CN106399111A - 一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法，包括以下步骤：先将藻种接种于种子培养基培养成种子液，再接种于装有发酵培养基的光生物反应器中培养，控制初始光照强度为60~300μmol/m2/s，之后光照强度每12小时提高50~150μmol/m2/s，直至发酵结束；同时在初始氮源浓度开始耗尽时，开始恒速流加氮浓度为2‑14 g/L的氮源，流加速度为1~10 mg/L/h，发酵周期4~6天。采用本发明方法培养的微藻生物量浓度可达4~9 g/L，叶黄素产量20~60 mg/L，碳水化合物产量1.4~3.3 g/L，且发酵周期短，生产工艺简单，生产成本低，能够显著提高采用微藻同时生产叶黄素和生物燃料的工业化前景。

Description

一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法
技术领域
本发明涉及一种自养培养微藻的发酵工艺，具体涉及一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法。
背景技术
微藻具有光合作用效率高、生长速率快等特点，在某些特定培养条件下，微藻还可改变其细胞组成成分，从而高效积累某一细胞产物，如蛋白质、碳水化合物、油脂或色素等。其中，微藻碳水化合物和油脂可分别用作生物酒精发酵的原料和生物柴油的生产。然而，目前在微藻生物燃料应用方面，单一细胞成分（碳水化合物或油脂）的开发利用在经济上还是不可行的。
叶黄素是一种含氧的类胡萝卜素，由于具有较强的抗氧化和抗炎作用，被广泛应用于食品、饲料添加剂、医药和保健品等行业，而微藻则被认为是商业叶黄素的新兴来源（Fernandez-Sevilla JM, Fernandez FGA, Grima EM. Biotechnological productionof lutein and its applications [J]. Appl. Microbiol. Biot., 2010, 86(1): 27-40）。已有研究表明，在使用微藻粗油进行生物柴油制备过程中，可同步进行微藻叶黄素的耦合生产（Prommuak C, Pavasant P, Quitain A T, et al. Simultaneous productionof biodiesel and free lutein from Chlorella vulgaris [J]. Chem. Eng.Technol., 2013, 36(5): 733-739）。此外，也有研究者致力于将提完粗油后的藻渣（富含碳水化合物）用作生物乙醇发酵的原料（Lee OK, Oh YK, Lee EY. Bioethanolproduction from carbogydrate-enriched residual biomass obtained after lipidextraction of Chlorella sp. KR-1 [J]. Bioresour. Technol., 2015, 196: 22-27）。为减少微藻生物燃料的开发利用成本，对微藻细胞进行多组分综合利用，以及耦合生产高附加值产品，已是微藻生物精炼的发展趋势（Markou G, Nerantzis E. Microalgae forhigh-value compounds and biofuels production: A review with focus oncultivation under stress conditions [J]. Biotechnol. Adv., 2013, 31(8): 1532-1542）。截至目前，已有较多文献集中于微藻细胞单一成分（如叶黄素、蛋白质、油脂或碳水化合物等）的生产研究，而对微藻培养可同时积累多种附加产物的研究还鲜有报道。Araya等（Araya B, Gouveia L, Nobre B, et al. Evaluation of the SimultaneousProduction of Lutein and Lipids Using a Vertical Alveolar Panel Bioreactorfor Three Chlorella species [J]. Algal Res., 2014, 6: 218-222）考察了小球藻同时生产叶黄素和油脂的情况，发现其中Chlorella vulgaris 1803的叶黄素产率和油脂产率可分别达0.51 mg/L/d和11.12 mg/L/d，而Chlorella zofingiensis B 32的叶黄素产率和油脂产率分别为0.53 mg/L/d和10.95 mg/L/d。Dineshkumar等（Dineshkumar R, DashSK, Sen R. Process integration for microalgal lutein and biodiesel productionwith concomitant flue gas CO2 sequestration: a biorefinery model forhealthcare, energy and environment [J]. RSC Adv., 2015, 5(90): 73381-73394）通过人工神经网络建模优化小球藻Chlorella minutissima同时生产叶黄素和油脂的培养条件，最终其最高叶黄素产率和油脂产率可分别达4.32 mg/L/d和142.2 mg/L/d。然而，由于微藻叶黄素积累需在氮源非限制条件下，而碳水化合物或油脂积累则需在氮源限制条件下，因此微藻叶黄素积累与碳水化合物或油脂积累往往存在相悖的技术问题。目前为止，尚没有一种成熟的培养方法可以同步提高微藻的叶黄素产量和碳水化合物产量。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种自养培养微藻的发酵工艺，通过自养微藻可同步提高其叶黄素和碳水化合物产量。采用该发酵工艺，有利于提高微藻叶黄素含量和碳水化合物含量，能够在较短发酵周期内同步实现微藻叶黄素和碳水化合物的高产量积累，从而降低生产成本，可为微藻生物燃料和叶黄素的耦合生产提供一种新方法。
本发明的技术方案包括以下步骤：
