CN103757064B - 一种pH调控微藻油脂快速积累的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种pH调控微藻油脂快速积累的方法，步骤为：（1）微藻生物量预培养：在反应器中培养微藻，直至所述微藻的生长进入稳定期；（2）CO₂培养：向反应器中通入含CO₂废气，对步骤（1）得到的微藻进行培养，直至所述微藻进入稳定期后，继续培养2～3天；（3）微藻油脂快速积累：停止向反应器中通入CO₂气体，改通入空气，直至培养液pH值高于10。所述方法克服了高浓度CO₂条件下微藻油脂含量不高的问题，实现了在氮源充足条件下油脂的快速积累；具有生物量密度高、油脂积累迅速、操作成本低、方便快捷、能量消耗小等优势。

Description

一种pH调控微藻油脂快速积累的方法

技术领域

本发明涉及生物工程和生物能源领域，具体涉及一种_pH调控微藻油脂快速积累的方法。

背景技术

大气中温室气体的增加导致了全球气候变暖，微藻生物固碳技术被认为是解决该问题的有效方法之一。微藻生物技术还可以通过培养条件控制促进胞内油脂含量的积累，具有生长速度快、油脂含量高的特点，因此是生物柴油的重要原料来源。

目前微藻固碳产油研究领域中仍然存在一些瓶颈问题：高浓度CO₂会抑制微藻的生长，降低生物量产率；高浓度CO₂会抑制微藻油脂积累，降低油脂产率；氮抑制等传统的油脂促进方法操作复杂、能量消耗大、成本高。在高浓度CO₂条件下，微藻油脂含量普遍较低。Chiu等（ChiuSY,KaoCY,TsaiMT,OngSC,ChenCH,LinCS.LipidaccumulationandCO₂utilizationofNannochloropsisoculatainresponsetoCO₂aeration.Bioresour.Technol.,2009,100:833-838.）发现，Chlorellasp.和NannochloropsisoculataNCTU-3在2%、5%、10%和15%CO₂条件下对应的油脂产率均呈现下降趋势。

微藻油脂积累通常发生在有环境压力条件下，例如在氮源不足、高盐度、磷缺乏、硅缺乏、高温、高光强或高pH等条件下会发生微藻油脂的积累。

在各种营养元素抑制方法中，氮抑制是促进微藻油脂积累的常用方法。Illman等(IllmanAM,ScraggAH,ShalesSW.IncreaseinChlorellastrainscalorificvalueswhengrowninlownitrogenmedium.Enzyme.Microb.Technol.,2000,27:631-635.)发现Chlorellavulgaris在低氮条件下胞内油脂含量为40%，而在高氮条件下胞内油脂含量仅为18%。Li等(LiYQ,HorsmanM,WangB,WuN,LanCQ.EffectsofnitrogensourcesoncellgrowthandlipidaccumulationofgreenalgaNeochlorisoleoabundans.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,81:629-636.)发现，Neochlorisoleoabundans在3mMNaNO₃条件下胞内油脂含量最高，但是在5mMNaNO₃条件下胞内油脂产率最高。Takagi等（TakagiM,Karseno,YoshidaT.EffectofsaltconcentrationonintracellularaccumulationoflipidsandtriacylglycerideinmarinemicroalgaeDunaliellacells.J.Biosci.Bioeng.,2006,101:223–226.）考察不同盐度对Dunaliella的油脂积累影响，发现当NaCl浓度由0.5M增加到1.0M时，胞内油脂含量由60%上升至67%，油脂提升幅度较小。Khozin-Goldberg等（Khozin-GoldbergI,CohenZ.TheeffectofphosphatestarvationonthelipidandfattyacidcompositionofthefreshwatereustigmatophyteMonodussubterraneus.Phytochemistry,2006,67(7):696-701.）发现，培养液中K₂HPO₄浓度依次按175μM，52.5μM，17.5μM，0μM逐渐降低时，胞内总油脂含量逐渐升高。当培养液中无磷酸盐时，磷脂含量从8.3%下降到1.4%，而TAG含量则从6.5%增加到39.3%。Sheehan等（SheehanJ,DunahayT,BenemannJ,RoesslerP.ALookBackattheUSDepartmentofEnergy'sAquaticSpeciesProgram:BiodieselfromAlgae.NREL/TP-580-24190,1998:67-139.）发现，硅藻门中Cyclotellacryptica与Nitzschiadissipata在营养充足条件下胞内油脂含量分别为18%和28%，在硅抑制条件下，胞内油脂含量分别提高为38%和47%。Rodolfi等（RodolfiL,ChiniZittelliG,BassiN,PadovaniG,BiondiN,BoniniG,TrediciMR.Microalgaeforoil:strainselection,inductionoflipidsynthesisandoutdoormasscultivationinalow-costphotobioreactor.BiotechnolBioeng.,2009,102:100-112.）发现，低氮、低磷条件下易于促进胞内油脂的富集，但也会抑制微藻细胞生长，无法实现生物量产率和油脂含量的同时提高。近年来研究者多采用两段式培养方法进行微藻培养，初始在营养元素充足条件下迅速提高生物量密度，然后将藻体转移至无氮培养液中进行培养，以达到同时提高微藻生物量和油脂含量的目标。但在该过程中藻体的分离转移需要耗费较多能量，且培养时间较长，应用成本较高。

