CN101775430A - 一种发酵过程优化与放大的方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对生物反应器进行过程优化和数据放大的方法，所述方法包括：(a)测定所述生物反应器装置的所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；其中所述生理代谢参数选自：溶氧、摄氧率、呼吸商、体积氧传递系数或其组合；(b)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较；选出与所述预定值最为接近的生物反应器装置；确定优化的放大生物反应器装置；其中所述生理代谢参数如步骤(a)所述。

Description

一种发酵过程优化与放大的方法与装置

技术领域

本发明涉及一种发酵过程优化与放大的方法及其装置，尤其是涉及一种头孢菌素C发酵过程优化与放大的方法与装置。

背景技术

为了使小型发酵试验所获得的规律和数据能在大生产中再现，就要掌握和运用放大技术。现有技术中一般采用相似原理进行比拟放大。具体地，现有技术中比拟放大的基本方法是：首先必须找出表征此系统的各种参数，将它们组成几个具有一定物理含义的无因次数，并建立它们之间的函数式，然后用实验的方法在试验设备里求得此函数式中所包含的常数和指数，则此关系式便可用作与此试验设备几何相似的大型设备的设计。

所有放大原则的目的都在于从大量的试验材料中把握和找出影响生产过程的主要矛盾，从而使得大型设备的规律和数据在小型发酵试验所获得的规律和数据能在大生产中再现。目前通用的放大准则包括：

(1)几何相似：其函数式如下式(I)

D₂/D₁＝D_i2/D_i1＝(V₂/V₁)^1/3    式(I)

D-------------反应器直径

D_i-------------搅拌器直径

V--------------反应器的装料容积

(2)恒定等体积功率放大由Pg/V恒定而确定搅拌转速。

(3)恒定传氧系数kLa放大

(4)恒定剪切力恒定叶端速度放大剪切力与搅拌桨叶端速度成正比，在恒定体积功率放大时一般维持n³d²不变(n为搅拌桨转速、d为搅拌桨直径)

(5)恒定的混合时间tM放大等。

在应用上述放大原则(或准则)的放大过程中，本领域技术人员可以通过有限的试验建立类似式(I)的函数式，这些函数式属于现有技术，在此不作详述。

但是上述现有的放大准则的不足之处在于，其都是基于细胞外的参数检测为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法，没有着眼于基于细胞代谢物质流分布变化的有关现象特征参数。在放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似，当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，会导致量变引起质变，从而造成整个发酵过程的失败。因此，本领域缺乏基于生理代谢参数的放大原则及其方法。

在生物反应器中通过培养顶头孢霉菌(Cephalosporium Acremonium)生产头孢菌素C是一个极其复杂的生物过程，产物头孢菌素C是细胞代谢的综合结果，而对生物过程而言存在着物质流、能量流、信息流的传递，与传统意义上的化学反应过程之间有很大的差别，发酵过程中各个参数之间具有很大的时空离散性和非线性关系。通过对顶头孢霉菌发酵过程中表征细胞宏观代谢的多参数相关分析，抓住问题的实质、进行有的放矢的工艺优化与放大调控一直是人们研究的热点。

综上所述，本领域缺乏有头孢菌素C发酵过程优化与放大的方法，及其头孢菌素C发酵用的工业规模的生物反应器。

因此，本领域迫切需要开发头孢菌素C发酵过程优化与放大的方法，及其头孢菌素C发酵用的工业规模的生物反应器。

发明内容

本发明的第一目的在于获得可用于头孢菌素C发酵过程优化与放大的方法。

本发明的第二目的在于获得可用于头孢菌素C的发酵过程优化与放大的工业规模的生物反应器。

在本发明的第一方面，提供了一种对生物反应器进行过程优化和数据放大的方法，所述方法包括：

(a)测定所述生物反应器装置的所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；

其中所述生理代谢参数选自：溶氧、摄氧率、呼吸商、体积氧传递系数或其组合；

(b)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较和调节；选出与所述预定值最为接近的生物反应器装置；确定优化的放大生物反应器装置；

其中所述生理代谢参数如步骤(a)所述。

在本发明的一个具体实施方式中，所述生物反应器装置选自头孢菌素C发酵装置。

在本发明的一个具体实施方式中，在调节所需的所述生物反应器装置的生理代谢参数时，包括如下分步骤：

采用CFD流体计算力学装置对所述生物反应器装置的流场进行模拟，得到流场分布图、空气体积分布图或其组合；

根据所述流场分布图、空气体积分布图或其组合，确定流场对所述生物反应器装置的生理代谢参数的影响；

调节所述生物反应器装置的流场，对比调节前后的生理代谢参数的变化，从而确定得到过程优化和数据放大的生物反应器装置。

在本发明的一个具体实施方式中，调节所述生物反应器装置的流场时，采用改变搅拌桨形式、改变搅拌桨直径的方法或其组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述生物反应器装置的容积为20--2000m³。

具体地，所述生物反应器装置相对于预定值生物反应器装置的放大倍数在20～2000倍之间。

在本发明的一个具体实施方式中，在获得预定值的生理代谢参数时，包括如下步骤：

检测用于获得预定值的生物反应器装置的多个工艺控制参数，所述多个工艺控制参数为搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂；

