霉菌丝，转移至深绿木霉孢子培养基上，置于37-40°C生化培养箱内培养培养72h至菌丝长出孢子，经两次传代培养恢复其活力，以含有0.01%吐温80的无菌水洗涤收集孢子，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液；
步骤3，复合酶摇瓶液体发酵：将步骤2所得孢子悬液，以4-8v/v%接种量接入装有100-150mL摇瓶发酵培养基一的三角瓶中，40-42℃摇床发酵18-24h，摇床转速160-200r/min；然后将灭好菌的摇瓶发酵培养基二100-150mL倒入以上发酵18-24h后的三角瓶中，发酵温度降至35-37℃，继续震荡发酵培养，发酵时间达到40-48h时，温度降至30-35h，继续发酵24-48h，发酵终止，得混合酶发酵液；
步骤4，复合酶制剂的制备：取步骤3所得混合酶发酵液，过滤后将滤液8000r/min、离心20min，取上清液，经超滤膜浓缩两次，浓缩液在50-60℃条件下真空浓缩，在所得粗酶液中加入保护剂2-3wt%的糊精、1-3wt%的可溶性淀粉、0.1-0.2wt%的山梨酸钾，搅拌分散后，-20℃冷冻8-10h，真空度30-40Pa、温度-35℃下，冷冻15-18h，即得复合酶制剂。
作为上述发明的进一步改进，步骤1中所述PDA活化培养基的配方为：土豆浸出液100mL，无机盐液1mL，蔗糖2g，琼脂粉1.5g，pH5.0-6.0，121℃灭菌15min。
作为上述发明的进一步改进，步骤2中所述深绿木霉孢子培养基的配方为：土豆浸出液50mL，麸皮浸出液50mL，蔗糖1g，琼脂粉1.5g，pH5.0-6.0，121℃灭菌15min；其中，土豆浸出液：土豆削皮切成1cm3小块，称取200g，加入1000mL水，煮沸30min，过滤，定容到1000mL；麸皮浸出液：50g麸皮加入300mL水，煮沸30min，过滤，定容到200mL。
作为上述发明的进一步改进，步骤3中所述摇瓶发酵培养基一的配方为：蛋白胨0.5g、葡萄糖0.5g、硫酸铵0.5g、牛肉膏0.2-0.5g、NaCl 0.5g、KH2PO4 0. 1g、MgSO4·7H2O0.04g、CaCl2 0.2-0.5g，去离子水100mL，pH6.5-6.8，121°C灭菌灭菌20min；摇瓶发酵培养基二的配方为：麸皮粉2g、花生壳粉1g、米糠粉1g、豆饼粉1-1.5g、玉米浆1g、尿素0.5g、NH4NO3 0.5g、吐温80 2g，微量元素1mL，去离子水100mL，pH6.5-6.8，121°C灭菌20min；其中，微量元素的配方为：MnCl2•4H2O 0.1g，CoCl2 0.05g，CuSO4 0.02g，MgSO4 0.3g，K2HPO4 1g，FeSO4•7H2O 0.1g，ZnCl2 0.03g，LiCl 0.05g，CaCl2 0.05g，H3BO3 0.01g，KI 0.5g，去离子水1000 mL。
本发明得到复合酶制剂中阿魏酸酯酶酶活力达512U/g、纤维素酶酶活力达2512U/g，复合酶制剂可溶于水、无异味，且热稳定性好，35℃保存6个月后酶活力仍大于90%；复合酶制剂催化活性强，最适作用温度在45℃-70℃，最适作用pH值范围在4.5-7.0。本发明所采用的液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料使用豆饼粉、玉米粉、大豆秸秆分、麸皮粉等农副产物，成本低廉，整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业规模化发酵罐培养生产。
附图说明
图1为实施例3中温度对阿魏酸酯酶与纤维素酶酶活性的影响曲线；
图2 为实施例3中pH值对阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活性的影响曲线；
图3 为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶酶的热稳定性曲线；
图4 为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶pH稳定性曲线。
具体实施方式
实施例1
本实施例说明深绿木霉AWS26的筛选方法，具体步骤如下：
步骤1，采样及样品处理：
从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，160r/min振荡30min，制成悬液，然后将此三角瓶放入60-70℃恒温震荡水浴锅中，100r/min震荡处理20-30min，得土样浑浊液。
步骤2，富集培养：
吸取2-4mL步骤1所得土样浑浊液，加至装有30-60mL富集培养基一的容量为250mL的三角瓶中，于45-50℃、转速160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d，得富集培养液。无菌操作量取30-50mL富集培养液，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，用富集培养基二将离心后的沉淀洗至装有30-60mL富集培养基二的250mL三角瓶中，于45-50℃、转速160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
