CN101775424A - 维生素b12发酵过程优化与放大的方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对使用生物反应器装置的发酵过程进行优化放大的方法，所述方法包括步骤：(a)测定所述生物反应器装置的所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；其中所述生理代谢参数选自：溶氧、摄氧率、pH、二氧化碳释放率、呼吸商、活细胞量或细胞形态、测定的代谢产物或基质消耗、或其组合；(b)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较；选出与所述预定值最为接近的生物反应器装置；确定优化的放大生物反应器装置；其中所述生理代谢参数如步骤(a)所述。

Description

维生素B12发酵过程优化与放大的方法与装置

技术领域

本发明涉及一种发酵过程优化与放大的方法及其装置，尤其是涉及一种维生素B₁₂发酵过程优化与放大的方法与装置。

背景技术

为了使小型发酵试验所获得的规律和数据能在大生产中再现，就要掌握和运用放大技术。现有技术中一般采用相似原理进行比拟放大。具体地，现有技术中比拟放大的基本方法是：首先必须找出表征此系统的各种参数，将它们组成几个具有一定物理含义的无因次数，并建立它们之间的函数式，然后用实验的方法在试验设备里求得此函数式中所包含的常数和指数，则此关系式便可用作与此试验设备几何相似的大型设备的设计。

所有放大原则的目的都在于从大量的试验材料中把握和找出影响生产过程的主要矛盾，从而使得大型设备的规律和数据在小型发酵试验所获得的规律和数据能在大生产中再现。目前通用的放大准则包括：

(1)几何相似：其函数式如下式(I)

D₂/D₁＝D_i2/D_i1＝(V₂/V₁)^1/3    式(I)

D-------------反应器直径

D_i-------------搅拌器直径

V--------------反应器的装料容积

(2)恒定等体积功率放大由Pg/V恒定而确定搅拌转速。

(3)恒定传氧系数kLa放大

(4)恒定剪切力恒定叶端速度放大剪切力与搅拌桨叶端速度成正比，在恒定体积功率放大时一般维持n³d²不变(n为搅拌桨转速、d为搅拌桨直径)

(5)恒定的混合时间tM放大等。

在应用上述放大原则(或准则)的放大过程中，本领域技术人员可以通过有限的试验建立类似式(I)的函数式，这些函数式属于现有技术，在此不作详述。

但是上述现有的放大准则的不足之处在于，其都是基于细胞外的参数检测为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法，没有着眼于基于细胞代谢物质流分布变化的有关现象特征参数。在放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似，当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，会导致量变引起质变，从而造成整个发酵过程的失败。因此，本领域缺乏基于生理代谢特征参数的放大原则及其方法。

目前，采用现有的放大原则对维生素B₁₂发酵过程优化与放大，特别是放大到工业规模水平时遇到了问题，体现在维生素B₁₂的发酵单位都不高于125μg/ml，低于小型发酵试验的发酵单位。

现有技术中，维生素B₁₂通常是指含钴离子的钴胺素类化合物。它是一种重要的生物活性物质，是哺乳动物的造血因子，可以用来治疗恶性贫血症，同时它也是许多微生物和动物的生长因子。维生素B12的生物合成严格限于微生物中，自然界中VB₁₂的合成途径存在两种不同的路线：(1)需氧合成途径，比如脱氮假单孢杆菌(P.denitrificans)等微生物中；(2)厌氧合成途径，比如Bacillus megaterium、P.shermanii、Salmonella typhimurium等微生物中。长期来，VB₁₂的合成研究与与生产大多停留在厌氧发酵途径；经过至少25年的努力，借助于遗传学和分子生物学手段以及与酶学、化学合成、同位素标记、核磁共振波谱学等相结合，P.denitrificans中VB₁₂的需氧合成途径才在1993年被完整地阐述。如式II所示的反应式显示了各种微生物维生素B₁₂生物合成途径的示意图，以及需氧合成途径与厌氧合成之间的差异。

在大部分细菌中，四吡咯的生物合成都是从谷氨酸的C-5骨架开始的，经过多步反应，形成5-Aminolaevulic acid(5-氨基乙酰丙酸)、uroporphyrinogen III(尿卟啉原III)，而尿卟啉原III通过甲基转移酶在C-2和C-7上进行甲基化，从而合成前咕啉-2(precorrin-2)。如式II显示，在形成前咕啉-2后，钴胺素的生物合成开始形成两个分支途径：在需氧合成途径中，前咕啉-2在C-20上甲基化，从而形成前咕啉-3A；然而，在厌氧合成途径中，前咕啉-2被钴离子螯合，生成钴—前咕啉-2(cobalt-precorrin-2)。因而，VB₁₂的需氧和厌氧合成途径的区别之一在于钴离子的螯合时机不同，厌氧合成途径中钴离子的螯合起始于前咕啉-2，然而在需氧合成途径中钴离子的螯合发生在前咕啉-2接下来的九个反应阶段之后。另外，在VB₁₂好氧合成途径中，前咕啉-3A的C-20原子被分子氧所氧化，结果以乙酸盐的形式释放出C-20，而在VB₁₂厌氧合成途径中厌氧条件下，可能是通过络合的钴离子呈现不同的价位(从+1到+3)以达到氧化作用，结果以乙醛的形式释放出C-20。虽然VB₁₂的需氧和厌氧合成路线是在前咕啉-2时分开的，但是它们再次在腺苷钴啉胺酸(adenosyl-cobyric acid)处合成路线又变得相同。