用过程分析计算机软件对检测得到的多个工艺控制参数进行计算，得到预定值生理代谢参数的函数图；

对所述预定值生理代谢参数的函数图进行分析，确定预定值生理代谢参数对所述用于获得预定值的生物反应器装置中的代谢的影响；

调节所述用于获得预定值的生物反应器装置的生理代谢参数，对比调节前后的代谢变化，从而确定得到所述生物反应器装置中的优化的预定值生理代谢参数。

本发明的第二方面提供一种可进行过程优化和数据放大的自控生物反应器装置，所述自控生物反应器装置包括带有搅拌器的生物反应器罐体，以及对所述生物反应器的工艺控制参数进行检测及控制的仪器仪表，所述罐体上设置：

-传感装置单元，所述传感装置单元包括设置在所述罐体上的溶解氧传感器、活细胞量传感器；

-与所述传感装置单元连接的生理代谢参数计算装置，所述生理代谢参数计算装置将所述传感装置单元获得的工艺控制参数转化为作为数据放大基础的生理代谢参数。

在本发明的一个具体实施方式中，所述装置还包括CFD流体计算力学装置。

在本发明的一个具体实施方式中，所述罐体的体积容量在20--2000m³之间。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的传感单元还包括温度传感器，pH传感器，全罐秤量传感器，尾气CO₂接口，尾气O₂接口，测速传感器，压力传感器，消泡传感器或其组合。

附图说明

图1为实施例1中发酵过程中DO与OUR的特征性关系(Characteristicrelationship between DO and OUR in the fermentation process)

所述“Titer”为发酵单位，以45000U/ml作为100％的单位。

图2为实施例1中碳源基质转换所引起的参数变化(Parameter changesresulted from the shift of carbon sources utilization)

图3为实施例1中小试和工业规模发酵罐各种细胞生理代谢参数的实时变化趋势对照图(The change tendencies of real time physiological parameters between lab scale and industrial scale fermenters)

图4为实施例1中多批次小试与工业规模发酵罐pH与RQ变化趋势图(Profi les of pH and RQ from lab scale fermenter and industrial fermenter)

图5为实施例1中罐内流场分布轴面图(通气量A：0.5vvm，B：1.2vvm)(Simulated flow field in a vertical plane of160m³fermentor)

图6为实施例1罐内空气体积分布的轴面图(通气量A：0.5vvm，B：1.2vvm)(Simulated air volume fraction in a vertical plane of 160m³fermentor)

图7为实施例1中改造后发酵罐桨型与空气体积分布轴面模拟图(Theimpeller combinations and simulated air volume fraction in a verticalplane of 160m³ fermentor after alteration)

图8为实施例1中搅拌桨长度改变前后头孢菌素C发酵过程曲线，(F为改造前(Former)，L为改造后(Latter))(The process paramteters ofcephalosporin fermentation before and after the change of the impellerlengths)

图9为实施例2的自控生物反应器装置的示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过改进制备工艺，获得了在以代谢流分析与控制为核心的发酵过程参数调整的研究方法基础上，获得了一种能够将实验室规模的优化条件放大到工业规模的方法。在此基础上完成了本发明。在本发明的一个具体实施方式中，借助于能实现发酵过程宏观代谢特征参数检测的生物反应器及其相关计算机软、硬件技术，对头孢菌素C发酵过程的代谢特性进行了研究，了解了其高耗氧特性及补加豆油等对发酵代谢特性的影响及控制策略；另一方面通过利用计算流体力学软件，对反应器中的流场特性进行了研究，对照小试研究和工业规模发酵罐的宏观代谢特征参数，发现了工业规模发酵罐中的混合与传递缺陷，并采取相应措施实现了发酵过程的放大。

本发明是基于如下原理而提出的：以工业生产为目的的生物系统的功能取决于外界环境刺激与胞内功能基因的共同作用。这种外界环境对细胞功能的影响主要通过以下几种途径，其一，外界条件(如温度、pH)对菌体细胞内酶的作用或代谢速率直接产生影响；其二，由于反应器混合传递所引起的基质(如氧、各种碳源)供应不足或过量，由此产生的胞内代谢的变化；其三，细胞的信号传导系统对外界环境条件的响应，引起细胞转录表达系统的变化，由此进而引起细胞代谢网络的变化。这就要求我们要在综合考虑胞外环境及菌体生理特性的基础上进行工业生物过程的优化与放大，而实际工业生产中多为液态培养，因而菌体的外部环境的研究即归结为生物反应器内流体力学研究，由此得到不同条件下的温度场、浓度场、剪切力场等；细胞的行为则通过菌体生理特性来表达。通过将两者整合起来研究其相互作用规律从而为生物反应器的优化与放大开辟一条崭新的科学思路。

根据上述原理，本发明设计了以下进行流程放大和优化的具体路线：在发酵过程放大研究时，提出了首先在以代谢流分析与控制为核心的发酵实验装置上进行研究，由此可得到用于过程放大的状态参数或生理参数，只要我们在放大的设备上得到完全(或基本)相同的反映代谢流等生理数据变化曲线，就可以较好地克服上述放大过程中的问题，因而提出了发酵过程参数调整的放大技术。

以下对本发明的各个方面进行详述：

(一)进行过程优化和数据放大的方法

本发明首先涉及一种对生物反应器装置进行过程优化和数据放大的方法，所述方法包括：

(a)测定所述生物反应器装置的所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；

其中所述生理代谢参数选自：溶氧、摄氧率、呼吸商、体积氧传递系数或其组合；

(b)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较和调节；选出与所述预定值最为接近的生物反应器装置；确定优化的放大生物反应器装置；