Cooksey等（GuckertJ,CookseyK.TriglycerideaccumulationandfattyacidprofilechangesinChlorella(Chlorophyta)duringhighpH-inducedcellinhibition.J.Phycol.,1990,26(1):72–79.）首次发现了提高培养液pH可以促进小球藻的油脂积累。但在以往研究中，氮抑制是该方法的前提条件，且pH均通过添加酸碱试剂进行调节，成本较高，不适合大规模工业应用。

实际上，CO₂进入液相发生水合反应，生成H⁺和HCO₃ ^-离子，微藻分泌的胞外碳酸酐酶可以促进CO₂与HCO₃-离子间的相互转化，其中HCO₃ ^-为微藻可利用的主要碳源形式。微藻利用HCO₃-离子，会影响液相中化学反应平衡，在外界CO₂供应不足的条件下HCO₃-离子浓度的消耗会提高OH^-离子的浓度，从而液相的pH提高。Bozzo等（BozzoGG,ColmanB.TheinductionofinorganiccarbontransportandexternalcarbonicanhydraseinChlamydomonasreinhardtiiisregulatedbyexternalCO₂concentration.Plant.Cell.Environ.,2000,23(10):1137-1144.）考察Chlamydomonasreinhardtii从5%CO₂条件切换到0.035%CO₂条件对微藻无机碳传输机制的影响，发现在CO₂浓度切换后的6小时内，胞外碳酸酐酶的活性比高浓度CO₂条件下提高了10倍。碳酸酐酶活性的提高可以加速CO₂到HCO₃-的转化及其利用，从而可能快速提高环境pH。公开号为CN103013833A的中国专利文献公开了一种高pH诱导、耦合二氧化碳减排的微藻采收新方法，通过控制通气条件提升pH促进藻体絮凝，培养过程中停止通气后发现pH上升至10.0～12.3。

烟气中高浓度的CO₂一般会对微藻碳酸酐酶及细胞固碳代谢产生抑制，CO₂浓度的持续提高可能导致游离在液相中碳酸酐酶失活，从而阻碍CO₂的固定。因此，生物量生长会受到抑制，固碳效率普遍较低。

发明内容

本发明提出了一种pH调控微藻油脂快速积累的方法，所述方法克服了高浓度CO₂条件下微藻油脂含量不高的问题，实现了在氮源充足条件下生物量密度的提高和油脂的快速积累；具有生物量密度高、油脂积累迅速、操作成本低、方便快捷、能量消耗小等优势。

本发明公开了一种_pH调控微藻油脂快速积累的方法，包括以下步骤：

（1）微藻生物量预培养：在反应器中培养微藻，直至所述微藻的生长进入稳定期；

（2）高浓度CO₂培养：向反应器中通入含CO₂的废气，对步骤（1）得到的微藻进行培养，直至所述微藻进入稳定期后，继续培养2～3天；

（3）微藻油脂快速积累：停止向反应器中通入CO₂气体，改通入空气，直至培养液pH值高于10。

空气条件下，将微藻在反应器内培养至较高生物量密度，然后向反应器内通入含CO₂的废气，在高浓度CO₂条件下继续培养。当进入到稳定期时，将通入反应器内的气体从高浓度CO₂切换为空气，培养环境中pH由较低水平迅速上升至10以上，在高pH条件下产油微藻胞内油脂开始快速积累。

藻种筛选的原则：

目前作为产油藻种的筛选主要集中在绿藻，小球藻Chlorella和微绿球藻Nannochloropsis是绿藻中最具潜力的产油藻种。两者均具有光合速率快、倍增时间短、繁殖速度快、油脂产率高的特点，其中小球藻常作为微藻固碳实验藻种，具有较好的CO₂固定效率，根据以上藻种特性选择小球藻Chlorella作为优选。

