CN108660168A - 一种提高l-色氨酸产量的发酵工艺 - Google Patents

一种提高l-色氨酸产量的发酵工艺 Download PDF

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CN108660168A CN201710188351.3A CN201710188351A CN108660168A CN 108660168 A CN108660168 A CN 108660168A CN 201710188351 A CN201710188351 A CN 201710188351A CN 108660168 A CN108660168 A CN 108660168A
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林惠敏
宋乐
何强
徐鲁
夏爱坤
汪玉真
刘坤
张建斌
李亚军
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine

Abstract

本发明公开了一种提高L‑色氨酸产量的发酵工艺，该工艺包括将L‑色氨酸的生产菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中进行发酵，在发酵过程搅拌，搅拌转速为375转/分～600转/分，发酵过程中补料，至发酵结束；所述的机械搅拌发酵罐包含搅拌桨，相对标准搅拌桨的尺寸，所述的搅拌桨的尺寸：外直径尺寸增加100％～165％，桨叶的长度尺寸增加25％～150％。本发明在保证设备正常运作的前提下，来控制发酵液溶氧来提高色氨酸的产量、提高生产能力，降低生产成本。

Description

一种提高L-色氨酸产量的发酵工艺
技术领域
本发明涉及一种提高L-色氨酸产量的发酵工艺。
背景技术
L-色氨酸(L-Tryptophane)，又名α-氨基吲哚基丙酸，分子式C11H12N2O2。L-色氨酸为白色至黄白色晶体或结晶性粉末，无臭或微臭，稍有苦味。L-色氨酸对人和动物的生长发育和新陈代谢具有重要的生理作用，在食品、饲料和医药等方面有着广泛的应用。因此，L-色氨酸的生产一直受到研究者的关注。最早生产L-色氨酸的方法是化学合成法和蛋白质水解法，但这两种方法均不适用于生产。随后人们开始利用微生物法生产色氨酸。微生物法大体可分为微生物发酵法和酶促转化法，其中微生物发酵法已走向实用并且处于主导地位。
现有L-色氨酸发酵工艺：将菌种接入种子培养基(葡萄糖10g/L，酵母膏15g/L，KH2PO4 1.5g/L，(NH4)2SO4 10g/L，MgSO4 5g/L，柠檬酸钠0.5g/L，FeSO4·7H2O 100mg/L，维生素B1 1.3mg/L)中，接种量为10％；在32℃、pH6.8～7.2和溶氧为20～30％条件下于5L自动控制发酵罐中培养12～14h至对数期。按10％的接种量接入含有以上所述培养基的30L自动控制发酵罐中，初始通气量2L/min，搅拌转速500～800转/分，溶氧水平为20～30％，通过自动流加氨水控制pH在6.8～7.2，培养温度在32℃，用泡敌消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液，发酵至35h结束。发酵培养基初糖浓度10g/L，维持发酵液中残糖质量浓度为0.05～0.3g/L，溶氧20～30％，补糖速率小于1.6％，发酵时间35h，L-色氨酸为42.5g/L，乙酸含量1.4g/L，丙酮酸含量1.1g/L，苯丙氨酸2.4g/L，糖酸转化率18％。
为提高微生物发酵L-色氨酸的产量，现有的方法主要是通过培养基组分的优化和添加不同的前体来提高产量，同时通过调控溶氧、补料速率等参数以达到提高产量的目的。但是，现有工艺中控制溶氧需要确定的数值与范围小，难以精确调控。例如，现有工艺中控制溶氧水平在20～30％的范围，对于发酵罐来说，需要不间断的调节通气量和转速，工作量大。同时，搅拌转速调节达到一定程度时，也会增加设备的负荷，最终导致生产成本增加。并且，现有工艺的色氨酸产量低下。该现状亟待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的L-色氨酸产量低、通过控制溶氧水平来提高产率但设备难以精确调控最终导致设备负荷及工作量大等缺陷，提供了一种提高L-色氨酸产量的发酵工艺。本发明通过改变搅拌桨尺寸和搅拌转速，在保证设备正常运作的前提下，来控制发酵液溶氧来提高色氨酸的产量、控制菌体比生长速率、减少乙酸副产物生成、提高生产能力，降低生产成本。
本发明提供了一种提高L-色氨酸产量的发酵工艺，包括如下步骤：
将L-色氨酸的生产菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中进行发酵，在发酵过程搅拌，搅拌转速为375转/分～600转/分，发酵过程中补料，至发酵结束；其中，所述的机械搅拌发酵罐包含搅拌桨，相对标准搅拌桨的尺寸，所述的搅拌桨的尺寸：外直径尺寸增加100％～165％，桨叶的长度尺寸增加25％～150％。
本发明中，所述外直径尺寸增加100％～165％是指相对于机械搅拌发酵罐标准搅拌桨的外直径尺寸增加的百分比，较佳地为150％。