其中所述生理代谢参数如步骤(a)所述。

如本发明所述，所述“生物反应器装置”包括但不限于：发酵罐、动物细胞反应器、或植物细胞反应器。优选地，所述生物反应器装置选自头孢菌素C发酵装置。

所述方法中的“用于获得预定值的生物反应器装置”通常是指本领域常用的实验室规模或小试规模的生物反应器装置。具体地，所述“用于获得预定值的生物反应器装置”的容量在5～100升之间，例如5、10、20、30、50、100升。

在选出与所述预定值最为接近的生物反应器装置时，例如其生理代谢参数与预定值大致趋势相同，具体地例如其数值与预定值的差距不高于预定值的10～20％。

所述方法中的用于放大的“生物反应器装置”包括工业化规模的生物反应器装置。

所述用于获得预定值的生物反应器装置的“预定值”生理代谢参数可以通过本领域传统的优化方法得到，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。例如。采用正交法获得最优化的一个或多个生理代谢参数，还可以通过过程分析计算机软件对生物反应器装置的工艺控制参数进行计算而得到。

具体地，在获得关于用于获得预定值的生物反应器装置中的优化的预定值生理代谢参数的趋势时，包括如下步骤：

检测用于获得预定值的生物反应器装置的多个工艺控制参数，所述多个工艺控制参数为搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂；

用过程分析计算机软件对检测得到的多个工艺控制参数进行计算，得到预定值生理代谢参数的函数图；

对所述预定值生理代谢参数的函数图进行分析，确定预定值生理代谢参数对所述用于获得预定值的生物反应器装置中的代谢的影响；

调节所述用于获得预定值的生物反应器装置的预定值生理代谢参数，对比调节前后的代谢变化，从而确定得到用于获得预定值的生物反应器装置中的优化的预定值生理代谢参数的趋势。

更具体地，所述过程分析计算机软件选自BIOSTAR。

具体地，在调节所需的所述进行放大的生物反应器装置的生理代谢参数时，包括如下分步骤：

采用CFD流体计算力学装置对所述进行放大的生物反应器装置的流场进行模拟，得到流场分布图、空气体积分布图或其组合；

根据所述流场分布图、空气体积分布图或其组合，确定流场对所述进行放大的生物反应器装置的生理代谢参数的影响；

调节所述进行放大的生物反应器装置的流场，对比调节前后的第二生理代谢参数的变化，从而确定得到过程优化和数据放大的进行放大的生物反应器装置。

更具体地，调节所述进行放大的生物反应器装置的流场时，采用改变搅拌桨形式、改变搅拌桨直径的方法或其组合。

更具体地，在上述采用CFD流体计算力学装置对所述进行放大的生物反应器装置的流场进行模拟时，采用奈维-斯托克斯方程(NS方程)进行模拟测定，且所述湍流模型为

$\frac{\∂\mathrm{\φ}}{\∂t}+\frac{\∂\left(\mathrm{rU\φ}\right)}{r\∂r}+\frac{\∂\left(\mathrm{V\φ}\right)}{r\∂\mathrm{\θ}}+\frac{\∂\left(\mathrm{W\φ}\right)}{\∂z}=S_{\mathrm{\φ}}+\frac{\∂}{r\∂r}\left(\frac{\mathrm{r\Γ}\∂\mathrm{\φ}}{\∂r}\right)+\frac{\∂}{r\∂\mathrm{\θ}}\left(\frac{\mathrm{\Γ}\∂\mathrm{\φ}}{r\∂\mathrm{\θ}}\right)+\frac{\∂}{\∂z}\left(\frac{\mathrm{\Γ}\∂\mathrm{\φ}}{\∂z}\right)---\left(I\right);$

其中，所述φ、t、r、U、V、θ、W、z、S_φ、Γ分别代表：

φ为通用求解变量，t为时间(s)，r，θ，z分别为柱坐标系下的三个坐标，U、V、W为速度矢量在笛卡尔坐标系下的三个分量，S_φ是相对于变量φ的源项，Γ为相对于变量φ的有效湍流交换系数。

和/或

采用的流体力学计算方法为多参考坐标内外迭代滑移网格法，其计算公式根据下式(II)

τ＝μ·γ(II)

其中τ为剪切力，单位：Pa，

μ为黏度，单位：Pa·s，

γ为剪切应变率，单位：s^-1，可通过下式(III)计算得到：

$\mathrm{\γ}=\sqrt{2\{{\left(\frac{\∂u}{\∂x}\right)}^2+{\left(\frac{\∂v}{\∂y}\right)}^2+{\left(\frac{\∂w}{\∂x}\right)}^2\}+{(\frac{\∂u}{\∂y}+\frac{\∂v}{\∂x})}^2+{(\frac{\∂u}{\∂z}+\frac{\∂w}{\∂x})}^2+{(\frac{\∂v}{\∂z}+\frac{\∂w}{\∂z})}^2}---\left(\mathrm{III}\right)$