在过去的数十年间，用于生产VB₁₂的微生物主要有Propionibacteriumshermanii、P.freudenreichii、P.denitrificans等厌氧合成代谢途径，而P.denitrificans是近年兴起的用于好氧合成VB₁₂的工业菌种，由于其生产效率远大于厌氧合成代谢途径，所以对其应用研究也是目前人们所关注的热点。由于VB₁₂的好氧合成途径和厌氧合成途径有很多步骤是相同的，加之P.denitrificans是一种兼性厌氧菌，因此，在生产上对P.denitrificans产VB₁₂发酵过程的溶氧控制可能会产生一定的疑问和误区。

综上所述，本领域缺乏具有维生素B₁₂发酵过程优化与放大的方法，及其维生素B₁₂发酵用的工业规模的生物反应器。

因此，本领域迫切需要开发维生素B₁₂发酵过程优化与放大的方法，及其维生素B₁₂发酵用的工业规模的生物反应器。

发明内容

本发明的第一目的在于获得一种可用于维生素B₁₂发酵过程优化与放大的方法。

本发明的第二目的在于获得一种可用于维生素B₁₂发酵用的工业规模的生物反应器。

在本发明的第一方面，提供了一种对使用生物反应器装置的发酵过程进行优化放大的方法，所述方法包括步骤：

(a)测定所述生物反应器装置的所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；

其中所述生理代谢参数选自：供氧量、溶氧、摄氧率、pH、二氧化碳释放率、呼吸商、活细胞量或细胞形态、测定的代谢产物或基质消耗、或其组合；

(b)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较；选出与所述预定值最为接近的生物反应器装置；确定优化的放大生物反应器装置；

其中所述生理代谢参数如步骤(a)所述。

在一优选例中，所述测定的代谢产物或基质消耗为实验室手工测定的代谢产物或基质消耗。

在本发明的一个具体实施方式中，所述生物反应器装置选自维生素B₁₂发酵装置。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的生物反应器装置是容量为20L--2000m³的发酵罐。

在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(a)中，该方法通过检测生物反应器的多个工艺控制参数以获得所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合，

其中所述多个工艺控制参数为搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂。

在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(b)中，测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的差异不高于10～15％之间。

在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(b)中所述的预定值是小罐发酵条件下的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；

其中，所述生物反应器装置相对于小罐体积的放大倍数不低于20～2000倍之间。

在一优选例中，所述小罐如5、10、20、30、50、100升或是1—10M³。

在本发明的一个具体实施方式中，在步骤(b)的比较过程中，还包括如下步骤：

(i)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较；

(ii)调节所述生物反应器装置的生理代谢特征参数特征、生理代谢参数相关特性或其组合，使得所述生物反应器装置的生理代谢特征参数特征相对于所述预定值的差异不高于10～15％之间，选定与所述预定值最为接近的生物反应器装置；

(iii)确定优化的放大生物反应器装置。

在本发明的第二方面提供一种可进行过程优化和数据放大的自控生物反应器装置，所述自控生物反应器装置包括带有搅拌器的生物反应器罐体，以及对所述生物反应器的工艺控制参数进行检测及控制的仪器仪表，所述罐体上设置：

-传感装置单元，所述传感装置单元包括设置在所述罐体上的溶解氧传感器、活细胞量传感器；

-与所述传感装置单元连接的生理代谢特征参数计算装置，所述生理代谢特征参数计算装置将所述传感装置单元获得的工艺控制参数转化为作为数据放大基础的生理代谢特征参数。

在一优选例中，所述工艺控制参数是指温度，搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂。

具体地，所述搅拌器采用转速为0～1000rpm之间的高速搅拌器。

具体地，所述生物反应器上设有氧气流量在0～100升/分之间的供氧设备。

在本发明的一个具体实施方式中，所述罐体的体积容量在20L--2000m³之间。优选120m³～2000m³，更优选150m³～2000m³。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的传感单元还包括温度传感器，pH传感器，全罐秤量传感器，尾气CO₂接口，尾气O₂接口，测速传感器，压力传感器，消泡传感器或其组合。

附图说明

图1为实施例1中在9m³中试发酵罐上获得的代谢曲线(The processparamteters of VB₁₂fermentation in 9m³ fermentor)