步骤3，初筛：
将第二次富集后的培养液逐级稀释到10-3、10-4、10-5、10-6，取各级稀释的培养液0.2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿口封好，并置于37-40℃恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45℃恒温培养箱中继续倒置培养2-4d。
将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基，接种好的培养皿40-45℃恒温培养箱中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。将纤维素酶初筛平板上加入一定量0.1%的刚果红染液，染色1-10min，倒掉染色液，观察菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯酶初筛培养基平板上接种出来，进一步复筛。阿魏酸酯酶和纤维素酶初筛平板检测结果分别如表1和表2所示。
步骤4，复筛：
将步骤3初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45℃恒温培养箱中培养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化。
步骤5，菌种保藏：
将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35-40℃下培养3-5d，切取1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/min转速下37-40℃进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10%（v/v）的接种量，将液体种子接种到液体发酵培养中，在160-180r/min转速下40-45℃进行液体震荡发酵培养。发酵培养3-5d，取发酵液1200r/min，10min离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面培养基上，4℃保藏。复筛结果如表3所示，综合考虑阿魏酸酯酶和纤维素酶的酶活情况，选择菌株AWS26作为目的菌株。
其中，所使用的培养基配方如下：
富集培养基一：阿魏酸乙酯0.2g、羧甲基纤维素钠0.5g，无机盐营养液1mL，补充水至100mL，pH4.5，121℃、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度50mg/L。
富集培养基二：麸皮粉1g、玉米秸秆粉1g，阿魏酸乙酯0.2g、无机盐营养液1mL，补充水至100mL，pH4.5，121℃、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度50mg/L。
霉菌筛选培养基：PDA培养基800mL，孟加拉红0.02g，氯霉素0.1g，无机盐营养液1mL，补水至1000mL，琼脂粉15g。121℃、15min灭菌。孟加拉红和氯霉素灭菌后加入。
阿魏酸酯酶初筛培养基：PDA培养基100mL，无机盐营养液1mL，阿魏酸乙酯溶液1mL，琼脂粉1.5g，pH4.5，121℃灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，培养基逐渐变得不透明，在60-70℃下倒入平板中。其中，阿魏酸乙酯溶液：称取0.22g阿魏酸乙酯于离心管中，加入500μL N、N-二甲基酰胺溶液，震荡溶解后再加入500μL无菌水，充分摇匀。
纤维素酶初筛培养基：纤维素粉1g，蛋白胨0.1g，酵母粉0.1g，无机盐营养液1mL，琼脂1.5，加蒸馏水定容至100mL，pH值4.5。121℃灭菌15min。
固体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液1mL，琼脂粉1.5g，pH5.0，121℃，15min灭菌。
液体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液1mL。121℃，15min灭菌。
液体发酵培养基：PDA培养基80mL，无机盐营养液1mL，蛋白胨1g，吐温80 0.5mL，(NH4)2SO4 1g，补充去离子水至100mL。121℃，15min灭菌。
上述培养基中，无机盐营养液：NaNO3 2.0g，K2PO4 1.5g，CaCl2 1.5g，MgSO4 0.3g，FeSO4·7H2O 0.1g，MnSO4·H2O 1.6mg，ZnSO4·H2O 0.05g，CoCl2 0.5mg，(NH4)2SO4 5g，去离子水1000mL。
PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤，添加蔗糖20g，补充水至1000mL。
表1产阿魏酸酯酶霉菌平板初筛结果
表2产纤维素酶霉菌平板初筛结果
表3各菌株粗酶液酶活
本发明所得菌株AWS26，菌落在PDA平板上呈辐射状快速生长，初期菌丝表面疏松、平坦，白色，因产生分生孢子而呈现淡绿色，以后逐渐增多，呈深绿色。菌丝层致密、较厚，产孢丛束排列成同心轮纹状，菌落背面无色。在放大400倍的光学显微镜下观察，菌丝体由具有横隔的分枝菌丝构成，孢子梗由菌丝直立生出，分枝繁复，近似直角伸出，对生或互生，呈树枝状排列，孢子梗长5.0-12.0μm，中间宽2.5-3.7μm，基部宽1.5-3.0。分生孢子成簇着生于分生孢子梗的顶端。分生孢子球形或椭圆形，大小为3.0-4.5×2.5-3.8μm，表面粗糙，布满小刺，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。对照《真菌鉴定手册》和相关文献确定该菌株是深绿木霉（Trichoderma atroviride）。
提取本发明菌株AWS26基因组，依据真菌18SrDNA中最保守的序列设计引物，扩增采用上游引物：5'-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（如SEQ ID NO.2 所示），下游引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（如SEQ ID NO.30. 所示）。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性40S，52℃退火40S，72℃延伸lmin，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物连接pMD18-T载体。PCR反应体系为：10×Buffer2μL，dNTP(2.5mmol/L）2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，template10～50ng，Taq酶(2.5U) 0.3μl，加水补足20μL。经PCR扩增得到其18S rDNA片段712bp。将该扩增片段凝胶回收并测序，提交GenBank进行核酸同源性分析，测得序列如SEQ ID NO.1 所示，与从NCBI中比对获得的相近霉菌的18SrDNA序列采用ClustalX1.83进行多序列比对，然后采用MEGA4.0生物学软件构建系统进化树，结果显示菌株AWS26的18SrDNA核苷酸序列与Trichoderma atroviride（JX462604）的18S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性(maxident)达到99%。综合结合其形态特征、培养特征观察，将菌株AWS26鉴定为深绿木霉（Trichoderma atroviride）。
实施例2
本实施例说明深绿木霉AWS26通过三角瓶发酵制备阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂。具体步骤如下：
步骤1，发酵菌种的准备：将深绿木霉菌种AWS26在PDA活化培养基平板上划线活化，而后倒置于37-40℃恒温培养箱中48-72h进行活化培养。
步骤2，制备深绿木霉孢子悬液：从步骤1活化好的菌种中用接种环刮取深绿木霉菌丝，转移至深绿木霉孢子培养基上，置于37-40℃生化培养箱内培养培养72h至菌丝长出孢子，经两次传代培养恢复其活力，以含有0.01 v/v%吐温80的无菌水多次洗涤收集孢子，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，备用。
步骤3，复合酶摇瓶液体发酵：将步骤2制备好的深绿木霉孢子悬液，以4-8 v/v%的接种量接入装有100-150mL摇瓶发酵培养基一的1000mL三角瓶中，三角瓶塞采用乳胶塞，40-42℃摇床发酵18-24h，摇床转速160-200r/min；然后将灭好菌的摇瓶发酵培养基二100-150mL倒入以上发酵18-24h后的三角瓶中，发酵温度降至35-37℃，继续震荡发酵培养，发酵时间达到40-48h时，温度降至30-35℃，继续发酵24-48h，发酵终止。所得发酵液阿魏酸酯酶酶活为：262U/L；纤维素酶酶活为：915U/mL。
酶活性测定方法为：
（1）发酵液的阿魏酸酯酶活力测定
向2mL离心管中加入0.5mL经过1-5倍稀释后的酶液，然后再加入0.5mL阿魏酸甲酯溶液，充分混匀，65℃保温20min。再加入1mL体积分数为10%的冰乙酸以终止反应。样品于12000r/min离心10min。保留上清液，稀释2-4倍后，用高效液相色谱(HPLC)法测定样品中的阿魏酸含量。以煮沸灭活的酶液作为对照组，处理方法同上。
阿魏酸酯酶的酶活定义：在50℃，pH值为6.5的条件下，每分钟酯解阿魏酸甲酯，生成1μmol阿魏酸所需的酶量。阿魏酸采用高效液相色谱法测定。