其中，x、y、z分别为直角坐标系中三个方向的坐标，u、v、w则分别为三个方向上的速度分量。

根据本领域常规技术，还可以在模拟之前，建立进行放大的生物反应器装置的流场的结构模型；对结构模型进行网格划分和设定计算区域的边界条件。

在现有技术中，对反应器的优化及其放大通常是基于单个或多个工艺控制参数(例如温度、pH等)，这些单个或多个工艺控制参数仅仅基于单一生理调控机制的研究。但是基于单一生理调控机制的研究往往只揭示了生理调控的局部和某一时段的特点，仅靠高度分支化和具体分散的研究是难以对整个发酵过程优化控制和放大起决定性作用。发明人经过大量研究，确定了放大过程中最关键的“生理代谢参数”，使得生物学与工程学相结合，并解决局部与整体、时变动态与最终结果、菌种改造与过程优化的关系。

(二)可进行过程优化和数据放大的自控生物反应器装置

本发明还提供一种可进行过程优化和数据放大的自控生物反应器装置，所述自控生物反应器装置包括带有搅拌器(104)的生物反应器罐体(100)，以及对所述生物反应器的工艺控制参数进行检测及控制的仪器仪表，所述罐体(100)上设置：

-传感装置单元(101)，所述传感装置单元(10)包括设置在所述罐体(100)上的溶解氧传感器(3)、活细胞量传感器(10)；

-与所述传感装置单元(101)连接的生理代谢参数计算装置(20)，所述生理代谢参数计算装置(20)将所述传感装置单元(101)获得的工艺控制参数转化为作为数据放大基础的生理代谢参数。

具体地，所述装置还包括CFD流体计算力学装置(也即CFD流体计算力学仿真的装置)。在一优选例中，所述生理代谢参数计算装置(20)用于与CFD流体计算力学仿真的装置进行比较，由此得到优化的生物反应器装专备设计与工艺。所述CFD流体计算力学仿真的装置用于得到生理参数预定值，所述的预定值是小罐(如5、10、20、30、50、100升)发酵条件下的传气参数、能耗参数、生理代谢参数或其组合。

具体地，所述罐体(100)的体积容量在20—2000M³之间。

具体地，所述的传感单元(101)还包括温度传感器(1)，pH传感器(2)，全罐秤量传感器(4)，尾气CO₂接口(5)，尾气O₂接口(6)，测速传感器(7)，压力传感器(8)，消泡传感器(9)或其组合。

更具体地，所述仪器仪表测定的工艺控制参数是指温度，搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂。

具体地，所述和活细胞量传感器采用四电极系统。所述四电极系统主要根据放在交变电场中的活细胞，由于细胞内的原生质体起着电解质作用，在交变电场的极化作用所形成的电容与生物量呈对应关系。改变交变电场的频率就会产生不同的极化效果，由此确定最佳的测量条件，测量的电容值通过统一信号传输到计算机数据处理，作为多参数相关分析的生物量的依据。

本发明的所述传感单元中的各种传感器可以采用本领域传统的各种传感器，只要其不对本发明的发明目的产生限制即可。

本发明的所述仪器仪表的安装位置可以按照本领域的传统工艺进行，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。)

在本发明的装置的一个具体实施方式中，采用以下技术方案：

一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，该装置由带电机和搅拌器的发酵罐体、具有多参数检测及控制的仪器仪表和传感装置的传感系统、带安装支架和工艺管道系统以及带有工控机及执行元器件的电气控制柜组成，其特征在于其中所述的传感系统包括温度传感器(1)，pH传感器(2)，溶解氧传感器(3)，全罐秤量传感器(4)，尾气CO₂接口(5)，尾气O₂接口(6)，测速传感器(7)，压力传感器(8)，消泡传感器(9)，活细胞量传感器(10)；所述的参数是指温度，搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂。

所述的带有工控机及执行元器件的电气控制柜包括；其中所述的带有工控机及执行元器件的电气控制柜包括高精度蠕动泵(11)；基质补料电子秤(12)；前体或油电子秤(13)；酸碱物电子秤(14)；循环泵(25)；电磁阀(15)；数/模转换器(18)；模/数转换器(17)；下位机(19)；上位机(20)；稀土电机(23)。

其中所述的带安装支架的工艺管道系统包括料瓶(22)；全罐秤量支座；取样用特殊支架；罐体总成；快速装拆机座；电动机；管架；油水分离器；减压阀；过滤器；流量计；空气过滤器；压力表；冷却器；管道视镜；热水器；无死体积取样阀；消泡传感器接口；尾气CO₂接口；尾气O₂接口；温度传感器；pH传感接口；DO传感器接口。

上述带安装支架的工艺管道系统、电气控制柜的各个组件及其组成方式均可以按照本领域传统的工艺进行，只要不对本发明的发明目的进行限制即可。

所述工控机及执行元器件的电气控制柜构成本发明所述的生理代谢参数计算装置(20)；其中各种组件均可以采用本领域传统的组件，只要不对本发明的发明目的即可。

具体地，所述的带有工控机及执行元器控制柜中的计算机软件是根据现场数据采集和操作的需求以及工艺优化的要求，进行在线参数采集、离线参数计算、参数数据记录以及部分参数的在线控制，通过局域网同步向上位机传送所有参数的数据，选用组态语言和C语言对上位机和下位机分别进行编程设计，并且在数据记录时使用了简单冗余技术。

更具体地，所述计算机软件采用华东理工大学国家生化工程技术研究中心(上海)的上位机软件包BIOSTAR。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

发明的有益效果是：

(1)即通过发酵过程表征细胞宏观代谢流变化的参数与其它代谢过程中的各种参数进行基于参数相关分析的优化研究，开发出了有实际意义的放大路线。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比。