图2为实施例1中低供氧水平下的参数变化趋势图(The processparamteters of VB₁₂ fermentation in low dissolved oxygen concentration)

图3为实施例1中高供氧水平下的参数变化趋势图(The processparamteters of VB₁₂ fermentation in high dissolved oxygenconcentration)

图4为实施例1中两种不同溶氧控制罐批下总糖、氨基氮、菌体干重和VB₁₂的动态变化过程(Time profiles of total sugar，NH₂-N，cellgrowth and VB₁₂productionin two DOC control levels)

图5为实施例1中两种不同供氧能力情况下发酵过程比生长速率和比产物形成速率的变化情况(Time profiles of specific growth rate(μ)andspecific productionrate(q_p)of VB₁₂fermentationin two DOCcontrollevels)

图6为实施例2的自控生物反应器装置的示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过改进制备工艺，获得了在以代谢流分析与控制为核心的发酵过程参数调整的研究方法基础上，获得了一种能够将实验室规模的优化条件放大到工业规模的方法。在此基础上完成了本发明。

本发明是基于如下原理而提出的：以工业生产为目的的生物系统的功能取决于外界环境刺激与胞内功能基因的共同作用。这种外界环境对细胞功能的影响主要通过以下几种途径，其一，外界条件(如温度、pH)对菌体细胞内酶的作用或代谢速率直接产生影响；其二，由于反应器混合传递所引起的基质(如氧、各种碳源)供应不足或过量，由此产生的胞内代谢的变化；其三，细胞的信号传导系统对外界环境条件的响应，引起细胞转录表达系统的变化，由此进而引起细胞代谢网络的变化。这就要求我们要在综合考虑胞外环境及菌体生理特性的基础上进行工业生物过程的优化与放大，而实际工业生产中多为液态培养，因而菌体的外部环境的研究即归结为生物反应器内流体力学研究，由此得到不同条件下的温度场、浓度场、剪切力场等；细胞的行为则通过菌体生理特性来表达。通过将两者整合起来研究其相互作用规律从而为生物反应器的优化与放大开辟一条崭新的科学思路。

根据上述原理，本发明设计了以下进行流程放大和优化的具体路线：在发酵过程放大研究时，提出了首先在以代谢流分析与控制为核心的发酵实验装置上进行研究，由此可得到用于过程研究的状态参数或生理参数以及他们之间的相关特性，由此可实现生物反应器中基因、细胞、反应器不同尺度的跨尺度研究，即通过多尺度参数相关分析实现发酵过程优化。在放大时，只要我们在放大的设备上得到完全(或基本)相同的反映代谢流等生理数据变化曲线，就可以较好地克服上述放大过程中的问题，因而提出了发酵过程参数调整的放大技术。

以下对本发明的各个方面进行详述：

(一)进行过程优化和数据放大的方法

本发明涉及一种对使用生物反应器装置的发酵过程进行优化放大的方法，所述方法包括步骤：

(a)测定所述生物反应器装置的所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；

其中所述生理代谢参数选自：供氧量、溶氧、摄氧率、pH、二氧化碳释放率、呼吸商、活细胞量或细胞形态、测定的代谢产物或基质消耗、或其组合；

(b)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较；选出与所述预定值最为接近的生物反应器装置；确定优化的放大生物反应器装置；

其中所述生理代谢参数如步骤(a)所述。

在一优选例中，所述方法包括：

获得第一生物反应器装置(也即用于获得预定值的生物反应器装置)的优化生理代谢特征参数强度或相关特性等，所述生理代谢特征参数选自溶氧、摄氧率、pH、二氧化碳释放率、呼吸商、活细胞量或细胞形态、各种实验室手工测定的代谢产物或基质消耗等或其它组合；优选地，选自摄氧率、呼吸商、pH等或其它组合。

获得第二生物反应器装置(也即用于优化或放大的生物反应器装置)的生理代谢特征参数强度或相关特性等，所述生理代谢特征参数选自溶氧、pH、摄氧率、二氧化碳释放率、呼吸商、活细胞量或细胞形态、各种实验室手工测定的代谢产物或基质消耗等或其组合；优选地，选自摄氧率、呼吸商、pH等或其它组合。

调节所述第二生物反应器装置的生理代谢特征参数特征，使其相对于所述第一生物反应器装置的优化生理代谢特征参数的差异不高于10～15％，从而得到过程优化和数据放大的第二生物反应器装置。该调节步骤使得所述第二生物反应器装置的生理代谢特征参数特征与所述第一生物反应器装置具有相同的趋势即可。

具体地，在调节所述第二生物反应器装置的生理代谢特征参数特征时，可以通过调节所述第二生物反应器装置中的供氧和耗氧量，从而使得所述第二生物反应器装置的生理代谢特征参数特征相对于所述第一生物反应器装置的优化生理代谢特征参数的差异不高于10～15％。