（2）纤维素酶滤纸酶活力的测定方法：将新华定性滤纸剪成大小为1×6cm，置于离心管中，加入pH4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1mL，于55℃温度的水浴锅中预热。加入酶液500μL，保温反应60min。加入3mL的DNS试剂，沸水浴5min显色，放置冷水中冷却至室温。吸取200μL反应上清液，在波长540nm处测定样品的吸光值，根据绘制的葡萄糖浓度标准曲线计算出反应体系中的葡萄糖浓度。以煮沸灭活的酶液作为对照组，处理方法同上。
纤维素酶的活力单位（U）定义为：在上述条件下，每分钟分解羧甲基纤维素钠生成1μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。
步骤4，发酵结束后，将发酵液经4层纱布过滤，去除菌丝，收集滤液，滤液在8000r/min、离心20min，弃去沉淀，保留上清。采用超滤膜超滤，第一次采用截留分子质量为120-150kDa的超滤膜过滤，保留滤出液，第二次用20-30kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3～5倍，保存截留液。所得截留液在50-60℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩，进一步将酶液浓缩至原体积的10-20%得粗酶液。
步骤5，向浓缩后的粗酶液中加入保护剂2-3wt%的糊精、1-3wt%的可溶性淀粉、0.1-0.2wt%的山梨酸钾。充分搅拌分散后，-20℃冷冻8-10h，真空度30-40Pa、温度-35°C下，冷冻15-18h。粉碎，即得到阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂。利用本方法制备的酶制剂收率达到80%以上。
其中，所使用的培养基配方如下：
PDA活化培养基：土豆浸出液100mL，无机盐液1mL，蔗糖2g，琼脂粉1.5g，pH5.0-6.0，121℃，15min。
深绿木霉孢子培养基：土豆浸出液50mL，麸皮浸出液50mL，蔗糖1g，琼脂粉1.5g，pH5.0-6.0，121℃，15min。
土豆浸出液：土豆削皮切成1cm3小块，称取200g，加入1000mL水，煮沸30min，过滤，定容到1000mL。
麸皮浸出液：50g麸皮加入300mL水，煮沸30min，过滤，定容到200mL。
摇瓶发酵培养基一：蛋白胨0.5g、葡萄糖0.5g、硫酸铵0.5g、牛肉膏0.2-0.5g、NaCl0.5g、KH2PO4 0. 1g、MgSO4·7H2O 0.04g、CaCl2 0.2-0.5g，去离子水100mL，pH6.5-6.8，121°C，灭菌20min。
摇瓶发酵培养基二：麸皮粉2g、花生壳粉1g、米糠粉1g、豆饼粉1-1.5g、玉米浆1g、尿素0.5g、NH4NO3 0.5g、吐温80 2g，微量元素1mL，去离子水100mL，pH6.5-6.8，121°C，灭菌20min。
微量元素：MnCl2•4H2O 0.1g，CoCl2 0.05g，CuSO4 0.02g，MgSO4 0.3g，K2HPO4 1g，FeSO4•7H2O 0.1g，ZnCl2 0.03g，LiCl 0.05g，CaCl2 0.05g，H3BO3 0.01g，KI 0.5g，去离子水1000 mL。
本发明所得的酶制剂能达到以下指标：阿魏酸酯酶酶活力512U/g，纤维素酶酶活力2512U/g。产品为棕褐色固体粉末、可以溶于水、无异味。产品热稳定性好，35℃下，保存6个月后酶活力仍大于90%。酶催化活性强，最适作用温度在45℃-70℃之间。本产品最适作用pH值范围在4.5-7.0。
实施例3
本实施例说明本发明所得阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的性质。
1. 酶反应最适温度测定
将反应体系分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的水浴，适度稀释后，分别测定阿魏酸酯酶酶和纤维素酶活力，研究酶促反应最适温度。以酶在最适温度下所测酶活为100%，其它温度下所测为对其相对酶活。结果如图1所示，阿魏酸酯酶和纤维素酶随温度上升酶的变化趋势基本相同。从20℃到65℃阿魏酸酯酶，随着温度升高酶活性逐渐增加，温度达到65℃时，酶活达到最大值。以后随着温度升高，酶活逐渐降低，故酶的阿魏酸酯酶最适作用温度为65℃。而纤维素酶的温度分界点是55℃，即纤维素酶的最适合作用温度是55℃。整体看两种酶都是高温酶，在45℃-70℃之间两种酶的酶活都在80%以上，故在这个温度范围内复合酶制剂都会发挥高效的酶解作用。
2. 酶作用最适pH测定