通过微藻的预培养，可以提高所述微藻的生物量密度，增强微藻对高浓度CO₂的耐受性，以促进生物量产率及油脂产率的提高。

在微藻培养周期中，当生物量密度处于稳定时，微藻生长即处于稳定期。

以小球藻为例，所述的微藻的预培养，直至小球藻的生物量密度高于0.6gL^-1，此时小球藻的生长基本进入稳定期，且对高浓度CO₂的耐受性较佳。

作为优选，所述含CO₂废气可以为含高浓度CO₂气体的烟道气、电厂废气、窑炉废气等。

作为优选，所述含CO₂废气中CO₂含量为5%～15%。通过实验比较发现，小球藻在10%CO₂条件下可以达到最大CO₂去除速率，且对生物量生长抑制较小，更接近真实烟气CO₂浓度，因此进一步优选为10%。

作为优选，步骤（1）所述的培养条件为：初始硝氮含量为7mM，室温下通入空气，气体流量为2lmin^-1，光照强度为5000lux。

作为优选，步骤（2）所述的培养条件为：初始硝氮含量为5mM，室温下通入CO₂废气，气体流速为2lmin^-1，光照强度为5000lux。

将含CO₂废气气路切换为空气气路后，培养液内的pH会提高至10以上。为保证在10%CO₂条件下小球藻生物量密度最大，优选后步骤（3）所述通入空气的时间为1～2天。

作为优选，可以将快速累积了油脂的微藻采收，重新高密度培养微藻，进行CO₂培养及油脂快速积累，实现循环培养。

在步骤（3）的油脂快速积累过程中，可以同时在线监测培养液的_pH值和溶氧量，利用尼罗红染色法测定藻体中油脂含量。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

（1）本方法简单易行、操作成本低、能量消耗小；

（2）可以在富氮的环境下进行培养，无需进行藻体的分离转移；

（3）以含CO₂的废气为碳源，节能减排；

（4）克服了微藻在高浓度CO₂条件下油脂含量不高的缺点，在气路切换后1～3天内，油脂含量可以从低油脂状态迅速达到23.4%；

（5）克服了微藻在高浓度CO₂条件下生物量密度不高的缺点，生物量密度在气路切换后有显著上升。

附图说明

图1为本发明中使用的气升式光生物反应器培养装置示意图；

图中，①气升式光生物反应器；②空气压缩机；③CO₂气瓶；④气体混合罐；⑤转子流量计；⑥第一质量流量计；⑦第二质量流量计；⑧计算机；

图2为实施例1培养的小球藻生物量干重在气路切换前、后的变化曲线；

图3为实施例1培养的小球藻油脂含量在气路切换前、后的变化曲线；

图4为实施例1培养的小球藻的pH值在气路切换前、后的变化曲线；

图5为实施例1培养的小球藻的溶氧量在气路切换前、后的变化曲线；

图6为实施例1培养的小球藻的硝酸盐含量在气路切换前、后的变化曲线。

具体实施方式

本发明实施例中的微藻的培养在图1所示的气升式光生物反应器培养装置中进行。

在预培养阶段，开启空气压缩机②，打开第一质量流量计⑥，经过气体混合罐④后，通过转子流量计⑤调控气速，最终由底部进入气升式光生物反应器①中。

在小球藻高浓度CO₂培养过程中，同时开启空气压缩机②和CO₂气瓶③，通过⑥和⑦两个质量流量计分别调控空气和CO₂进气比例，CO₂气体和空气在气体混合罐④中混合，经过转子流量计⑤控制气速，由底部进入气升式光生物反应器①中。

气体浓度切换时，关闭CO₂气瓶③，同时关闭第二质量流量计⑦，恢复至预培养阶段反应器设置。气体混合罐④中残余CO₂气体逐渐排净，最终仅空气通入气升式光生物反应器①中。气升式光生物反应器①中微藻的培养过程可通过计算机⑧进行在线监测。

实施例1

（1）在容积为7L的气升式反应器中预培养5L小球藻藻液（Chlorellavulgaris，由宁波大学海洋生物工程重点实验室提供），人工海水培养液，以0.2vvm通入空气，25±1℃，5000lux连续培养约5天时间进入生长稳定期，小球藻的生物量密度为0.6gL^-1。

（2）将装有0.6gL^-1、5L小球藻的反应器以2Lmin^-1流量切换通入含CO₂的烟道气（CO₂含量为10%），5000lux光强，24h光照，温度保持在25±1℃。测定初始培养液中硝酸盐含量在5mM左右。

（3）在含CO₂的烟道气条件下培养5天进入稳定期，在培养第7天将含CO₂的烟道气改为空气（即气路切换后），同时在线监测培养液的pH值和溶氧量（DO），利用尼罗红染色法测定藻体中油脂含量。