更具体地，所述供氧量和耗氧量、OUR的调节可以根据本领域传统的工艺，具体地例如通过搅拌转速、通气流量、补碳、氮源或其他基质流量等调节。

在现有技术中，对反应器的优化及其放大通常是基于单个或多个工艺控制参数(例如温度、pH等)，这些单个或多个工艺控制参数仅仅基于单一生理调控机制的研究。但是基于单一生理调控机制的研究往往只揭示了生理调控的局部和某一时段的特点，仅靠高度分支化和具体分散的研究是难以对整个发酵过程优化控制和放大起决定性作用。发明人经过大量研究，确定了放大过程中最关键的“生理代谢特征参数”，使得生物学与工程学相结合，并解决局部与整体、时变动态与最终结果、菌种改造与过程优化的关系。

具体地，所述摄氧率(OUR)通过测定尾气氧浓度、通气流量、发酵液体积而得到；具体地，例如通过采用下式：

mol/L·h

式中：

F_in：进气流量，(mol)

C_情in\C_O2in\C_CO2in：分别为进气中惰性气体、氧及二氧化碳的浓度％(V)C_o2out\C_CO2out：分别为排气中氧及二氧化碳的浓度％(V)

V：发酵液体，(L)

$f=\frac{273}{273+t_{\mathrm{in}}}\·P_{\mathrm{in}}\·\frac{1}{1+h}\×{10}^{-5}$

式中

P_in：进气的绝对压强，Pa

t_in：进气的温度，℃

h：进气的相对湿度，％

上述计算过程还可以由计算机的分析软件包进行；例如由发酵过程实时数据分析软件包BIOSTAR计算得到。

如本发明所述，所述“生物反应器”包括但不限于：发酵罐、动物细胞反应器、或植物细胞反应器。

所述方法中的“第一生物反应器装置”通常是指本领域常用的实验室规模或小试规模的生物反应器装置。具体地，所述“第一生物反应器装置”的容量在20～500升之间。

所述第一生物反应器装置的“预定值”生理代谢特征参数可以通过本领域传统的优化方法得到，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。例如。采用正交法获得最优化的一个或多个生理代谢特征参数。

所述方法中的“第二生物反应器装置”是指工业化规模的生物反应器装置。具体地，所述“第二生物反应器装置”的容量在1m³以上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述第二生物反应器装置相对于所述第一生物反应器装置的放大倍数不低于20～2000倍之间。

具体地，所述第二生物反应器装置的容积为20～2000m³。

(二)可进行过程优化和数据放大的自控生物反应器装置

本发明还提供一种可进行过程优化和数据放大的自控生物反应器装置，所述自控生物反应器装置包括带有搅拌器(104)的生物反应器罐体(100)，以及对所述生物反应器的工艺控制参数进行检测及控制的仪器仪表，所述罐体(100)上设置：

—传感装置单元(101)，所述传感装置单元(10)包括设置在所述罐体(100)上的溶解氧传感器(3)、活细胞量传感器(10)；

—与所述传感装置单元(101)连接的生理代谢特征参数计算装置(20)，所述生理代谢特征参数计算装置(20)将所述传感装置单元(101)获得的工艺控制参数转化为作为数据放大基础的生理代谢特征参数。

具体地，所述罐体(100)的体积容量在20～2000M³之间，优选100～2000M³，更优选100～2000M³。

具体地，所述的传感单元(101)还包括温度传感器(1)，pH传感器(2)，全罐秤量传感器(4)，尾气CO₂接口(5)，尾气O₂接口(6)，测速传感器(7)，压力传感器(8)，消泡传感器(9)或其组合。

更具体地，所述仪器仪表测定的工艺控制参数是指温度，搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂。

具体地，所述活细胞量传感器采用四电极系统。

所述四电极系统具体地例如：根据放在交变电场中的活细胞，由于细胞内的原生质体起着电解质作用，在交变电场的极化作用所形成的电容与生物量呈对应关系。改变交变电场的频率就会产生不同的极化效果，由此确定最佳的测量条件，测量的电容值通过统一信号传输到计算机数据处理，作为多参数相关分析的生物量的依据。

本发明的所述传感单元中的各种传感器可以采用本领域传统的各种传感器，只要其不对本发明的发明目的产生限制即可。

本发明的所述仪器仪表的安装位置可以按照本领域的传统工艺进行，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。

在本发明的装置的一个具体实施方式中，采用以下技术方案：

一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，该装置由带电机和搅拌器的发酵罐体、具有多参数检测及控制的仪器仪表和传感装置的传感系统、带安装支架和工艺管道系统以及带有工控机及执行元器件的电气控制柜组成，其特征在于其中所述的传感系统包括温度传感器(1)，pH传感器(2)，溶解氧传感器(3)，全罐秤量传感器(4)，尾气CO₂接口(5)，尾气O₂接口(6)，测速传感器(7)，压力传感器(8)，消泡传感器(9)，通气流量传感器(26)，活细胞量传感器(10)；所述的参数是指温度，搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂。