本发明中，所述桨叶的长度尺寸增加25％～150％是指相对于机械搅拌发酵罐标准搅拌桨的桨叶的长度尺寸增加的百分比，较佳地为50％。
本发明中，所述的搅拌桨的桨叶宽度可为使用的机械搅拌发酵罐标准搅拌桨的桨叶宽度，较佳地为宽度尺寸增加10％～65％，更佳地为宽度尺寸增加13％。
本发明中，所述的机械搅拌发酵罐一般可为25L的机械搅拌发酵罐，其标准搅拌桨的尺寸一般为：外直径5.55cm，桨叶长2.60cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm，在本发明中，25L的机械搅拌发酵罐，所述搅拌桨的优选尺寸如下：
桨A：外直径13.89cm，桨叶长3.87cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm；
桨B：外直径12.00cm，桨叶长4.86cm，桨叶宽2.47cm，内直径2.18cm；
桨C：外直径12.64cm，桨叶长3.24cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm；
桨D：外直径14.47cm，桨叶长6.12cm，桨叶宽3.56cm，内直径2.18cm。
本发明中，所述的搅拌桨一般是可拆卸的。
本发明中，所述的搅拌转速较佳地为400转/分～500转/分，更佳地为420转/分～460转/分。
本发明中，所述L-色氨酸的生产菌种为本领域常规使用的能够生产L-色氨酸的菌种，可为现有市售的各种菌种，例如现有的大肠杆菌(Escherichia coli)等。例如，中国工业微生物菌种保藏管理中心销售的大肠杆菌基因工程菌(Escherichia coli)CICC 20658。
本发明中，所述的L-色氨酸的生产菌种在进行发酵前均按照本领域常规方式进行菌种的活化与扩大培养，如斜面培养与种子培养。所述的斜面培养和种子培养涉及的培养物料及培养条件均为适用于相应地L-色氨酸的生产菌种的斜面培养和种子培养涉及的培养物料及培养条件。所述的基础发酵培养基可为本领域常规的用于发酵生产L-色氨酸的基础发酵培养基，一般配合使用的具体菌种。
本发明中，所述的L-色氨酸的生产菌种为大肠杆菌(Escherichia coli)时，涉及与发酵培养相关条件如下：
其中，所述的斜面培养的目的本领域技术人员均知是活化生产菌株，所用的培养基为斜面培养基。
其中，所述的斜面培养基较佳地为：每升含胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，pH7.0～7.2，在使用前一般都常规灭菌操作，如进行121℃灭菌15min。
其中，所述的斜面培养的培养条件较佳地为：温度35.0℃，培养周期24h。
其中，所述的种子培养的目的本领域技术人员均知是扩大培养，所用的培养基为种子培养基。
其中，所述的种子培养基较佳地为：每升含葡萄糖30.0g，酵母浸出粉1.5g，(NH4)2HPO4 2.5g，KCl 1.5g，MgSO4 1.6g，柠檬酸钠1.6g，(NH4)2SO4 1.2g，FeSO4·7H2O 2.8mg，MnSO4·H2O 1.2mg，维生素B1 1.3mg，生物素0.3mg，pH6.8～7.1，在使用前一般都常规灭菌操作，如进行121℃灭菌20min。
其中，所述的种子培养的培养条件较佳地为：温度36℃，培养周期10～12h，pH6.8～7.1。
其中，所述的基础发酵培养基可为本领域常规的适用于大肠杆菌(Escherichiacoli)发酵生产L-色氨酸的基础发酵培养基；较佳地，所述的基础发酵培养基中的氮源为质量比7：5的酵母粉和蛋白胨；所述的基础发酵培养基较佳地还包含0.5g/L的乙酸锌。
其中，所述的基础发酵培养基较佳地为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO4 4.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4·7H2O75.6mg，MnSO4·H2O 4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2·6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前一般都常规灭菌操作，如进行121℃灭菌20min。
其中，所述的基础发酵培养基的培养条件较佳地为：温度35.0℃，培养周期34h～36h，pH6.8～7.1。
其中，所述的机械搅拌发酵罐为本领域常规使用的发酵罐，较佳地为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，所述机械搅拌发酵罐中基础培养基装量通常为10L。