除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

实施例1

1材料与方法

1.1实验菌株

顶头孢霉菌(Cephalosporium Acremonium)AC0508由山西威奇达药业有限公司提供。

1.2培养基

1.2.1摇瓶培养

斜面培养基(100ml)：麦芽汁1.2g，蛋白胨1.2g，琼脂2.2g；消前pH为7.0；

种子培养基(100ml)：玉米浆3g，乙酸胺0.4g，蔗糖2g，DL一蛋氨酸0.02g，CaCO₃0.05g；消前pH为6.5；(上、下标)

发酵培养基(100ml)：玉米浆7g，淀粉4g，淀粉酶0.03g，豆油1g，DL一蛋氨酸0.2g，KH₂PO₄0.4g，(NH4)₂SO₄0.8g，FeSO₄·7H₂O0.005g，CaCO₃1g；消前pH为6.2。

1.2.2发酵罐培养

一级种子培养基(100L)：葡萄糖1kg，蔗糖2.5kg，玉米浆1kg，豆饼粉3kg，碳酸钙0.5kg，消沫剂0.08kg，消前pH为6.0；

二级种子培养基(100L)：葡萄糖1kg，蔗糖5kg，玉米浆3kg，豆饼粉5kg，花生饼粉1kg，碳酸钙0.5kg，消沫剂0.05kg，消前pH为6.0；

发酵培养基配方(100L)：糊精5.0kg，豆油5.0kg，玉米浆3kg，豆饼粉3kg，花生饼粉2kg，蛋氨酸0.5kg，硫酸铵1.2kg，硫酸钾1.0kg，其他微量元素若干，碳酸钙0.8kg，消沫剂0.048kg，消前pH为6.0。

1.3培养方法

1.3.1摇瓶发酵

由试管斜面采用挖块法接入种子培养基，置回转式摇床(偏心距5cm)220r/min，

28℃培养88h，按20％接种量接人发酵罐，28℃发酵培养，40h后温度控制在25℃，继

续培养至157h放罐。

1.3.2发酵罐操作

一级种子罐工艺控制：0.25％的接种量，罐温30℃，空气比1：2VVM控制，培养72h左右，当pH值7.5以上，PMV大于20％时移种；

二级种子罐工艺控制：4.0％接种量，罐温30℃，空气比1：0.6VVM到1：2.0VVM，培养60h左右，当pH值7.5以上，PMV大于25％时移种；

发酵罐工艺控制：20.0％接种量，罐温前30h28℃，30-110h25℃，110h-放罐24℃，空气比：1：0.8VVM到1：1.2VVM。70小时开始补加豆油后，pH值低于5.5时通过计算机自动控制补加20％左右氨水，维持发酵液pH值在5.5。

1.4仪器与分析方法

本实验首先在具有多参数检测的全自动实验室发酵罐FUS-50L(A)(由上海国强生化工程装备有限公司提供)上进行相关研究；随后又在工业规模发酵罐上进行了相关改造，安装了用于过程分析的BIOSTAR软件包(华东理工大学国家生化工程技术研究中心(上海))，获得了与小试发酵罐相同的相关参数。小试和工业规模发酵罐系统除配备pH、溶氧(DO)、温度、转速等常规的测量控制系统外，还配备有整体称重传感器和高精度补料(基质、酸碱、消泡剂等)的测量与控制，并且实现了排气与尾气O₂、CO₂分析仪连接，整机具有14个在线参数检测和控制参数，并具有能输入实验室手工测定参数的计算机控制与数据处理软件包BIORADAR和BIOSTAR，由此可进一步精确得到发酵过程优化与放大所必需的包括各种代谢流特征或工程特征的间接参数，如摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)、呼吸商(RQ)、体积氧传递系数(KLa)等。

头孢菌素C含量的HPLC法测定：HP1100色谱系统，色谱柱：TSKgel ODS-100S4.6×250mm，10μm；流动相：20mM醋酸铵缓冲液(pH5.6)：乙腈＝94：6，流量：1.0ml/min，紫外检测波长：254nm，室温，进样量20μl。

菌体浓度测定：PMV法：取10ml发酵液，3000r/min，离心20min。

2结果与分析

2.1头孢菌素C发酵过程中高耗氧过程所引起的参数变化

首先在50L小试研究发酵罐上对顶头孢霉菌的代谢特性进行了相关研究，经过初步研究，获得了如图1所示的与顶头孢霉菌高耗氧相关的代谢特性参数图。

由图1可知：发酵初期10h以前，随着菌体生理代谢强度的增加，摄氧率OUR逐渐增加，DO逐渐下降；随后通过增加通气量、搅拌转速的调控，使DO维持在30-40％左右，直到52h，OUR达到40.2molL^-1.h^-1，达到第一个较高耗氧阶段；而在其后的90h以前OUR变化不大，但随着头孢菌素C合成的启动和菌量的不断上升，菌体代谢的基质从以葡萄糖为主转化成以豆油作为主要碳源，而较之于以葡萄糖作为基质而言，以脂肪酸作为基质时对氧的需求更大，92h开始摄氧率OUR直线上升，110h左右达到最大值57.1molL^-1.h^-1。这一阶段头孢菌素C生物合成量呈近似直线增加，其与头孢菌素C合成途径关键酶活性高相一致。头孢菌素C发酵的高耗氧特性(OUR处于较高水平)在这一时期表现最为明显，这是由于头孢菌素C生物合成过程中多个反应步骤需分子氧的参与，氧的供应(从反应器表型中看到的即为溶氧(DO))水平对头孢菌素C合成有强烈影响，高溶氧水平说明有充分的氧能够促进头孢菌素C的合成，减少青霉素N(PENN)、脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC)、脱乙酰头孢菌素C(DAC)的含量，供氧不足则会导致发酵副产物DAOC的大量增加。

