CN109609383A - 基于pH调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法 - Google Patents

基于pH调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微藻培养及固碳领域，尤其涉及微藻培养中pH的调控及利用NH4HCO3吸收液培养微藻的方法。能够在促进微藻生物质产量的同时，减少氮损失，提高固碳量，克服了传统吸收工艺中氨水吸收CO2工艺解吸过程中大量的能耗和氮损失的问题，并且降低了微藻培养的成本。本发明实施例提供了一种将NH4HCO3吸收液分批补料并进行pH调节的微藻培养方法，用无氮培养基培养微藻，将NH4HCO3作为营养物质，将NH4HCO3分批补料，降低了氨氮浓度，减少氨毒性；对pH进行调控，减少了氨氮的挥发，同时让培养基处于适合微藻生长的pH范围内。

Description

基于pH调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法
技术领域
本发明涉及微藻培养领域，尤其涉及微藻培养中pH的调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法。
背景技术
传统工艺中，氨水吸收CO2产生的高能耗一直是一个重要的问题。为了解决吸收液解吸过程中的能耗问题，本文拟设计一种氨水吸收—微藻固定相结合的CO2捕集系统。因此，将氨水吸收CO2生成的主要物质NH4HCO3作为氮源和碳源，加入到微藻培养系统中，促进微藻生长。同时，微藻产生的藻粉中，可以提取中多糖、油脂、蛋白质等营养成分。
然而，在碱性条件下，NH4HCO3作为营养物质培养微藻，当浓度较高时，水中的氨多以游离氨(NH3)的形式存在，容易产生氨毒性，抑制微藻生长。同时，当pH＞9时，游离态NH3还容易发生氨逃逸。当培养基中主要是自养培养时，在培养过程中不外加物质的条件下，由于水中的无机碳被微藻吸收，极易导致溶液总pH上升，导致严重的氨毒性以及氨逃逸。通过分批补料的方法可以一定程度上解决氨毒性和氨损失的问题，但是当补料时间间隔过长，效果不明显，补料时间间隔过短，操作繁琐。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种化学吸收与生物转化耦合的CO2捕集方法，能够实现利用氨水吸收CO2形成的吸收液作为营养物质，供给微藻生长，微藻的生物质后期可用于制备多糖、蛋白质等附加值产品。同时，该发明还解决了铵根作为氮源存在的氨抑制和氨损失的问题。
本发明为解决背景技术中的技术问题，采取的技术方案是：基于pH调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法，其特征在于，通过氨水吸收CO2生成的NH4HCO3作为模拟吸收液，加入到微藻培养基中，作为营养物质供给微藻生长；
步骤1)预培养：
(1)用250mL锥形瓶盛装200mL培养基于121℃中高压蒸汽灭菌30min；
(2)待冷却后，进行微藻Chlorella sp.LAMB 38接种工作，整个过程在无菌操作台中进行；
(3)接种完成后，将锥形瓶放入30±1℃、6000Lux不间断光照的条件下培养，并以0.1vvm的速度向其中通入5％CO2+95N2组成的混合气，小球藻进行光合自养生长；
(4)经过大约4～7天的预培养，微藻生长进入指数期，进行接种工作，控制初始接种量为OD680＝0.2，进行正式培养实验；
步骤2)补料培养：
一共有3种补料时间间隔：3天、6天和9天；
3种pH条件：不调节pH、调节pH到7和调节pH到8；
采用全因素分析法，共有9个培养基环境条件；