酶制剂在不同pH(3.0～9.0)下进行酶促反应，测定阿魏酸酯酶和纤维素酶最适作用pH。所用缓冲液为：pH2.0～3.0的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，pH3.0～4.0柠檬酸磷酸缓冲液，pH4.0～5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.0～7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，pH7.0～9.0 Tris-HCl缓冲溶液。以酶在最适pH值下所测酶活为100%，其它pH值下所测为对其相对酶活。酶制剂在以上不同pH缓冲体系中，分别在65℃和55℃下测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活性，结果如图2所示，阿魏酸酯酶在pH3.5～7.0之间酶活性在80%以上，最适作用pH为4.5。纤维素酶在pH4.5-7.0之间所测酶活均在90%以上，最适酶活5.5。整体看酶制剂两种酶在pH4.5-7.0之间酶活性都在80%以上，故酶制剂适合在酸性条件下酶解反应。
3. 酶的热稳定性实验
将溶于pH6.5磷酸缓冲液的酶制剂在40℃-80℃的不同温度下保温4h后，立即冰浴，适度稀释后，分别测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活力。以酶在最稳定温度下所测酶活为100%，其它温度下所测为对其相对酶活。结果见图3所示，两种酶基本随温度的上升酶活力逐渐降低，在温度高于60℃时，阿魏酸酯酶酶活性下降显著。两种酶在60℃以下，酶活保存率都在80%以上；55℃以下，剩余酶活都在90%以上。复合酶制剂是耐高温型。
4. pH值对酶稳定性的影响
酶制剂在不同pH的缓冲液中，分别于40℃保温24h，然后分别测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活力，以酶在最稳定pH下所测酶活为100%，其它pH下所测为对其相对酶活。结果见图4所示，40℃，pH3.0-8.0范围内24h阿魏酸酯酶酶活性基本不发生变化，活性稳定，相对酶活均在95%以上。纤维素酶在pH4.0-9.0之间酶活性基本没有下降。整体看复合酶制剂具有较广的酸碱稳定性，在酸性条件下性质更为稳定。
5. 酶制剂的保存时间对酶活性的影响
将制备好的固体酶制剂分别在4℃和室温下保存，每一个月检测一次酶活力，共检测6个月，查看酶活保留情况。结果如下表所示：
在半年时间内，4℃下阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活保存率都在90%以上，室温条件下酶活也在80%以上，可以看出酶的稳定性好。
序列表
<110> 徐州工程学院
<120> 一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法
<130> 001
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 631
<212> DNA
<213> 深绿木霉（Trichoderma atroviride）
<400> 1
tcatttagag gaagtaaaag tcgtaacaag gtctccgttg gtgaaccagc ggagggatca 60
ttaccgagtt tacaactccc aaacccaatg tgaaccatac caaactgttg cctcggcggg 120
gtcacgcccc gggtgcgtcg cagccccgga accaggcgcc cgccggaggg accaaccaaa 180
ctcttttctg tagtcccatc gcggacgtta tttcttacag ctctgagcaa aaattcaaaa 240
tgaatcaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa 300
atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt 360
gcgcccgcca gtattctggc gggcatgcct gtccgagcgt catttcaacc ctcgaacccc 420
tccggggggt cggcgttggg gacctcggga gcccctaaga cgggatcccg gccccgaaat 480
acagtggcgg tctcgccgca gcctctcctg cgcagtagtt tgcacaactc gcaccgggag 540
cgcggcgcgt ccacgtccgt aaaacaccca acttctgaaa tgttgacctc ggatcaggta 600
ggaatacccg ctgcacttaa gcatatcact a 631
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 2
ccgtaggtga acctgcgg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (5)