2.2头孢菌素C发酵过程中不同碳源利用时细胞代谢特性的变化

2.2.1发酵过程碳源利用的转换与参数相关分析

在头孢菌素发酵过程中，获得了如下与不同基质利用相关的参数曲线图。

由图2可知：发酵前期菌体利用糊精水解产生的葡萄糖作为碳源进行生长，菌体代谢逐渐增强，摄氧率OUR、二氧化碳释放率CER均逐渐增加，呼吸商(RQ值)17h前在0.75以上也说明了以葡萄糖类碳源作为主要碳源的利用情况。17h～29h菌体代谢速率加快，糊精水解所得葡萄糖满足不了菌体需求，菌体被迫利用培养基中由黄豆粉等氮源提供的游离氨基酸用作自身合成的碳骨架，RQ值下降。29h～70hRQ值上升，菌体以糊精水解的葡萄糖为主要碳源，同时利用多种碳源，随着糊精的利用70h附近RQ达到峰值0.95，此时进入基质的转换阶段；在发酵进行到90h后，RQ值基本保持在0.6左右，说明此阶段基本以豆油作为细胞代谢的基质。

2.2.2发酵过程中后期补加豆油的作用及对溶氧的影响

顶头孢霉菌发酵生产头孢菌素C中，豆油的补加与利用至关重要，一方面它提供头孢菌素C合成的重要碳源物质，另一方面豆油还是常用的消泡剂，对发酵后期控制发酵罐液位有较大作用。实验结果表明：不同阶段补加的豆油具有不同的作用，基础培养基中含有5％的豆油，从早期发酵过程RQ的变化趋势中看出(见图2)发酵初期豆油并没有得到利用，它的存在也许只是在于对脂肪酶诱导的作用。

发酵中后期在80h开始补加豆油，随着豆油中脂肪酸的利用，95h后基质转换后期RQ下降到0.64，进入豆油完全利用阶段，且RQ波动较平稳。豆油的这种利用情况与菌体脂肪酶活性的形成及高浓度葡萄糖的阻遏相关，因而在基质转换初期(70h左右)，由于脂肪酶活力不足使豆油水解成脂肪酸的速率不能满足菌体的需要，造成代谢参数OUR，CER的下降(图2)，随着脂肪酶活力的提高，可直接利用的碳源脂肪酸增加，使OUR，CER在90h又开始上升，并在110h达到最高值而后进入了一个比较稳定阶段，头孢菌素C生物合成大大改善。

而与之相对应的，在发酵过程以豆油作为基质时，其耗氧量也大大增加，为了维持DO水平，不得不在90h后又多次提高转速，从原来的400rpm提高到了600rpm，(见图1)，而导致以油作为基质时的OUR达到了最大值。

通过上述研究，对头胞菌素C的发酵代谢特性与调控有了初步的了解，且经过DO与OUR的调控在50L发酵罐上的发酵单位达到38000U/ml。

2.3头孢菌素C发酵过程放大研究----基于细胞生理特性与反应器流场特性相结合的方法

2.3.1头孢菌素C发酵过程小试与工业规模发酵罐的生理代谢特性差异

通过对50L小试研究发酵罐对头孢菌素C的代谢特性研究，对其代谢特性有了充分的了解，最终获得了38000u/ml的较高发酵单位；而在经改造后获得相同代谢参数的工业规模160m³发酵罐上，采取相似的培养策略其发酵单位却比小试50L发酵罐上低了20％(见图3，在此图中已将相关参数折算成同单位)。

从图3中可以看出：50L发酵罐中整个过程DO控制得比较平稳，基本在30-50％之间，尤其是在90h以后，当以油作为代谢主要碳源的情况下，OUR维持在较高的水平，而且保持得较平稳；相比之下，在工业规模160m³发酵罐中，在100h左右，DO降的较低，仅为10％左右，在此情况下，一般会采用不得不降低补油量来维持DO的策略，所以与之相对应，160m³发酵罐上此时的OUR开始下降，而且后期一直保持下降的态势；在图3中还有两条曲线值得关注，即小试罐和大罐的RQ曲线，50L发酵罐从以油作为基质后，其RQ值一直比工业规模发酵罐要低的多，这说明相对而言，在小试发酵罐中对油的利用较工业规模发酵罐要好。研究过程中类似的现象是具有普遍性的。图4即为将多批次小试研究过程中的RQ和pH与多批次工业规模发酵罐参数比较图。

从图4可以看出：实验室小试规模发酵罐的RQ明显低于工业规模发酵罐的RQ，也即意味着工业规模发酵罐对油的利用度较小试发酵罐差；与此同时统计全程补入发酵罐的油量(则算成体积比后)反而是工业规模罐上比小试罐上的更大；然而油是从发酵罐的罐顶逐渐补入的，若反应器混合出现问题，则有可能使基质在整个反应器内分布不均匀，使顶头孢霉菌对基质的利用度变差；另外，从两种类型发酵罐前期pH下降的趋势来看，小试规模也较工业规模发酵罐来得快，说明小罐中的细胞代谢活性较工业规模发酵罐上强。文献报道，不同搅拌桨的形式对于发酵过程的供氧、混合会产生相当大的影响，上述参数变化的趋势，使我们对工业规模发酵罐的设备供氧、混合能力产生了怀疑，尽管该工业规模罐配备了3KW/m³的高功率搅拌，但有可能并未满足头孢菌素C高耗氧的需求。