培养基选用以NH4HCO3为替代NaNO3的无氮BG11培养基，其中隔3天补料的条件下，NH4HCO3投加方式为：接种时加入124mg/L，其余124mg/L分8次(第3、6、9、12、15、18、21、24天)加入，每次添加15.5mg/L；隔6天补料的条件下，NH4HCO3投加方式为：接种时加入124mg/L，其余124mg/L分4次(第6、12、18、24天)加入，每次添加31mg/L；隔9天补料的条件下，NH4HCO3投加方式为：接种时加入124mg/L，其余124mg/L分2次(第9、18天)加入，每次添加62mg/L；在不同补料方式下，分别采取补料时不调节pH、调节pH到7和调节pH到8。
步骤3)检测：每隔三天测定一次OD680(与生物质浓度成正比)、pH、氨氮浓度，培养结束后，通过元素分析，测定固碳、蛋白质，结合溶液中氨氮浓度计算氮损失，测定培养基TIC浓度，分析无机碳走向，并测定多糖和油脂浓度。
光强实现条件为单排荧光灯侧面给光，每天24小时光照。
pH调节方式为补料时通过添加1mol/L盐酸或氢氧化钠进行调节。
氮源添加浓度的实现方式为配置69.5g/L的NH4HCO3浓度，根据所需添加浓度计算添加到溶液中，保证添加体积对培养基体积影响不超过2％。
所述氨氮浓度的测定方法为纳氏试剂分光光度法，所述多糖浓度的测定方法为苯酚硫酸法，所述油脂测定方法为尼罗红染色法。
(1)对微藻进行分批补料培养，将NH4HCO3分批加入，并优化补料时间，从而实现对NH4HCO3一定程度上的浓度控制，解决氨毒性，减少氨挥发；
(2)由于氨毒性和氨逃逸主要存在于高pH(pH＞9)的条件下，通过在补加NH4HCO3溶液时，调节培养基pH，在降低氨毒性和氨逃逸的同时，让pH同时处于适合该微藻生长的范围内(弱碱性)。
有益效果
1、氨水吸收液如果通过解吸回收的话，会造成很高的经济成本，将其作为营养物质培养微藻，可以很好的解决微藻培养的高成本的问题。
2、通过将总浓度为248mg/L的碳酸氢铵分批加入，并缩短加入的时间间隔，可以使得微藻培养过程中氨氮浓度不超过180mg/L，一定程度上解决了氨抑制的问题。
3、补料过程中，进行了pH的调节，一方面补料点氨氮浓度较高，易造成一定程度的氨抑制，而通过降低pH可以解决氨抑制的问题，同时低pH也使得氨氮不易挥发到空气中；另一方面，pH可以调控到适合该藻株Chlorella sp.L38生长的范围内。
4、利用NH4HCO3吸收液培养微藻，经过进行补料模式和pH调控，不仅促进了微藻的生长，促进了微藻固碳，还缓解了氮逃逸的问题，使得氮逃逸低于传统的氨水吸收CO2的工艺，此外，还促进了微藻多糖和蛋白质等后期产物的生产。
附图说明
图1为9种培养条件下27天OD680的变化曲线；
图2为9种不同的培养条件下pH值的变化曲线：
其中:a、b、c分别为隔3天、6天和9天补料的条件下的培养基中pH值变化曲线；
图3为9种培养条件下27天培养基中氨氮浓度的变化曲线:
其中:a、b、c分别为隔3天、6天和9天补料的条件下的培养基中pH值变化曲线；
图4为9种不同培养条件下氨氮去向分布的实验结果图；
图5为9种不同培养条件下氨氮氮损失的实验结果图；
图6为9种不同的培养条件下固碳量(从空气中固碳+从溶液中固碳)的实验结果图；
图7为9种不同的培养条件下多糖、油脂、蛋白质等三种后期产物的实验结果图:
其中：a、b、c分别为不同补料条件下的微藻多糖、油脂和蛋白质产量。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。为让本领域相关技术人员参照该说明书，对本发明作进一步的详细解说。
步骤一：将小球藻Chlorella sp.,L38在光照强度为6000lux，温度为30±1℃，以0.1vvm的速度向其中通入5％CO2+95N2组成的混合气，经过大约4～7天的预培养，微藻生长到指数期，接种到9个培养基条件的培养基中，控制初始接种量为OD680＝0.2。接种前，需要在无菌条件下，对原藻液进行重悬、离心操作三次，洗去原培养基的营养物质，避免对实验后期测定造成影响。
