CN102618431A - 一种基于过程质谱仪的封闭式光生物反应器装置及藻细胞生长过程监控方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于过程质谱仪的封闭式光生物反应器装置及藻细胞生长过程监控方法。本发明提供了一种封闭式光生物反应器装置，它包括：封闭式光生物反应器，其中所述的封闭式光生物反应器包括：培养罐体、提供光照的光源、搅拌系统、进气管道、和排气管道；以及与所述封闭式光生物反应器相连或整合的、用于分析排气的在线过程质谱仪系统。本发明具有直接、实时、精确等特点。

Description

一种基于过程质谱仪的封闭式光生物反应器装置及藻细胞生长过程监控方法

技术领域

本发明涉及环境监测和环境保护领域，具体地，本发明涉及一种基于过程质谱仪的封闭式光生物反应器装置及藻细胞生长过程监控方法，本发明方法和设备可用于监控湖泊、海洋蓝藻、微藻等藻细胞的生长。

背景技术

蓝藻、微藻等藻细胞利用二氧化碳和光能通过光合作用合成细胞生长所必需的糖并放出氧气，进而合成蛋白质、脂肪、核酸等大分子物质。不论是生长在敞开式湖泊、海洋和河流、池塘、污水池等的蓝藻、硅藻和微藻，还是人工培养在封闭式光生物反应器(管道式、平板式、立式吊袋、浮式薄膜袋、柱状气升式和搅拌式发酵罐等)的藻类细胞，其生长的最基本生理特征是通过光合作用固定CO₂、和释放氧气。因此，在藻类细胞生长过程中在线监测其光合作用强度将是监控藻细胞生长的最重要方法。

目前，水环境中浮游植物(主要指浮游藻类，不包括细菌和其它植物)含有叶绿素，也是利用光能进行光合作用，将无机物转变为有机物如葡萄糖；同时，将太阳光能通过光合作用被储藏于植物体内，这些有机物和能量供其它消费者代谢利用，维持水环境系统中物质与能量的供应。因此，湖泊中主要初级生产者浮游植物在水环境生态链中具有重要的地位。湖泊水环境的好坏往往与浮游植物(藻类)的初级代谢生产力强弱有重要的相关性。

目前浮游植物(藻类)初级生产力测定方法主要有黑白瓶测氧法、模型法和放射性14C标记法[陈伟民，黄祥飞，周万平，《湖泊生态系统观测方法》，中国环境科学出版社，2005]，这些方法均是采用动态法测定，误差较大。

目前通常用浮游植物释放碳(EOC)测定方法来表征初级生产力大小或藻细胞的生理能力，这种方法是根据活浮游植物细胞代谢时释放碳的原理进行测定。然而，藻细胞代谢强度远低于微生物细胞、动物细胞和植物细胞(表1)。

表1  不同生物细胞氧和CO₂代谢速率范围和测量精度要求

由于浮游植物在曝光时间内每小时的有机碳生产量为0.0444mg/ml/h(约0.01mmol/l/h)[袁信芳，施华宏，王晓蓉；“太湖着生藻类的时空分布特征”，农业环境科学学报，2006，25(4)：1035-1040]，因而测定时需要快速且准确，然而往往由于其值很小而无法准确测定。

对于藻细胞而言，其人工培养主要是采用光生物反应器进行培养，包括光源系统、反应器罐体、搅拌混和系统(如机械搅拌)、控制系统(如温度、pH、溶解氧、空气质量流量等)。

在藻细胞培养时细胞生长观测的方法主要有：直接计数法(如流式细胞仪、平板计数法等)、叶绿素(叶绿素a、叶绿素b、叶红素等)测定法、红外遥感测定法、图像观测法等直接观测法，以及培养环境参数(总碳、总磷、总氮、pH、溶解氧等)测定法、数学模型法等间接观测法。然而，这些方法也不能快速、准确地在线测定浮游植物(藻类)的生理代谢强度。

综上所述，目前本领域缺乏快速、准确地测定浮游植物(藻类)初级生产力或生理代谢强度的方法，因此迫切需要开发一种在线的、能够在毫秒时间内、准确测定浮游植物(藻类)初级生产力或生理代谢强度的方法和设备。