其中，所述的补料为本领域技术人员均知的补料，属于本领域常规操作，目的在于维持发酵体系中葡萄糖的浓度，一般在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，较佳地采用蠕动泵自动定量流加技术，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：8g/L～11g/L，1h～2h：14g/L～16g/L，2h～3h：18g/L～21g/L，3h～36h：22g/L～30g/L；同时为控制pH6.8～7.1，也通过蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的微生物发酵法生产L-色氨酸在保证设备正常运作(不超负荷运行)的前提下，通过改变搅拌桨尺寸和搅拌转速，提高了色氨酸的产量、控制菌体比生长速率、减少乙酸副产物生成、缩短发酵的周期、提高生产能力，降低生产成本。
附图说明
图1为本发明对比例4～6中不同转速对溶氧浓度的影响。
图2为本发明对比例4～6中不同转速对菌浓的影响。
图3为本发明对比例4～6中不同转速对乙酸生成量的影响。
图4为本发明对比例4～6中不同转速对细胞质粒稳定性的影响。
图5为本发明对比例4～6中不同转速对L-色氨酸产量的影响。
图6为本发明对比例7和实施例1～2中不同搅拌桨大小对溶氧的影响。
图7为本发明对比例7和实施例1～2中不同搅拌桨大小对菌浓的影响。
图8为本发明对比例7和实施例1～2中不同搅拌桨大小对乙酸生成量的影响。
图9为本发明对比例7和实施例1～2中不同搅拌桨大小对细胞质粒稳定性的影响。
图10为本发明对比例7和实施例1～2中不同搅拌桨大小对L-色氨酸产量的影响。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
L-色氨酸的生产菌种的培养方法可为本领域常规的通常培养方法，下述实施例中，为将大肠杆菌基因工程菌(Escherichia coli，中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC 20658)菌种接入斜面培养基中在35℃培养24h；之后接种入种子培养基中在36℃、pH6.8～7.1条件下培养10～12h。
其中，斜面培养基每升含胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，pH7.0～7.2，在使用前进行121℃灭菌15min。
其中，种子培养基每升含葡萄糖30.0g，酵母浸出粉1.5g，(NH4)2HPO4 2.5g，KCl1.5g，MgSO4 1.6g，柠檬酸钠1.6g，(NH4)2SO4 1.2g，FeSO4·7H2O 2.8mg，MnSO4·H2O 1.2mg，维生素B1 1.3mg，生物素0.3mg，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
对比例1
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为该发酵罐本身包含的标准桨，标准桨的尺寸为：外直径5.55cm，桨叶长2.60cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.12g，(NH4)2HPO4 4.0g，KCl5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4·7H2O 75.6mg，MnSO4.H2O 4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2·6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：10.32g/L，1h～2h：14.23g/L，2h～3h：19.67g/L，3h～36h：23.68g/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于71％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至400转/分。发酵单位为36g/L。
对比例2
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为该发酵罐本身包含的标准桨，标准桨的尺寸为：外直径5.55cm，桨叶长2.60cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4.7H2O 75.6mg，MnSO4.H2O4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2.6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：10.52g/L，1h～2h：15.39g/L，2h～3h：19.83g/L，3h～36h：29.54g/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于69％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至400转/分。发酵单位为43.2g/L。
对比例3