2.3.2工业规模发酵罐的反应器流场特性模拟研究

为了充分了解反应器内的流场特性，本文应用计算流体力学(CFD)，对工业规模反应器内的流场利用英国AEA公司CFX-5软件进行了模拟，获得了如下图所示的流场分布轴面图(图5)和空气体积分布轴面图(图6)。

反应器中的速度场的分布可直观地反映罐内流体的混合情况，为了使罐内流体混合均匀，形成大循环是非常需要的，同时要尽量避免罐内分区，以及形成迟滞区。而从图5显示的不同通气情况下罐内的流体速度场分布轴面图中，可观察到平叶涡轮桨产生明显的径向流，通气量不同时，速度场的分布明显不同，在通气量为0.5vvm时，搅拌桨间流型分布比较均匀，而当空气流量提高到1.2vvm后，发现桨间流型干扰，底层搅拌桨距罐底的流场被破坏，形成迟滞区。而在实际发酵过程中，工业规模发酵罐的通气流量在后期经常超过1.2vvm，所以很有可能即为图5B的状况，即发生了桨间流型干扰的现象，并没有起到很好的混合作用。

而从图6罐内空气体积分布轴面图中，可观察到气含量的分层现象非常严重，在通气量为0.5vvm时，形成从罐底到液面的气含量递减的梯度分布，在下层搅拌桨与罐底间气含量最高，气体分散不好；通气量提高到1.2vvm时，虽然罐内的气含量有所增加，但气含量的分层现象仍然存在，底层桨叶对气体几乎没有扩散，可能进气量已经大于下搅拌桨叶对气体的扩散能力，气泡不能被有效地打碎，分散，包裹在桨叶周围产生气泛，通气量增加后，底层搅拌桨的作用被削弱，大量含有空气气泡的液体没有被底层的搅拌桨重新压回罐底，所以并没有增加气体与液体的接触时间，气体的分散不但没有得到改善，通气量增加反而起了反作用，出现气体沿中心轴短路现象，没有达到增加供氧的目的。

由上述反应器流场模拟结果可知，现有工业规模发酵罐由于全部采用了平叶式(径向)搅拌桨，又由于发酵过程通气量较大，所以导致反应器内氧的供应不能满足头孢菌素C高耗氧的需求；同时从速度场和空气体积分布图中，我们也可看到整个反应器中的流体混合也不均匀，也有可能加剧基质油从发酵罐顶部补入时在整个反应器中的分布不均情况。

2.3.3结合细胞代谢特性与流场特性分析后的工业规模发酵罐改造实施

根据上述模拟结果，本文提出了改变搅拌桨形式，即将原来的四平叶式(径向)搅拌改变成底部一、二层仍以粉碎气泡为主的半圆形与平叶形搅拌，适当增加搅拌桨直径，而三、四层则采用轴向搅拌为主的四款叶式搅拌的方案，同时对新设计搅拌桨后的反应器流场特性进行模拟，模拟结果见图7。从模拟图中可以看出，改造后的桨型情况下，空气分布有了较大的改善，整个发酵罐内比较均匀，改善了罐内的流体混合。

然而实际上工业规模发酵罐搅拌桨的改造由于受到原有结构设计的限制，所以搅拌桨的形式不能改变，在此情况下只能从改变反应器搅拌桨的直径入手，即将原来的搅拌桨直径拉大，使供氧和混合有了改善，获得了初步的改造结果见图8。

从图8可知：搅拌改善后，DO的低点有所改善，OUR也有一定的维持，RQ也较原来的有所降低，最终的发酵单位也比原来提高了14％，取得了初步放大的成功。

3讨论

本论文研究了顶头孢霉菌发酵生产的高好氧特性及其对各参数的影响、发酵过程中补加豆油对头孢菌素C生产的影响，头孢菌素C发酵过程中不同碳源基质转换以及与之相关的参数变化特性，最终在放大过程中通过对反应器流场特性研究，发现引起放大过程生理特性差异的关键点在于反应器的混合传递出现问题，最终采取措施，使工业规模发酵罐的生理特性与小试发酵罐相似，最终实现了发酵过程的放大：

(1)头孢菌素C发酵过程是一个高耗氧过程，溶氧高低在影响菌体自身生长代谢的同时还关系头孢菌素C的产量，同时低溶氧使副产物PEN N，DAOC和DAC增加，既影响了产品的质量又给后续的分离纯化带来很大的麻烦，因此在生物合成过程中，尤其在发酵中后期当以高耗氧的豆油作为主要碳源时，氧的充分供应尤为重要。

(2)豆油是头孢菌素C生物合成所需的关键碳源，对豆油各个阶段作用的分析及对各参数的影响，能够清楚地了解各时期豆油的利用情况：在基础料中添加豆油可以诱导脂肪酶产生，有利于豆油的利用，早期基本是以糊精的水解产物葡萄糖等作为主要的碳源；发酵中期菌体代谢旺盛对基质的需求增加，豆油作为基本碳源被大量消耗，与此同时以豆油为主要基质时，细胞代谢对溶氧的需求很大，所以对设备提出了较高的供氧要求；另一方面，对于160吨高度达10多米的发酵罐而言，从发酵罐顶部流加豆油，想要达到底物在反应器内的均与分布，对发酵罐的混合也提出了较高要求。