其中所述的带有工控机及执行元器件的电气控制柜包括高精度蠕动泵(11)；基质补料电子秤(12)；前体或油电子秤(13)；酸碱物电子秤(14)；循环泵(25)；电磁阀(15)；数/模转换器(18)；模/数转换器(17)；下位机(19)；上位机(20)；稀土电机(23)。

其中所述的带安装支架的工艺管道系统包括料瓶(22)；全罐秤量支座；取样用特殊支架；罐体总成；快速装拆机座；电动机；管架；油水分离器；减压阀；过滤器；流量计；空气过滤器；压力表；冷却器；管道视镜；热水器；无死体积取样阀；消泡传感器接口；尾气CO₂接口；尾气O₂接口；温度传感器；pH传感接口；DO传感器接口。

上述带安装支架的工艺管道系统、电气控制柜的各个组件及其组成方式均可以按照本领域传统的工艺进行，只要不对本发明的发明目的进行限制即可。

所述工控机及执行元器件的电气控制柜构成本发明所述的生理代谢特征参数计算装置(20)；其中各种组件均可以采用本领域传统的组件，只要不对本发明的发明目的即可。

具体地，所述的带有工控机及执行元器控制柜中的计算机软件是根据现场数据采集和操作的需求以及工艺优化的要求，进行在线参数采集、离线参数计算、参数数据记录以及部分参数的在线控制，通过局域网同步向上位机传送所有参数的数据，选用组态语言和C语言对上位机和下位机分别进行编程设计，并且在数据记录时使用了简单冗余技术。

更具体地，所述计算机软件采用华东理工大学国家生化工程技术研究中心(上海)的上位机软件包BIOSTAR。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比。

除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

发明的有益效果是：

(1)即通过发酵过程表征细胞宏观代谢流变化的参数与其它代谢过程中的各种参数进行基于参数相关分析的优化研究，对P.denitrificans发酵产VB₁₂的过程中氧的供应与消耗等进行了深入研究，发现了发酵过程供氧不足有可能是限制VB₁₂耗氧能力即合成能力提高的关键影响因素之一。并以此为依据，首先在9m³中试规模发酵罐上通过调控DO与OUR的相互关系，使VB₁₂的合成代谢得以正常进行，最终以发酵过程耗氧特性一致的原理，通过在工业规模发酵罐上调整和改进发酵工艺，实现了工业规模120m³发酵罐上VB₁₂生产产量的大幅度提高。

实施例1：B₁₂发酵过程优化与放大

1材料和方法

1.1菌种和培养基

1.1.1菌株：脱氮假单孢杆菌(Pseudomonas denitrificans)，由石家庄制药集团华荣制药有限公司提供。

1.1.2培养基

一级种子培养基：糖蜜、玉米浆、KH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、(NH₄)₂HPO₄、MnSO₄等。

二级种子培养基：糖蜜、玉米浆、KH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、(NH₄)₂HPO₄、MgSO₄等。

发酵培养基：糖蜜、蔗糖、甜菜碱、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、CoCl₂、DMBI、ZnSO₄等。

1.2发酵罐：中试发酵罐容积为9m³，搅拌器为轴向；工业规模发酵罐容积为120m³，搅拌器主流为轴向混合。

1.3分析方法

1.3.1生物量测量：采用测量菌体干重法(Dry cell weight，DCW)。吸取25ml发酵液，离心后用蒸馏水洗菌体，再次离心后，将菌体105℃烘至恒重后称量。

1.3.2总糖的测定：采用斐林试剂法。

1.3.3氨基氮的测定：甲醛滴定法。

1.3.4尾气分析：使用SIMENS GXH-9022CO₂、O₂分析系统，最后的数据处理和相关分析通过华东理工大学国家生化工程技术研究中心(上海)的上位机软件包BIOSTAR完成。

1.3.5溶解氧测定：Mettler Toledo(市售仪器)在线溶氧检测系统。

1.3.6pH测定：Mettler Toledo(市售仪器)在线pH检测系统。

1.3.7VB₁₂测定

将被测样品中不同形式的VB₁₂转化为氰钴胺，流动相：250mM磷酸水溶液：乙腈＝30：70，色谱柱：C85FI13513260*4.6mm；检测波长：361nm；进样量：20ul；流速：1.7ml/min。

2.结果与分析

2.1摇瓶中不同供氧水平对发酵产VB₁₂的影响

由于利用P.denitrificans合成VB₁₂是一个耗氧的代谢过程，在VB₁₂的好氧合成途径中，还涉及到0原子的加入。但是，目前对P.denitrificans发酵过程中供氧状况不同对VB₁₂合成所产生的影响还未有文献报道。因此本试验在摇瓶发酵过程中，通过在相同摇瓶中放入相同量的发酵液和同样的接种量情况下，不同发酵阶段的转速变化来考察摇瓶中不同供氧水平对VB₁₂合成的影响。具体的试验设计和结果见表1：