步骤二：其中，一共有3种补料时间间隔：3天、6天和9天，3种pH条件：不调节pH、调节pH到7和调节pH到8，采用全因素分析法，加起来一共有9个培养基环境条件。
培养基选用以NH4HCO3为替代NaNO3的无氮BG11培养基，其中隔3天补料的条件下，NH4HCO3投加方式为：接种时加入124mg/L，其余124mg/L分8次(第3、6、9、12、15、18、21、24天)加入，每次添加15.5mg/L；隔6天补料的条件下，NH4HCO3投加方式为：接种时加入124mg/L，其余124mg/L分4次(第6、12、18、24天)加入，每次添加31mg/L；隔9天补料的条件下，NH4HCO3投加方式为：接种时加入124mg/L，其余124mg/L分2次(第9、18天)加入，每次添加62mg/L。在不同补料方式下，分别采取补料时不调节pH、调节pH到7和调节pH到8的实验方案。
步骤三：每隔三天测定一次OD680(与生物质浓度成正比)、pH、氨氮浓度，培养结束后，通过元素分析，测定固碳、蛋白质，结合溶液中氨氮浓度计算氮损失，测定培养基TIC浓度，分析无机碳走向，并测定多糖和油脂浓度。
在上述方案中，通过调节pH的操作，降低了溶液中pH，使得氨氮不易挥发，通过调节补料时间，让溶液中pH更加稳定，减少了氨氮的挥发，降低了微藻生长过程中的氨抑制。此外，补料时间和pH的调节，还可以促进溶液更大程度上处在适合微藻生长的稳定的生长环境和适宜的pH环境条件下。
所述光强实现条件为单排荧光灯侧面给光，每天24小时光照。
所述pH调节方式为补料时通过添加1mol/L盐酸或氢氧化钠进行调节。
所述氮源添加浓度的实现方式为，配置69.5g/L的NH4HCO3浓度，根据所需添加浓度计算添加到溶液中，保证添加体积对培养基体积影响不超过2％。
所述氨氮浓度的测定方法为纳氏试剂分光光度法，所述多糖浓度的测定方法为苯酚硫酸法，所述油脂测定方法为尼罗红染色法。
本实施例的具体结果，包括以下结果：
参见图1，藻株L38在调节pH的情况下，生物质含量均高于不调节pH的情况，此外，整体而言，补料时调节pH到8比调节pH到7的情况下生物质产量较高，前期每隔3d补料微藻生长快，但是6d以后隔6d补料生长较快；总体来说，pH调节到8，隔6d补料的条件下生物质最高，比不调节pH的条件下生物质提高了45％～65％。
参见图2，藻株L38随着生物质的增长，pH相对的也会出现增长。前期pH波动较大，后期变化较小。不调节pH的条件下，后期pH逐渐稳定在9.5～10.0之间，而调节pH的条件下，微藻pH可以稳定在其调节值附近，有效控制了pH值。可以说明，pH的调节，对减少氮损失是非常有效的。
参见图3，可以发现，不调节pH的情况下，溶液中氨氮浓度始终大幅度下降，且该条件下，微藻生物质生长最慢。到实验结束，溶液中剩余氨氮含量均低于60mg/L。而调节pH的条件下，pH调节到7比调节到8的条件下，氨氮剩余浓度较高，溶液中低pH值减少了氨氮挥发。
参见图4，溶液中pH调节越低的情况下，溶液中剩余的氨氮浓度越高，而损失到空气中的氨氮越少，不调节pH的条件下，氨氮损失最大，溶液中剩余含量最低。
参见图5，在微藻培养过程中调节pH大大降低了氮损失。而同时pH调节到7比调节到8的条件下，氮损失较低。当pH降到7时，隔3d补料的条件下氮损失最低，此时氮损失仅为19％，比不调节pH的条件下降低了59％。
参见图6，调节pH可以明显地提高固碳量，且pH调节到8比调节到7的固碳量高。不调节pH的条件下，固碳量仅为17mg/L/d，调节pH，隔6d补料的条件下，固碳量最高，为30mg/L/d。