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为该发酵罐本身包含的标准桨，标准桨的尺寸为：外直径5.55cm，桨叶长2.60cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4.7H2O 75.6mg，MnSO4.H2O 4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2.6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：10.29g/L，1h～2h：14.79g/L，2h～3h：18.75g/L，3h～36h：28.34g/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于59％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至400转/分。发酵单位为45.36g/L。
由对比例1～3可知，当所述的基础发酵培养基中的氮源为质量比7：5的酵母粉和蛋白胨的复合氮源，并且包含0.5g/L的乙酸锌时，最终得到的发酵单位最大，更有利于提高发酵过程中生产的色氨酸的产量。
对比例4
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为该发酵罐本身包含的标准桨，标准桨的尺寸为：外直径5.55cm，桨叶长2.60cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4·7H2O 75.6mg，MnSO4·H2O 4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2·6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：9.85g/L，1h～2h：14.97g/L，2h～3h：20.53/L，3h～36h：28.39/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于58％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至400转/分。
对比例5
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为该发酵罐本身包含的标准桨，标准桨的尺寸为：外直径5.55cm，桨叶长2.60cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4·7H2O 75.6mg，MnSO4·H2O 4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2·6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：9.85g/L，1h～2h：14.97g/L，2h～3h：20.53/L，3h～36h：28.39/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于60％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至500转/分。
对比例6
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为该发酵罐本身包含的标准桨，标准桨的尺寸为：外直径5.55cm，桨叶长2.60cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4.7H2O 75.6mg，MnSO4.H2O4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2.6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：9.85g/L，1h～2h：14.97g/L，2h～3h：20.53/L，3h～36h：28.39/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于62％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至600转/分。
对比例7
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为该发酵罐本身包含的标准桨，标准桨的尺寸为：外直径5.55cm，桨叶长2.60cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4·7H2O 75.6mg，MnSO4·H2O 4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2·6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：9.85g/L，1h～2h：14.97g/L，2h～3h：20.53/L，3h～36h：28.39/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于58％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至600转/分。