1.一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，发酵菌种的准备：将深绿木霉（Trichoderma atroviride）AWS26菌种在PDA活化培养基上划线活化，置于37-40℃恒温培养箱中培养48-72h，得活化菌种，所述深绿木霉（Trichoderma atroviride）AWS26已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 8673；
步骤2，制备深绿木霉孢子悬液：从步骤1活化好的菌种中刮取深绿木霉菌丝，转移至深绿木霉孢子培养基上，置于37-40℃生化培养箱内培养培养72h至菌丝长出孢子，经两次传代培养恢复其活力，以含有0.01%吐温80的无菌水洗涤收集孢子，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液；
步骤3，复合酶摇瓶液体发酵：将步骤2所得孢子悬液，以4-8v/v%接种量接入装有100-150mL摇瓶发酵培养基一的三角瓶中，40-42℃摇床发酵18-24h，摇床转速160-200r/min；然后将灭好菌的摇瓶发酵培养基二100-150mL倒入以上发酵18-24h后的三角瓶中，发酵温度降至35-37℃，继续震荡发酵培养，发酵时间达到40-48h时，温度降至30-35h，继续发酵24-48h，发酵终止，得混合酶发酵液；
步骤4，复合酶制剂的制备：取步骤3所得混合酶发酵液，过滤后将滤液8000r/min、离心20min，取上清液，经超滤膜浓缩两次，浓缩液在50-60℃条件下真空浓缩，在所得粗酶液中加入保护剂2-3wt%的糊精、1-3wt%的可溶性淀粉、0.1-0.2wt%的山梨酸钾，搅拌分散后，-20℃冷冻8-10h，真空度30-40Pa、温度-35℃下，冷冻15-18h，即得复合酶制剂。
2.根据权利要求1所述的深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤1中所述PDA活化培养基的配方为：土豆浸出液100mL，无机盐液1mL，蔗糖2g，琼脂粉1.5g，pH5.0-6.0，121℃灭菌15min。
3.根据权利要求1所述的深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤2中所述深绿木霉孢子培养基的配方为：土豆浸出液50mL，麸皮浸出液50mL，蔗糖1g，琼脂粉1.5g，pH5.0-6.0，121℃灭菌15min；其中，土豆浸出液：土豆削皮切成1cm3小块，称取200g，加入1000mL水，煮沸30min，过滤，定容到1000mL；麸皮浸出液：50g麸皮加入300mL水，煮沸30min，过滤，定容到200mL。
4.根据权利要求1所述的深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤3中所述摇瓶发酵培养基一的配方为：蛋白胨0.5g、葡萄糖0.5g、硫酸铵0.5g、牛肉膏0.2-0.5g、NaCl 0.5g、KH2PO4 0. 1g、MgSO4·7H2O 0.04g、CaCl20.2-0.5g，去离子水100mL，pH6.5-6.8，121℃灭菌灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：摇瓶发酵培养基二的配方为：麸皮粉2g、花生壳粉1g、米糠粉1g、豆饼粉1-1.5g、玉米浆1g、尿素0.5g、NH4NO3 0.5g、吐温80 2g，微量元素1mL，去离子水100mL，pH6.5-6.8，121℃灭菌20min；其中，微量元素的配方为：MnCl2•4H2O 0.1g，CoCl20.05g，CuSO4 0.02g，MgSO4 0.3g，K2HPO4 1g，FeSO4•7H2O 0.1g，ZnCl2 0.03g，LiCl 0.05g，CaCl2 0.05g，H3BO3 0.01g，KI 0.5g，去离子水1000 mL。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2009127729A1 (en) * 2008-04-17 2009-10-22 Novozymes A/S Polypeptides having ferulic acid esterase activity and polynucleotides encoding same
CN101492700A (zh) * 2009-03-05 2009-07-29 王建设 一种秸秆类物质或农林废弃物精深加工的方法
CN102796673A (zh) * 2012-08-24 2012-11-28 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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一株深绿木霉的分离筛选及鉴定;李雪云 等;《造纸科学与技术》;20100215;第29卷(第1期);第61-66页 *

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