发明内容

本发明的目的就是提供一种在线的、能够在毫秒时间内、准确测定浮游植物(藻类)初级生产力或生理代谢强度的方法和设备。

具体地说，在本发明的第一方面，提供了一种封闭式光生物反应器装置，其特征在于，包括：

封闭式光生物反应器，其中所述的封闭式光生物反应器包括：培养罐体、提供光照的光源、搅拌系统、进气管道、和排气管道；以及

与所述封闭式光生物反应器相连或整合的、用于分析排气的在线过程质谱仪系统，所述在线过程质谱仪系统包括过程质谱仪。

实施方式之一，所述的在线过程质谱仪系统还包括：排气分析前处理系统和数据处理器。

实施方式之一，所述的反应器还安装有在线传感器或检测装置，所述传感器或检测装置用于检测一种或多种选自下组的数据：溶氧浓度、pH、氧化还原电位、在线重量、温度、进气流量、罐压力、光强度、深度。

实施方式之一，所述的排气分析前处理系统包括通过管道相连的以下部件：缓冲瓶、加热器、过滤器，其中来自光生物反应器的排气经所述排气分前处理系统处理后，送入过程质谱仪进行检测。

本发明还提高一种藻细胞生长过程监控方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将藻细胞置于本发明的封闭式光生物反应器装置中；

(b)在藻细胞生长过程中，在线实时测量进气和排气中的CO₂和O₂的浓度，以及在线测量进入和排出空气的质量流量和光生物反应器的真实藻细胞培养体积，从而得出藻细胞生长过程的CO₂固定速率(Carbon dioxide fixation rate，CFR)、O₂释放速率(Oxygen elution rate，OER)和呼吸商(Respirotary quotient，RQ)。

实施方式之一，所述的藻细胞是采集自以下地点的水体样品中的藻细胞：湖泊、河流、海洋、池塘、污水池。

实施方式之一，其特征在于，所述方法还包括步骤c)：基于测定的CO₂固定速率、O₂释放速率和呼吸商，确定藻细胞所处的生长时期。另一实施方式中，步骤c)为：基于测定的CO₂固定速率、O₂释放速率和呼吸商，确定藻细胞所处的生长时期，并判断藻细胞是否已经进入生长对数期或预测藻细胞进入生长对数期的时间。作为实施方式之一，CO₂固定速率、O₂释放速率和呼吸商可按以下公式进行计算：

$\mathrm{RQ}=\frac{\mathrm{CFR}}{\mathrm{OER}}$

F_in：进气流量，mol

C_余in|C_O2in|C_O2in：分别为进气中惰性气体、氧及二氧化碳的浓度％(V)

C_O2out|C_O2out：分别为排气中氧及二氧化碳的浓度％(V)

V：发酵液体，L

$f=\frac{273}{273+t_{\mathrm{in}}}\·P_{\mathrm{in}}\·\frac{1}{1+h}\×{10}^{-5}$

式中

P_in：进气的绝对压强，Pa

t_in：进气的温度，℃

h：进气的相对湿度，％

本发明还提供了所述封闭式光生物反应器装置的用途，包括将本发明装置用于(a)监控藻细胞生长过程；(b)预测湖泊是否会发生水华暴发；(c)在线监测藻细胞的生理代谢强度。

附图说明

图1显示了本发明一个实例中的基于过程基谱仪的封闭式光生物反应器示意图。

图2显示了本发明一个实例中封闭式光生物反应器结构图。

图3显示了本发明一个实例中的排气分析前处理系统；其中，MS表示质谱仪。

图4显示了本发明一个实例中质谱仪分析数据与其他过程数据的集成示意图。

图5显示了本发明一个实例中测定获得的蓝藻培养过程参数变化曲线。

图6显示了本发明一个实例中对不同时期太湖水培养过程藻细胞生长观测结果。其中图6A显示了在线CFR测定结果；图6B显示了叶绿素A变化测定结果。

图7显示了本发明方法中OD值与CFR的相关性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种藻细胞生长的实时监控方法和装置。本发明装置是一种基于过程质谱仪的封闭式光生物反应器，该装置能够在线实时地、在毫秒时间内从封闭式光生物反应器的排气中分析其CO₂和O₂的变化浓度，以及在线分析进入和排出空气的质量流量和光生物反应器的真实藻细胞培养体积，进而通过在线计算藻细胞生长过程的CO₂固定速率(Carbon dioxide fixation rate，CFR)、O₂释放速率(Oxygen elution rate，OER)和呼吸商(Respirotary quotient，RQ)。

封闭式光生物反应器装置和方法

本发明提供了一种基于过程质谱仪的封闭式光生物反应器装置。

参见图1。所述的封闭式光生物反应器装置包括：

封闭式光生物反应器；

与所述封闭式光生物反应器相连(或整合)的在线过程质谱仪系统，该在线过程质谱仪系统包括：排气分析前处理系统、过程质谱仪和数据处理器。

在另一优选例中，所述的基于过程质谱仪的封闭式光生物反应器装置包括：封闭式培养罐与管道系统、光照系统、质谱仪测定系统与排气分析前处理系统、数据通讯与网络系统等中的一部分或多部分组成(图1)。