实施例1
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为桨A，其尺寸为：外直径13.89cm，桨叶长3.87cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4.7H2O 75.6mg，MnSO4.H2O4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2.6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：9.85g/L，1h～2h：14.97g/L，2h～3h：20.53/L，3h～36h：28.39/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于65％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至460转/分。
实施例2
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为桨B，其尺寸为：外直径12.00cm，桨叶长4.86cm，桨叶宽2.47cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4.7H2O 75.6mg，MnSO4.H2O4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2.6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：9.85g/L，1h～2h：14.97g/L，2h～3h：20.53/L，3h～36h：28.39/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于62％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至400转/分。
实施例3
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为桨C，其尺寸为：外直径12.64cm，桨叶长3.24cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4·7H2O 75.6mg，MnSO4·H2O 4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2·6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：9.66g/L，1h～2h：14.08g/L，2h～3h：20.19g/L，3h～36h：29.38/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于53％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至420转/分。
实施例4
将上述经过斜面培养以及种子培养基培养后的菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中，在发酵过程中用包含桨叶的搅拌桨进行搅拌，并进行补料，至发酵结束。
其中，发酵罐为BMR-B系列机械搅拌发酵罐(上海敖中生物工程设备有限公司)，容积为25L，基础培养基装量为10L，搅拌桨为桨D，其尺寸为：桨D：外直径14.47cm，桨叶长6.12cm，桨叶宽3.56cm，内直径2.18cm。
基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO44.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4.7H2O 75.6mg，MnSO4.H2O4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2.6H2O 4.0mg，CuSO4·5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min。
补料过程采用蠕动泵自动定量流加技术，在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：10g/L，1h～2h：14.18g/L，2h～3h：21.19g/L，3h～36h：28.38/L。蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
在发酵开始至发酵液中还原糖残留量低于0.05g/100mL之前，调整转速使溶氧浓度大于63％。当发酵液残糖低于0.05g/100mL时开始流加葡萄糖，控制发酵液还原糖残留量在0.01～0.05g/100mL之间。开始流加葡萄糖后将发酵罐转速调至375转/分。
效果实施例1
测定对比例4～7以及实施例1～2的溶氧浓度、菌体生长速率、乙酸生成量、质粒稳定性和色氨酸产量。所述溶氧浓度通过溶氧曲线与测定的发酵单位来确定适宜的浓度；所述菌体生长速率通过菌体浓度OD的测量来测定；所述色氨酸产量通过HPLC法测定。