表1摇瓶发酵过程中转速变化对VB₁₂合成的影响

(The effect of different revolutions per minute in shake-flaskfermentation on VB12 biosynthesis)

由表1可以看出，当摇瓶发酵过程的转速一直为200rpm时，放瓶时的VB₁₂单位最低；摇瓶发酵过程的转速一直维持在260rpm时，放瓶时的VB₁₂单位在六种处理中最高，比对照提高24％。摇瓶发酵过程的第60-100h是P.denitrificans开始大量合成VB₁₂的阶段，由表1可以看出，该发酵阶段的供氧状况对最终放瓶单位影响最为关键，该阶段转速为200rpm的三个处理的放瓶VB₁₂单位相对较低，都低于该阶段转速为260rpm的三个处理。从以上试验结果可以得出结论，摇瓶发酵过程中供氧状况良好更有利于VB₁₂的生物合成。

2.2在9m³中试规模发酵罐上不同供氧与耗氧情况对脱氮假单孢杆菌的代谢影响

在对摇瓶研究中获知了供氧对脱氮假单胞杆菌发酵过程中代谢的重要性，于是先在安装了发酵过程数据分析软件包BIOSTAR的中试规模9m³发酵罐上进行了实验，获得了如图1所示的代表性代谢曲线：

从获得的曲线上可以发现，在脱氮假单胞杆菌发酵过程中，随着发酵过程的进行，菌量(X)的不断增加，耗氧率(OUR)与二氧化碳释放速率(CER)不断增加，DO也不断下降，20h左右DO机已降到较低水平(20％左右)，然后OUR、CER均达到了较高水平，随着发酵的不断进行，在80h左右OUR、CER又略有增加，而DO又有所下降(8％左右)，而到了发酵后阶段，实际上菌量的增加已不是太大(X的增加比较平缓)，然而OUR、CER仍维持较高水平，此时VB₁₂的增长却保持了较高的速率，确实说明VB₁₂的合成过程是一个较强的耗氧过程，在此操作调控下最终的VB₁₂发酵单位达到了195μg/ml。

2.3基于耗氧特征一致的工业规模放大研究

随后在120m³工业规模发酵罐上进行了放大实验，获得了下述不同操作条件下的代谢情况。

调节120m³工业规模发酵罐的生理代谢特征参数特征、生理代谢参数相关特性或其组合(具体地调节供氧水平)。参照预定值的生理代谢特征参数特征，选定与所述预定值最为接近的生物反应器装置。

2.3.1两种不同供氧水平下发酵前期OUR、CER、DO、pH的变化

图2和图3为120m³罐上两种不同供氧水平下(通气量F如图)，发酵前期在线采集的OUR、CER、DO、pH的变化趋势图。

由图2和图3可以看出，P.denitrificans菌体的延滞期非常短暂，菌体生长后pH呈上升趋势，pH上升至最高峰后，开始逐渐下降，然后又有个回升的过程，之后又开始下降。在低供氧条件下如图2显示，由于pH不断下降，不得不通过补加氨水来维持发酵液适宜的pH，所以出现了锯齿形的pH走势，而相比之下在供氧较好的情况下(图3)，在20h后pH非常稳定，并不象低供氧水平下的罐批那样需要流加氨水来调节pH，可能是因为氧的供应较好，糖代谢完全，积累的有机酸较少，使得pH较平稳。而从DO的变化趋势来看，随着菌体的生长DO逐渐下降，CER、OUR也同步逐渐增加，图2中当DO在第17h降至0时，OUR和CER仍然呈现上升趋势，到第24.5h时OUR和CER到达最高峰，分别达到46mol/(hm³)和44mol/(hm³)。第24.5h之后OUR和CER明显开始下降，这很可能是由于菌体的生长代谢受到氧的供应的限制而造成的，该罐批下VB₁₂的放罐单位为125μg/ml。而在图3中，前期的DO走势相同，但到15h时DO降低程度较图2高些(约5％)，过程中曾通过增加通气量使OUR与CER都到了一个新的高度，且OUR和CER并没有出现明显的下降趋势，这说明菌体一直维持着较旺盛的代谢能力，从而更加利于VB₁₂的生物合成，该罐批下VB₁₂的放罐单位为190μg/ml。