质谱仪(mass spectrometer，MS)是一种精密现代分析仪器，它先将样品离子化，再通过预先设定的电场或磁场后，实现质荷比分离，并检测其相应峰强，从而达到对样品的定性、定量分析。

在线过程质谱仪主体通过排气管道与封闭式光生物反应器相连接。所述的管道可以是软管，也可以是不锈钢等硬管相连接。

优选地，所述封闭式光生物反应器主要包括培养罐体，以及搅拌系统，以及在线检测与控制传感器(探头)，如溶氧浓度(Dissolved oxygen，DO)、pH、氧化还原电位(Oxidative reductive potential，ORP)、在线重量(Weight，W)、温度(Temperature，TEMP)、进气流量(或空气转子流量计，Flow，F)、罐压力(Press，P)、光强度、深度等一种或多种装置。一种优选的封闭式光生物反应器结构如图2所示。

优选地，所述过程质谱仪在线定量分析排气中O₂浓度(EO₂)、排气CO₂浓度(ECO₂)、进气(空气中)O₂浓度(IO₂)、进气(空气中)CO₂浓度(IO₂)、进气和排气中N₂、H₂、H₂S、Ar₂、甲烷(CH₄)、乙醇(CH₃CH₂OH)、氨气(NH₃)等一种或多种气体浓度功能。

在另一优选例中，在过程质谱仪在检测分析从培养罐体(或称光生物反应器)的排气之前，安装一排气分析前处理系统(图3)，以解决在野外观察站或室内藻细胞培养应用质谱仪时的除湿、除尘、精度控制等问题，保证了仪器的长时间正常运行。

一种排气分析前处理系统如图3所示，其中包括以下部件：缓冲瓶(用于除去水份)、加热器(用于除湿)、过滤器(用于除尘)。缓冲瓶、加热器、过滤器依次通过管道相连，来自光生物反应器的排气就依次通过缓冲瓶、加热器、过滤器，然后进入质谱仪(过程质谱仪)进行检测。

对于质谱检测获得的数据，可以直接输送至数据处理器(如微电脑)进行处理，从而获得反映藻细胞生长或生理代谢强度的相关数据，其中包括(但并不限于)：CO₂固定速率、O₂释放速率和呼吸商等数据。

一般而言，在线测定的藻细胞光合作用时CO₂固定速率(CFR)、O₂释放速率(OER)和呼吸商(RQ)就可反映或判断藻细胞的生长，因为这三个生理参数(CFR、OER、RQ)正是反映细胞生长的最关键的参数。

参见图4，其中给出了一种优选的质谱仪分析数据与其他过程数据的集成方案。图中，一台质谱仪同时分析一台或多台封闭式光生物反应器排气时数据的实时采集方法，其中利用常规的通用的数据通信手段(例如使用市售数据通信软件Biodata，从而将质谱仪分析数据和其他过程数据进行集成，从而获得其他尾气分析仪难以检测到的藻细胞生长二氧化碳固定速率(CFR)和氧气生成速率(OER)，以及在线计算了藻细胞生长的呼吸商(RQ)。

监测方法

本发明还提供了一种藻细胞生长过程监控方法，包括步骤：

(a)将藻细胞置于本发明所述的封闭式光生物反应器装置中；

(b)在藻细胞生长过程中，在线实时测量进气和排气中的CO₂和O₂的浓度，以及在线测量进入和排出空气的质量流量和光生物反应器的真实藻细胞培养体积，从而得出藻细胞生长过程的CO₂固定速率(Carbon dioxide fixation rate，CFR)、O₂释放速率(Oxygen elution rate，OER)和呼吸商(Respirotary quotient，RQ)。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(c)基于测定的CO₂固定速率、O₂释放速率和呼吸商，确定藻细胞所处的生长时期。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(c)基于测定的CO₂固定速率、O₂释放速率和呼吸商，确定藻细胞所处的生长时期，并判断藻细胞是否已经进入生长对数期或预测藻细胞进入生长对数期的时间。

应用

本发明方法和装置具有广泛的应用，其中包括(但并不限于)：

(1)在线检测藻细胞生理代谢强度；

(2)计算藻细胞对废气减排的作用。例如，当采用废气(如烟道尾气)培养藻细胞时，可用本发明装置或方法实时计算出藻细胞对废气中CO₂、CO、H₂S等废气的利用度，从而可计算藻细胞对废气减排的作用；