具体测试方法如下：
发酵单位测定：HPLC法，色谱条件：色谱柱C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：水(0.03％KH2PO4)-甲醇(80：20)；流速1.0mL/min；柱温40℃；检测波长278nm；进样量2μL。
乙酸的测定：HPLC法，色谱条件：色谱柱ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：0.5％KH2PO4水溶液(用85％H3PO4调至pH2.7)-已腈(93：13)；流速0.8mL/min；柱温45℃；检测波长210nm；进样量2.5μL。其中，高效液相色谱仪为1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。
菌体浓度OD的测量：可见分光光度计法，波长660nm。其中，可见分光光度计购自上海元析仪器有限公司。
菌丝形态检查：美蓝染色法，光学显微镜观察法。
游离氨基氮的检测：甲醛氧化测定法。
还原糖的检测：生物传感仪测定。其中，生物传感仪为SBA-40D生物传感仪(山东省科学院生物研究所)。
质粒丢失率的测定：无菌条件下取不同发酵时间菌液lmL用无菌水逐级稀释，取三个合适的梯度，涂在非选择性固体培养基平板上，倒置在37℃培养箱中培养24h，随机挑取在非选择性培养基上生长的菌落200～300个，分别点种在对应的选择性培养基和非选择性培养基平板上，倒置在37℃培养箱中培养24h，观察两种平板中菌体生长情况，计算两种平板上生长的菌数比例，由于缺失质粒的菌在含有四环素的培养基上不能生长，因此，将选择性培养基中的菌落数与非选择性培养基中菌落数进行比较，即可计算出质粒的丢失率。
对比例4～6的测试结果见表1～5(见图1～5)，对比例7与实施例1～2的测试结果见表6～10(见图6～10)，实施例3～4的测试结果见表11～15。
表1对比例4～6不同转速对溶氧浓度的影响
表2对比例4～6不同转速对菌浓的影响
表3对比例4～6不同转速对乙酸含量的影响
表4对比例4～6不同转速对质粒丢失率的影响
表5对比例4～6不同转速对色氨酸含量的影响
对比例4～6描述了不同搅拌转速对发酵的影响。由表1～5(图1～5)结果可以看出，在L-色氨酸发酵前期，产生菌处于对数生长阶段，对溶氧需求大，当发酵罐搅拌转速越高，溶氧值越大，菌体生长越快，L-色氨酸的合成速度也越快，相反，搅拌转速越低，菌体对数生长期的溶氧值也越低，而过低的溶氧浓度则导致乙酸的大量生成，使菌体生长受到抑制，比生长速率下降，菌体质粒大量丢失，到发酵后期菌体过早发生自溶，严重影响L-色氨酸的合成。
通过上述研究可以看出在菌体浓度快速增长阶段，维持发酵液溶氧低于50％时不利于菌体浓度的增加和L-色氨酸的合成。
对比例7与实施例1～4中，通过分别调整搅拌转速(标准桨转速600转/分，桨A460转/分，桨B500转/分，桨C420转/分，桨D375转/分)使发酵过程溶氧浓度大于50％，考察不同尺寸的搅拌桨对L-色氨酸发酵过程中溶氧浓度、菌体生长速率、乙酸生成量、质粒稳定性和色氨酸产量的影响。测试结果见表6～10(图6～10)和表11～15。
表6对比例7与实施例1～2不同搅拌桨大小对溶氧的影响
表7对比例7与实施例1～2不同搅拌桨大小对菌浓的影响
表8对比例7与实施例1～2不同搅拌桨大小对乙酸含量的影响
表9对比例7与实施例1～2不同搅拌桨大小对质粒丢失率的影响
表10对比例7与实施例1～2不同搅拌桨大小对色氨酸产量的影响
表11实施例3～4不同搅拌桨大小对溶氧的影响
表12实施例3～4不同搅拌桨大小对菌浓的影响
表13实施例3～4不同搅拌桨大小对乙酸含量的影响
表14实施例3～4不同搅拌桨大小对质粒丢失率的影响
表15实施例3～4不同搅拌桨大小对色氨酸产量的影响
表7显示采用桨B的发酵罐在L-色氨酸发酵前期由于溶氧水平最高，使得菌体过快生长，但是由于产生菌质粒复制跟不上菌体繁殖，因此表8～10显示繁殖出的菌体有相当一部分是质粒缺失的，而缺少质粒的大肠杆菌在代谢过程产生了大量的乙酸，同时在溶氧水平较高的条件下，当菌体生长速率过快，三羧酸循环达到饱和时，也会引起发酵培养基中乙酸的积累。细菌在低比生长速率条件下通过氧化代谢作用产生的能量足以满足合成和异化作用的需求，不会产生乙酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH2。而乙酸的大量生成和积累抑制菌体的进一步繁殖和L-色氨酸的合成，但总体来说基本实现了本发明的效果。
采用桨A的发酵罐在发酵前期在保持适当比生长速率的同时提供合适的溶氧浓度，使得产生菌在对数生长期保持较高比生长速率且乙酸较少积累，细胞质粒稳定性较高，在整个发酵过程一直维持L-色氨酸较高涨幅，使得发酵周期36小时的产酸水平达到61g/L。因此维持合适水平的溶氧浓度，不仅有利于菌体生长，还有利于L-色氨酸产量的提高，属于最佳的方案。
本发明从搅拌转速和搅拌桨的大小调整来控制发酵液的溶氧浓度，当采用最佳方案桨A，且在开始补加葡萄糖后维持转速460转/分，使发酵液溶氧浓度维持在一个合适水平，大大较少了副产物乙酸的生成和细胞质粒的丢失，增加了中后期菌体比生长速率和L-色氨酸的积累，使发酵色氨酸产量达到61.0g/L，对工业化发酵生产L-色氨酸具有一定的指导意义。