性能评价

1、藻体干重测定

取3ml藻液，用紫外分光光度计（GS-54上海棱光）测定样品在450nm波长下的吸光值，根据测定的标准曲线换算实际干重。当藻液浓度过高，其吸光值超过0.8时，需对藻液按比例稀释，测定结束后根据稀释比例进行换算。小球藻紫外分光光度计法测定藻体干重DW标准曲线为：

DW=0.49×OD₄₅₀(gL^-1)

图2为本实施例培养的小球藻生物量干重在气路切换前、后的变化曲线。从图2中可知，在气路切换前小球藻生物量密度稳定在0.8gL^-1，气路切换后小球藻生物量密度在3天内上升至0.98gL^-1。

2、胞内油脂含量测定

以三油精做标线，配制不同浓度的三油精样品3ml，添加3μl尼罗红染色剂（浓度1mgmL^-1，溶解丙酮）于37℃恒温水浴染色10min，将染色后样品倒入石英比色皿中，用荧光分光光度计（F96Pro荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司）快速测定荧光强度，激发波长480nm，发散波长580nm，增益10档。确定标准曲线：

$Y=\frac{(X-25.555)}{60000\×\mathrm{DW}}(\%)$

式中Y—油脂含量%，X—油脂荧光强度，DW—藻体干重gL^-1。

然后采集3ml样品，采用以上相同操作过程，按照标准曲线公式进行计算，测定出微藻胞内油脂含量。

3、硝酸盐含量测定

取3ml藻液，以6000rpm离心藻液3min，取上清液1ml于25ml标准比色管中，加入1ml1moll^-1的HCl溶液和0.1ml0.8%的氨磺酸溶液，用蒸馏水定容至25ml，混匀后取3ml样品于石英比色皿中，用紫外分光光度计测定在220nm和275nm波长下吸光值，最终用前吸光值减去后吸光值为所得吸光值A(需乘以稀释倍数25x)，根据测定标线换算硝酸盐含量B，mgL^-1。标准曲线公式如下：

A=0.2718B+0.0034（mg/L）。

图3为本实施例培养的小球藻油脂含量在气路切换前、后的变化曲线。从图3中可知，在气路切换前小球藻胞内油脂含量很低，在气路切换后3天内胞内油脂含量迅速上升至23.4%。

图4为本实施例培养的小球藻的pH值在气路切换前、后的变化曲线，从图4中可知，在气路切换前藻液pH稳定在6.0～6.5之间，气路切换后pH迅速上升至10.0。

图5为本实施例培养的小球藻的溶氧量在气路切换前、后的变化曲线，从图5中可知，在气路切换前藻液溶氧含量逐渐升高，最高为232%，气路切换后藻液溶氧含量迅速下降，最终溶氧含量为31.9%，溶氧含量下降表示小球藻胞内相关代谢机制在短时间内发生快速变化。

图6为本实施例培养的小球藻的硝酸盐含量在气路切换前、后的变化曲线，从图6中可知，尽管在整个培养周期中藻液硝酸盐含量逐步下降，但在实验结束时环境中硝酸盐含量依然保持在60mgL^-1浓度以上，满足小球藻对氮源的需求，不存在氮抑制效应。

Claims (7)

1.一种pH调控微藻油脂快速积累的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)微藻生物量预培养：在反应器中培养微藻，直至所述微藻的生长进入稳定期；

步骤(1)中，初始硝酸盐含量为7mM以上；

(2)CO₂培养：向反应器中通入含CO₂废气，对步骤(1)得到的微藻进行培养，直至所述微藻进入稳定期后，继续培养2～3天；

步骤(2)中，初始硝酸盐含量保持在5mM以上；

(3)微藻油脂快速积累：停止向反应器中通入CO₂气体，改通入空气，直至培养液pH值高于10；

所述微藻为产油藻种的小球藻。

2.如权利要求1所述的pH调控微藻油脂快速积累的方法，其特征在于，所述含CO₂废气为烟道气、电厂废气或窑炉废气。

3.如权利要求2所述的pH调控微藻油脂快速积累的方法，其特征在于，所述含CO₂废气中CO₂含量为5％～15％。

4.如权利要求3所述的微藻油脂快速积累的方法，其特征在于，所述含CO₂废气中CO₂含量为10％。

5.如权利要求4所述的pH调控微藻油脂快速积累的方法，其特征在于，步骤(1)所述的培养条件为：预培养期通入空气，温度为25℃，光照为5000lux。

6.如权利要求书5所述的pH调控微藻油脂快速积累的方法，其特征在于，步骤(2)所述的培养条件为：向反应器中通入含CO₂废气，含CO₂废气中CO₂含量为10％，温度为25℃，光照为5000lux。

7.如权利要求书6所述的pH调控微藻油脂快速积累的方法，其特征在于，步骤(3)所述通入空气的时间为1～2天。