2.3.2放大效果的测定—两种不同供氧水平下发酵过程的总糖、氨基氮、菌体干重和VB₁₂等参数变化情况

与上述试验结果相对应，本试验测定了两种不同溶氧控制的罐批下发酵过程总糖、氨基氮、菌体干重和VB₁₂的变化情况，结果见下图4：

在发酵过程中，当总糖浓度降低到4g/100ml左右时，开始进行补加糖，控制发酵液中总糖浓度在3-4g/100ml。由图4.A可以看出，发酵前期糖耗基本相似，低供氧罐批的略好一些，这有可能是该批发酵的菌种质量较好所导致的，但在20h后，供氧较好的罐批其糖耗速率明显较低供氧罐批要好；发酵过程氨基氮变化趋势是较低供氧罐批在第36h之前氨基氮含量较供氧较好的罐批低，但之后，较低供氧罐批的氨基氮高于高溶氧控制的罐批，尤其是120h之后，低溶氧控制罐批的氨基氮回升幅度非常大。氨基氮含量的变化同样说明了二种供氧情况下罐批的菌体代谢变化，在第36h之后，低溶氧控制罐批的菌体代谢能力由于溶氧限制而下降明显，更是造成120h之后菌体自溶的加剧。

由图4.B可以看出，在第30h之前，较低供氧罐批的菌体干重略高于供氧较好的罐批，这和在此阶段的糖耗、氨基氮含量等均有良好的相关性。但是第30h之后，供氧较好的罐批的菌体干重则一直大于较低供氧罐批，不同的供氧控制策略下的不同罐批下的最大菌体干重分别为35.44g/L和31.26g/L。这再次说明，由于种子质量较好等一些因素，使得较低供氧罐批的菌体生长代谢能力在发酵前期要优于供氧较好的罐批。但是随着菌体量越来越大，这需要越来越多的氧来满足菌体的生长代谢，较低供氧罐批在未进行工艺调整的情况下其供氧能力不能满足菌体对于氧的需求，使得溶氧降低至0，更是使得溶氧成为菌体生长代谢的限制性因素。另外，从菌体合成VB₁₂来看，第36h时，较低供氧罐批的VB₁₂单位还略高于供氧较好的罐批，分别为20.13μg/ml和18.65μg/ml。但60h之后，供氧较好的罐批的VB₁₂单位却高于较低供氧罐批，尤其是在第108h之后，供氧较好的罐批的VB₁₂单位的增长幅度更是明显高于较低供氧罐批，最终的VB₁₂放罐单位供氧较好的罐批比较低供氧罐批的发酵单位提高了50％，最终发酵单位达到了190μg/ml。

综合以上两种不同供氧水平罐批的总糖、氨基氮、菌体干重和VB₁₂等的参数变化过程，可以得出一个很明显的结论，P.denitrificans在发酵过程中，在菌体好氧最为剧烈的发酵前期，如果不能满足菌体对氧的需求，会因为氧的供应的限制而严重影响菌体的生长代谢，从而导致菌体提前自溶，更是会影响VB₁₂的合成。据此我们对发酵过程的搅拌转速和空气流量作一定的调整，以改善发酵过程的供氧、混合及传质状况，通过确保发酵过程的供氧和耗氧，尤其是供氧状况改善之后有利于发酵过程菌体的生长和VB₁₂的合成。

2.3.3两种不同供氧水平下发酵过程比生长速率和比产物形成速率的变化情况

在上述两种不同供氧水平的罐批下，其发酵过程中μ和q_p的变化见图5：

由图5.A可以看出，较低供氧的罐批在第12h时比生长速率就达到最大值，为8.89×10^-2h^-1，而供氧较好罐批在第16h时达到最大值，为9.13×10^-2h^-1。在菌体旺盛生长的阶段，供氧较好罐批的比生长速率一直高于较低供氧罐批的比生长速率。第48h之后，二者的菌体比生长速率在1×10^-2h^-1以下，而第96h之后比生长速率更是接近于0。由图5.B可以看出，在整个发酵过程中，供氧较好罐批的q_p一直高于较低供氧罐批的q_p。结果再次说明，在P.denitrificans发酵产VB₁₂的过程中，氧的供应的限制会严重影响菌体的生长和VB₁₂的合成，而改善发酵过程中的供氧水平更加有利于发酵过程菌体的生长和VB₁₂的合成。

3.结论

目前有很多关于P.denitrifican合成VB₁₂的报道，但主要只是集中在对VB₁₂合成途径的研究，以及采用随机诱变和基因工程手段来提高产VB₁₂的水平。而在P.denitrifican产VB₁₂的有关总体实时代谢工艺调控的报道却较少，大多也都局限于培养基的优化等。本文集中探讨了发酵过程宏观代谢调控中的细胞耗氧特征对P.denitrifican发酵产VB12的影响。