参见图7，对于多糖含量，隔3d和6d补料的条件下，均为调节pH到8的情况下多糖产量最高，而pH调节到7次之。对于油脂含量，调节pH到7或者8，相比不调节pH的情况，微藻油脂产量明显下降。此外，对比3d和9d补料，6d补料的情况下油脂含量最高，可以达到18.6mg/L。从蛋白质产量的数据可以看出，pH的调节显著促进了蛋白质含量的积累。而pH调节到8的情况下，蛋白质含量比调节pH到7的条件下蛋白质含量略高。隔6天补料，调节pH到8的条件下蛋白质产量及占比均为最高，为269mg/L。

Claims (5)

1.基于pH调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法，其特征在于，通过氨水吸收CO2生成的NH4HCO3作为模拟吸收液，加入到微藻培养基中，作为营养物质供给微藻生长；
步骤1)预培养：
(1)用250mL锥形瓶盛装200mL培养基于121℃中高压蒸汽灭菌30min；
(2)待冷却后，进行微藻Chlorella sp.LAMB 38接种工作，整个过程在无菌操作台中进行；
(3)接种完成后，将锥形瓶放入30±1℃、6000Lux不间断光照的条件下培养，并以0.1vvm的速度向其中通入5％CO2+95N2组成的混合气，小球藻进行光合自养生长；
(4)经过大约4～7天的预培养，微藻生长进入指数期，进行接种工作，控制初始接种量为OD680＝0.2，进行正式培养实验；
步骤2)补料培养：
一共有3种补料时间间隔：3天、6天和9天；
3种pH条件：不调节pH、调节pH到7和调节pH到8；
采用全因素分析法，共有9个培养基环境条件；
培养基选用以NH4HCO3为替代NaNO3的无氮BG11培养基，其中隔3天补料的条件下，NH4HCO3投加方式为：接种时加入124mg/L，其余124mg/L分8次(第3、6、9、12、15、18、21、24天)加入，每次添加15.5mg/L；隔6天补料的条件下，NH4HCO3投加方式为：接种时加入124mg/L，其余124mg/L分4次(第6、12、18、24天)加入，每次添加31mg/L；隔9天补料的条件下，NH4HCO3投加方式为：接种时加入124mg/L，其余124mg/L分2次(第9、18天)加入，每次添加62mg/L；在不同补料方式下，分别采取补料时不调节pH、调节pH到7和调节pH到8。
步骤3)检测：每隔三天测定一次OD680(与生物质浓度成正比)、pH、氨氮浓度，培养结束后，通过元素分析，测定固碳、蛋白质，结合溶液中氨氮浓度计算氮损失，测定培养基TIC浓度，分析无机碳走向，并测定多糖和油脂浓度。
2.根据权利要求1所述的基于pH调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法，其特征在于，光强实现条件为单排荧光灯侧面给光，每天24小时光照。
3.根据权利要求1所述的基于pH调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法，其特征在于，pH调节方式为补料时通过添加1mol/L盐酸或氢氧化钠进行调节。
4.根据权利要求1所述的基于pH调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法，其特征在于，氮源添加浓度的实现方式为配置69.5g/L的NH4HCO3浓度，根据所需添加浓度计算添加到溶液中，保证添加体积对培养基体积影响不超过2％。
5.根据权利要求1所述的基于pH调控及利用NH4HCO3吸收液的微藻培养方法，其特征在于，所述氨氮浓度的测定方法为纳氏试剂分光光度法，所述多糖浓度的测定方法为苯酚硫酸法，所述油脂测定方法为尼罗红染色法。
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