Claims (10)

1.一种提高L-色氨酸产量的发酵工艺，其特征在于，其包括如下步骤：将L-色氨酸的生产菌种置于含有基础发酵培养基的机械搅拌发酵罐中进行发酵，在发酵过程搅拌，搅拌转速为375转/分～600转/分，发酵过程中补料，至发酵结束；所述的机械搅拌发酵罐包含搅拌桨，相对标准搅拌桨的尺寸，所述的搅拌桨的尺寸：外直径尺寸增加100％～165％，桨叶的长度尺寸增加25％～150％。
2.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述外直径尺寸增加150％；
和/或，所述桨叶的长度尺寸增加50％；
和/或，所述的搅拌桨的桨叶宽度为宽度尺寸增加10％～65％，较佳地为宽度尺寸增加13％。
3.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的机械搅拌发酵罐为25L的机械搅拌发酵罐，搅拌桨的尺寸如下述任一：
桨A：外直径13.89cm，桨叶长3.87cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm；
桨B：外直径12.00cm，桨叶长4.86cm，桨叶宽2.47cm，内直径2.18cm；
桨C：外直径12.64cm，桨叶长3.24cm，桨叶宽2.19cm，内直径2.18cm；
桨D：外直径14.47cm，桨叶长6.12cm，桨叶宽3.56cm，内直径2.18cm。
4.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的搅拌桨是可拆卸的；
和/或，所述的搅拌转速为400转/分～500转/分，较佳地为420转/分～460转/分。
5.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述L-色氨酸的生产菌种为大肠杆菌(Escherichia coli)，较佳地为中国工业微生物菌种保藏管理中心销售的大肠杆菌基因工程菌(Escherichia coli)CICC 20658。
6.如权利要求5所述的发酵工艺，其特征在于，所述的L-色氨酸的生产菌种在进行发酵前进行菌种的斜面培养与种子培养；
所述的斜面培养所用的培养基为斜面培养基；
所述的斜面培养基为：每升含胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，pH7.0～7.2，在使用前进行121℃灭菌15min；
所述的斜面培养的培养条件为：温度35.0℃，培养周期24h；
所述的种子培养所用的培养基为种子培养基；
所述的种子培养基为：每升含葡萄糖30.0g，酵母浸出粉1.5g，(NH4)2HPO4 2.5g，KCl1.5g，MgSO4 1.6g，柠檬酸钠1.6g，(NH4)2SO4 1.2g，FeSO4.7H2O 2.8mg，MnSO4.H2O 1.2mg，维生素B1 1.3mg，生物素0.3mg，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min；
所述的种子培养的培养条件为：温度36℃，培养周期10～12h，pH6.8～7.1。
7.如权利要求5所述的发酵工艺，其特征在于，所述的L-色氨酸的生产菌种的基础发酵培养基中的氮源为质量比7：5的酵母粉和蛋白胨；所述的基础发酵培养基较佳地还包含0.5g/L的乙酸锌。
8.如权利要求7所述的发酵工艺，其特征在于，所述的基础发酵培养基为：每升含葡萄糖8.0g，酵母粉0.7g，蛋白胨0.5g，(NH4)2HPO4 4.0g，KCl 5.0g，MgSO4 2.0g，柠檬酸钠2.0g，(NH4)2SO4 1.6g，FeSO4.7H2O 75.6mg，MnSO4.H2O 4.5mg，ZnSO4 6.4mg，CoCl2.6H2O 4.0mg，CuSO4.5H2O 0.6mg，乙酸锌0.5g，pH6.8～7.1，在使用前进行121℃灭菌20min；
和/或，所述的基础发酵培养基的培养条件为：温度35.0℃，培养周期34h～36h，pH6.8～7.1。
9.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的机械搅拌发酵罐为上海敖中生物工程设备有限公司的BMR-B系列机械搅拌发酵罐；所述的机械搅拌发酵罐中基础培养基装量为10L。
10.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的补料在发酵开始后待发酵液中葡萄糖浓度低于0.05g/100mL后开始流加55.0wt％的葡萄糖溶液，较佳地采用蠕动泵自动定量流加技术，每小时流加葡萄糖溶液量与发酵液体积比为：0h～1h：8g/L～11g/L，1h～2h：14g/L～16g/L，2h～3h：18g/L～21g/L，3h～36h：22g/L～30g/L；同时为控制pH6.8～7.1，也通过蠕动泵流加氨水自动控制pH6.8～7.1。
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