首先通过P.denitrifican的摇瓶试验考察了供氧状况对VB₁₂合成的影响，结果表明供氧状况良好更有利于VB₁₂的合成；在此基础上，通过发酵过程参数趋势曲线变化的相关性分析，首先在9m³中试罐上，发现了发酵过程中氧的供给与确保OUR的趋势是保证VB₁₂合成能力提高的关键性因素，因此通过对工艺进行调整和改进，提高了发酵过程的供氧水平，使得VB₁₂的产量有了大幅提高；最后在工业规模120m³发酵罐上按照同样原理放大，通过调整工艺操作时的供氧与OUR相关参数(如图3进行调节)，使VB12的发酵单位由工艺改进前的125μg/ml提高到190μg/ml，提高了50％。

实施例2：

如图6所示，本发明的自控生物反应器装置包括带有搅拌器(104)的生物反应器罐体(100)，该装置由带电机和搅拌器(104)的发酵罐体、具有多参数检测及控制的仪器仪表和传感装置的传感系统、带安装支架和工艺管道系统以及带有工控机及执行元器件的电气控制柜组成，其中所述的传感系统包括温度传感器(1)，pH传感器(2)，溶解氧传感器(3)，全罐秤量传感器(4)，尾气CO₂接口(5)，尾气O₂接口(6)，测速传感器(7)，压力传感器(8)，消泡传感器(9)，通气流量传感器(26)，活细胞量传感器(10)；所述的参数是指温度，搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂。

传感装置单元(101)包括设置在所述罐体(100)上的溶解氧传感器(3)、活细胞量传感器(10)。

所述的带安装支架的工艺管道系统包括料瓶(22)等。

所述的带有工控机及执行元器件的电气控制柜包括；其中所述的带有工控机及执行元器件的电气控制柜包括高精度蠕动泵(11)；基质补料电子秤(12)；前体或油电子秤(13)；酸碱物电子秤(14)；循环泵(25)；电磁阀(15)；数/模转换器(18)；模/数转换器(17)；下位机(19)；上位机(20)；稀土电机(23)、通气流量传感器(26)。

所述的带有工控机及执行元器控制柜中的计算机软件是根据现场数据采集和操作的需求以及工艺优化的要求，进行在线参数采集、离线参数计算、参数数据记录以及部分参数的在线控制，通过局域网同步向上位机传送所有参数的数据，选用组态语言和C语言对上位机和下位机分别进行编程设计，并且在数据记录时使用了简单冗余技术。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种对使用生物反应器装置的发酵过程进行优化放大的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)测定所述生物反应器装置的所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；

其中所述生理代谢参数选自：供氧量、溶氧、摄氧率、pH、二氧化碳释放率、呼吸商、活细胞量或细胞形态、测定的代谢产物或基质消耗、或其组合；

(b)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较；选出与所述预定值最为接近的生物反应器装置；确定优化的放大生物反应器装置；

其中所述生理代谢参数如步骤(a)所述。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器装置选自维生素B₁₂发酵装置。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物反应器装置是容量为20L--2000m³的发酵罐。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，该方法通过检测生物反应器的多个工艺控制参数以获得所述发酵过程中的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合，

其中所述多个工艺控制参数为搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液真实体积及重量，补料量包括基质、前体、油、酸碱物，尾气CO₂和O₂。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的差异不高于10～15％之间。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中所述的预定值是小罐发酵条件下的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合；

其中，所述生物反应器装置相对于小罐体积的放大倍数不低于20～2000倍之间。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)的比较过程中，还包括如下步骤：

(i)将步骤(a)测定的所述生理代谢参数、生理代谢参数相关特性与预定值的生理代谢参数、生理代谢参数相关特性或其组合进行比较；

(ii)调节所述生物反应器装置的生理代谢特征参数特征、生理代谢参数相关特性或其组合，使得所述生物反应器装置的生理代谢特征参数特征相对于所述预定值的差异不高于10～15％之间，选定与所述预定值最为接近的生物反应器装置；

(iii)确定优化的放大生物反应器装置。

8.一种可进行过程优化和数据放大的自控生物反应器装置，所述自控生物反应器装置包括带有搅拌器(104)的生物反应器罐体(100)，以及对所述生物反应器的工艺控制参数进行检测及控制的仪器仪表，其特征在于，所述罐体(100)上设置：

-传感装置单元(101)，所述传感装置单元(101)包括设置在所述罐体(100)上的溶解氧传感器(3)、活细胞量传感器(10)；

-与所述传感装置单元(101)连接的生理代谢特征参数计算装置(20)，所述生理代谢特征参数计算装置(20)将所述传感装置单元(101)获得的工艺控制参数转化为作为数据放大基础的生理代谢特征参数。

9.如权利要求8所述的装置，其特征在于，所述罐体(100)的体积容量在20L--2000m³之间。

10.如权利要求8所述的装置，其特征在于，所述的传感单元(101)还包括温度传感器(1)，pH传感器(2)，全罐秤量传感器(4)，尾气CO₂接口(5)，尾气O₂接口(6)，测速传感器(7)，压力传感器(8)，消泡传感器(9)或其组合。

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