(3)在放大过程中，首先通过小试研究罐和生产罐的生理代谢参数的差异，发现生产罐的供氧能力较小试研究罐弱，然后通过计算流体力学软件对工业规模发酵罐的反应器流场进行模拟，发现由于原有设备搅拌桨形式设计成了平叶、径向搅拌，而实际发酵过程中在较大通气量的情况下，原有搅拌桨未能发挥其应有的功效，导致整个反应器内的空气体积分布和流场分布不均匀，工业规模发酵罐的供氧能力低、反应器流体混合不均匀，最终导致细胞代谢特性的差异。最后认识问题后，通过改变搅拌桨直径，增加了供氧和混合，使发酵罐的放大取得了初步成效。

实施例2：

如图9所示，本发明的自控生物反应器装置包括带有搅拌器(104)的生物反应器罐体(100)，该装置由带电机和搅拌器(104)的发酵罐体、具有多参数检测及控制的仪器仪表和传感装置的传感系统、带安装支架和工艺管道系统以及带有工控机及执行元器件的电气控制柜组成，其中所述的传感系统包括温度传感器(1)，pH传感器(2)，溶解氧传感器(3)，全罐秤量传感器(4)，尾气CO₂接口(5)，尾气O₂接口(6)，测速传感器(7)，压力传感器(8)，消泡传感器(9)，通气流量传感器(26)，活细胞量传感器(10)；所述的参数是指温度，搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂。

传感装置单元(101)包括设置在所述罐体(100)上的溶解氧传感器(3)、活细胞量传感器(10)。

所述的带安装支架的工艺管道系统包括料瓶(22)等。

所述的带有工控机及执行元器件的电气控制柜包括；其中所述的带有工控机及执行元器件的电气控制柜包括高精度蠕动泵(11)；基质补料电子秤(12)；前体或油电子秤(13)；酸碱物电子秤(14)；循环泵(25)；电磁阀(15)；数/模转换器(18)；模/数转换器(17)；下位机(19)；上位机(20)；稀土电机(23)。

所述的带有工控机及执行元器控制柜中的计算机软件是根据现场数据采集和操作的需求以及工艺优化的要求，进行在线参数采集、离线参数计算、参数数据记录以及部分参数的在线控制，通过局域网同步向上位机传送所有参数的数据，选用组态语言和C语言对上位机和下位机分别进行编程设计，并且在数据记录时使用了简单冗余技术。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种对生物反应器进行过程优化和数据放大的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)测定所述生物反应器装置的所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；

其中所述生理代谢参数选自：溶氧、摄氧率、呼吸商、体积氧传递系数或其组合；

(b)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较和调节；选出与所述预定值最为接近的生物反应器装置；确定优化的放大生物反应器装置；

其中所述生理代谢参数如步骤(a)所述。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器装置选自头孢菌素C发酵装置。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在调节所需的所述生物反应器装置的生理代谢参数时，包括如下分步骤：

采用CFD流体计算力学装置对所述生物反应器装置的流场进行模拟，得到流场分布图、空气体积分布图或其组合；

根据所述流场分布图、空气体积分布图或其组合，确定流场对所述生物反应器装置的生理代谢参数的影响；

调节所述生物反应器装置的流场，对比调节前后的生理代谢参数的变化，从而确定得到过程优化和数据放大的生物反应器装置。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，调节所述生物反应器装置的流场时，采用改变搅拌桨形式、改变搅拌桨直径的方法或其组合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器装置的容积为20--2000m³。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在获得预定值的生理代谢参数时，包括如下步骤：

检测用于获得预定值的生物反应器装置的多个工艺控制参数，所述多个工艺控制参数为搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂；

用过程分析计算机软件对检测得到的多个工艺控制参数进行计算，得到预定值生理代谢参数的函数图；

对所述预定值生理代谢参数的函数图进行分析，确定预定值生理代谢参数对所述用于获得预定值的生物反应器装置中的代谢的影响；

调节所述用于获得预定值的生物反应器装置的生理代谢参数，对比调节前后的代谢变化，从而确定得到所述生物反应器装置中的优化的预定值生理代谢参数。

7.一种可进行过程优化和数据放大的自控生物反应器装置，所述自控生物反应器装置包括带有搅拌器(104)的生物反应器罐体(100)，以及对所述生物反应器的工艺控制参数进行检测及控制的仪器仪表，其特征在于，所述罐体(100)上设置：

-传感装置单元(101)，所述传感装置单元(101)包括设置在所述罐体(100)上的溶解氧传感器(3)、活细胞量传感器(10)；

-与所述传感装置单元(101)连接的生理代谢参数计算装置(20)，所述生理代谢参数计算装置(20)将所述传感装置单元(101)获得的工艺控制参数转化为作为数据放大基础的生理代谢参数。

8.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述装置还包括CFD流体计算力学装置。

9.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述罐体(100)的体积容量在20--2000m³之间。

10.如权利要求7所述的装置，所述的传感单元(101)还包括温度传感器(1)，pH传感器(2)，全罐秤量传感器(4)，尾气CO₂接口(5)，尾气O₂接口(6)，测速传感器(7)，压力传感器(8)，消泡传感器(9)或其组合。

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