(3)用于环境监测和提供环境保护的相关数据。例如，用本发明装置或方法测定的藻细胞生理代谢强度，进而准确确定藻细胞生长时期，从而判断藻细胞是否进入生长对数期，或预测藻细胞进入生长对数期(俗称“水华暴发”)的时间。

本发明的装置和监控方法具有以下主要优点：

(a)该装置能够在线实时从封闭式光生物反应器的排气中分析其CO₂和O₂的变化浓度，以及在线分析进入和排出空气的质量流量和光生物反应器的真实藻细胞培养体积，进而通过在线计算藻细胞生长过程的CO₂固定速率(Carbondioxide fixation rate，CFR)、O₂释放速率(Oxygen elution rate，OER)和呼吸商(Respirotary quotient，RQ)，进而可建立在线监测藻细胞的生长状态的方法，为实时分析藻细胞的代谢强度、水华预警、实时计算藻细胞烟道废气减排等提供重要数据。

(b)克服了目前技术中采用流式细胞仪计数费时、费钱、费力和样品预处理等缺点，也可克服红外遥感法、叶绿素测定法等已滞后观测的缺点，可克服在线检测培养环境条件下的pH、DO、氧化还原电位等易受环境和人为因素影响的缺点；

(c)克服了人工或在线测定总磷(Total Phosphate，TP)、总有机碳(TotalOrganic Carbon，TOC)、总氮(Total nitrogen，TN)等并未真正表征细胞生长状态的缺点，以及其费样品量的缺点。

(d)本发明装置和方法对藻细胞的观测具有直接、实时、精确等特点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。

实施例1

太湖蓝藻室内培养过程观测分析

装置：

如图1所示构建本发明的封闭式光生物反应器装置。其中，采用50L发酵罐(上海国强生化)，如图2所示进行装配；如图3所示构建排气分析前处理系统，连接于光反应器的下游，质谱仪(美国Extrel MAX300-LG)的上游；如图4所示构建和连接数据采集和处理系统，过程控制系统采用Bioradar(上海国强生化)，数据采集系统采用Biostar(上海国强生化)。根据设备与软件的制造/供应商的说明书进行参数设定和操作。

培养方法：

于太湖梅粱湾取水、底泥；在50L发酵罐(上海国强生化)底部铺底泥，将太湖水过滤后泵入罐中，水泥比为20∶1；罐顶给予光照，光强约8000勒克斯；培养温度为28℃；给予0.8L/min的进气，以测定尾气二氧化碳。

测定方法：

叶绿素a：采用丙酮提取分光光度法离线测定；

尾气二氧化碳与氧气：采用过程质谱仪在线测定；美国Extrel MAX300-LG

pH、溶氧测定：采用电极进行在线测定；瑞士Mettler Toledo

结果如图5所示。从图5所表现出参数的趋势性可以看出，迟滞期(0-40h)主要表现为好氧代谢生理特征，即放出CO₂(CFR＞0)，而pH、DO往往表现为逐渐下降的趋势；对数生长期(40-100h)表现为好氧与厌氧(光合作用代谢)的竞争转变为光合作用为优势的生理特征，即CFR逐渐下降，但仍然大于零(＞0)，而pH和DO则逐渐上升，叶绿素A浓度开始迅速增加；水华暴发期(120h左右)的藻细胞数据急骤增加到最大值，即叶绿素A浓度为最大值，此阶段CER因藻细胞固定CO₂而呈负值(＜0)，且出现最小值，同时pH和DO也出现最大峰值；水华消退期，可能由于营养等条件限制，水华在生长至最大密度后，往往随之出现水华的消退期，此阶段生理参数CER逐渐从最小值上升，理化参数(pH、DO)然后从最大峰值逐渐下降。当CER＞0时，则湖水又表现为好氧代谢强度大于呼吸代谢(光合作用)，表明藻细胞已明显消退。

培养过程中，pH、溶氧、叶绿素a浓度、CER的变化明显，并呈现一定的趋势性变化。其中，pH、溶氧、叶绿素a浓度变化表现为正相关性，CER与上述参数变化表现为负相关性。水华暴发时，pH、DO和叶绿素a呈最大值，而藻细胞光合强度也为最强，即CO₂固定速率(CFR)表现为最小峰值。藻细胞对数生长期是水华暴发预警的关键阶段，此时表现为pH、DO和叶绿素A开始迅速增大，而CER表现为逐渐下降并呈负值(＜0)。水华的消退表现为CER逐渐从最水值逐渐增大，而pH、DO表现为开始逐渐下降。当CER＞0时，表明水华消退明显。因此，通过该系统成功模拟了水华的消长过程，包括休眠期与复苏期(延滞期)、快速生长期、爆发期、消亡期。

实施例2

同一太湖地点不同季节取水时期的蓝藻培养观测结果

参照实施例1所述，分别在2008年三月下旬、四月中旬、四月下旬于太湖取水、泥进行培养观测藻细胞生长。

结果如图6所示。

由图6A可以看出，蓝藻的生长速度受取水时间的影响明显。四月下旬所取太湖水在20h左右就开始快速生长，到90小时左右叶绿素a已达最高值。而四月中旬所取太湖水在50小时才开始快速生长，三月下旬的太湖水复苏期最长，约70h。

叶绿素a与CFR到达峰值时间也较四月下旬实验推迟(图6B)。

实施例3

小球藻培养在线监测结果

参照实施例1所述，在本实施例中，以小球藻为培养对象，以无机培养基进行光合培养，培养温度为30度。

无机盐培养基的配方如下(g/L)：

KNO3	1.25，	KH2PO4	1.25g，
				MgSO4·7H2O	1.0g，	CuSO4·2H2O	0.0835g
FeSO4·7H2O	0.049g	EDTA	0.05mg
				微量元素	10ml

小球藻培养时以质谱仪在线分析CO₂排气浓度，然后根据本装置对CO₂固定速率(CFR)进行计算，同时以取样测光密度(OD₆₈₀)来分析小球藻的生长密度。

二者分析结果如图7所示。线性相关分析结果表明，两者相关系数(R)达0.96。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种封闭式光生物反应器装置，其特征在于，包括：

封闭式光生物反应器，其中所述的封闭式光生物反应器包括：培养罐体、提供光照的光源、搅拌系统、进气管道、和排气管道；以及

与所述封闭式光生物反应器相连或整合的、用于分析排气的在线过程质谱仪系统，所述在线过程质谱仪系统包括过程质谱仪。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的在线过程质谱仪系统还包括：排气分析前处理系统和数据处理器。

3.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的反应器还安装有在线传感器或检测装置，所述传感器或检测装置用于检测一种或多种选自下组的数据：溶氧浓度、pH、氧化还原电位、在线重量、温度、进气流量、罐压力、光强度、深度。

4.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述的排气分析前处理系统包括通过管道相连的以下部件：缓冲瓶、加热器、过滤器，其中来自光生物反应器的排气经所述排气分前处理系统处理后，送入过程质谱仪进行检测。

5.一种藻细胞生长过程监控方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将藻细胞置于权利要求1所述的封闭式光生物反应器装置中；

(b)在藻细胞生长过程中，在线实时测量进气和排气中的CO₂和O₂的浓度，以及在线测量进入和排出空气的质量流量和光生物反应器的真实藻细胞培养体积，从而得出藻细胞生长过程的CO₂固定速率(Carbon dioxide fixation rate，CFR)、O₂释放速率(Oxygen elution rate，OER)和呼吸商(Respirotary quotient，RQ)。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的藻细胞是采集自以下地点的水体样品中的藻细胞：湖泊、河流、海洋、池塘、污水池。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(c)基于测定的CO₂固定速率、O₂释放速率和呼吸商，确定藻细胞所处的生长时期。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(c)基于测定的CO₂固定速率、O₂释放速率和呼吸商，确定藻细胞所处的生长时期，并判断藻细胞是否已经进入生长对数期或预测藻细胞进入生长对数期的时间。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中，CO₂固定速率、O₂释放速率和呼吸商分别按以下公式进行计算：

$\mathrm{RQ}=\frac{\mathrm{CFR}}{\mathrm{OER}}$

CFR表示CO₂固定速率、OER表示O₂释放速率，RQ表示呼吸商，

F_in：进气流量，mol，

C_余in|C_O2in|C_CO2in：分别为进气中惰性气体、氧及二氧化碳的浓度％(V)，

C_O2out|C_O2out：分别为排气中氧及二氧化碳的浓度％(V)，

V：发酵液体，L，

$f=\frac{273}{273+t_{\mathrm{in}}}\·P_{\mathrm{in}}\·\frac{1}{1+h}\×{10}^{-5}$

式中：

P_in：进气的绝对压强，Pa，

t_in：进气的温度，℃，

h：进气的相对湿度，％。

10.如权利要求1所述的封闭式光生物反应器装置的用途，其特征在于，所述装置被(a)用于监控藻细胞生长过程；(b)用于预测湖泊是否会发生水华暴发；(c)用于在线监测藻细胞的生理代谢强度。

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