1）种子培养：从固体平板上刮取藻种接种于装有种子培养基的光生物反应器中，控制反应器中藻细胞初始浓度为5~75 mg/L，培养过程中，温度控制在25~35℃，光照强度控制在150~900 μmol/m2/s，在所通气体中二氧化碳浓度保持在0.03~10%，通气量控制在0.01~0.5VVM，培养3~7天。
2）发酵培养：将步骤1）的种子，以1~10% (v/v)的接种量接入装有发酵培养基的光生物反应器中，发酵过程中，温度控制在25~35℃，在所通气体中二氧化碳浓度保持在0.03~10%，通气量控制在0.01~0.5 VVM；初始光照强度控制在60~300 μmol/m2/s，之后光照强度每12小时提高50~150 μmol/m2/s，直至发酵结束。同时待发酵培养基中初始氮源浓度降至0~10 mg/L时，开始恒速流加氮浓度为2-14 g/L的氮源，流加速度为1~10 mg/L/h；发酵周期4~6天，生物量浓度4~9 g/L，叶黄素产量20~60 mg/L，碳水化合物产量1.4~3.3 g/L。
在步骤1）中，种子培养基组成为硝酸钠0.5~1.5 g/L，磷酸氢二钾0.0183~0.183g/L，七水硫酸镁0.035~0.350 g/L，二水氯化钙0.015~0.150 g/L，磷酸二氢钾0.048~0.480g/L，氯化钠0.015~0.150 g/L，六水氯化铁0.770~7.770 mg/L，乙二胺四乙酸二钠0.440~10.250 mg/L，七水硫酸锌0.025~0.250 mg/L，七水硫酸钴0.016~0.160 mg/L，五水硫酸锰0.184~1.840 mg/L。
在步骤2）中，发酵培养基组成为初始氮浓度30~200 mg/L，氯化钠0.015~0.150 g/L，二水氯化钙0.015~0.150 g/L，七水硫酸镁0.025~0.250 g/L，碳酸氢钠0.025~2.5 g/L，磷酸氢二钾0.035~0.350 g/L，磷酸二氢钾0.075~0.750 g/L，六水氯化铁0.002~0.050 g/L，硼酸0.011~0.110 mg/L，七水硫酸锰0.069 ~0.690 mg/L，七水硫酸锌0.187~1.870 mg/L，二水钼酸铵0.00124~0.0124 mg/L，无水硫酸铜0.0025~0.025 mg/L。
在步骤2）中，发酵培养基的初始氮源种类为硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵、硝酸铵、尿素中的一种。
在步骤2）中，流加氮源的种类为硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵、硝酸铵、尿素中的一种。
上述一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法中，所述光生物反应器为封闭式的平板式光生物反应器、柱式光生物反应器或管道式光生物反应器。
上述一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法中，所述藻种为小球藻属微藻。
本发明的显著优点在于：本发明充分利用了微藻叶黄素和碳水化合物生物合成的特点，通过逐步提高光照强度、以及恒速流加维持发酵液中氮源浓度的发酵方式，可同步实现微藻叶黄素和碳水化合物的高产量积累，且发酵周期短，生产成本低，生产工艺简单。同时该方法还适用于对各种小球藻进行叶黄素或碳水化合物生产方法的改进，能够显著提高利用小球藻同时生产叶黄素和生物燃料的工业化前景，可为后续开发低成本的微藻生物精炼技术提供一条新途径。
附图说明
图1为实施例1中20 L柱状光生物反应器中小球藻生物量浓度、氮源浓度、叶黄素产量和碳水化合物产量的变化趋势图。
图2为实施例1中小球藻类胡萝卜素组成的HPLC图谱。
图3为实施例1中小球藻碳水化合物组成的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实验，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明具体实施方式中采用的微藻均为小球藻（Chlorella sorokiniana），购自中科院水生生物研究所淡水藻种库，编号为FACHB-275。
实施例1
1）种子培养：从固体平板上刮取藻种，接种于装有900 mL种子培养基的1 L柱状光生物反应器中，控制反应器中藻细胞初始浓度为15 mg/L，培养过程中，温度控制在26℃，光照强度控制在600 μmol/m2/s，在所通气体中二氧化碳浓度保持在2.5%，通气量控制在0.2 VVM，培养4天。种子培养基组成为硝酸钠0.75 g/L，磷酸氢二钾0.0383 g/L，七水硫酸镁0.075g/L，二水氯化钙0.025 g/L，磷酸二氢钾0.088 g/L，氯化钠0.025 g/L，六水氯化铁1.770mg/L，乙二胺四乙酸二钠5.500 mg/L，七水硫酸锌0.073 mg/L，七水硫酸钴0.016 mg/L，五水硫酸锰0.584 mg/L。
2）发酵培养：将步骤1）的种子，以5% (v/v)的接种量接入装有16 L发酵培养基的20 L柱状光生物反应器中，发酵过程中，温度控制在26℃，在所通气体中二氧化碳浓度保持在2.5%，通气量控制在0.2 VVM；初始光照强度控制在150 μmol/m2/s，之后光照强度每12小时提高100 μmol/m2/s，直至发酵结束。同时待发酵培养基中初始氮源浓度降至0 mg/L时，开始恒速流加氮浓度为12 g/L的硝酸钠，流加速度为2.0 mg/L/h；发酵培养基组成为硝酸钠0.75 g/L，氯化钠0.025 g/L，二水氯化钙0.025 g/L，七水硫酸镁0.075 g/L，碳酸氢钠0.025 g/L，磷酸氢二钾0.075 g/L，磷酸二氢钾0.175 g/L，六水氯化铁0.005 g/L，硼酸0.061 mg/L，七水硫酸锰0.169 mg/L，七水硫酸锌0.287 mg/L，二水钼酸铵0.00124 mg/L，无水硫酸铜0.0025 mg/L。
在整个发酵培养过程中，每隔一定时间取样测定生物量浓度、叶黄素含量和碳水化合物含量。生物量浓度采用细胞干重法测定，叶黄素含量和类胡萝卜素组成通过HPLC测定，碳水化合物含量及其组成通过HPLC测定。由图1的发酵过程曲线可知，通过发酵培养5天，微藻生物量浓度可达4.0 g/L，叶黄素产量为20 mg/L，碳水化合物产量为1.4 g/L。
藻体胡萝卜素组成的HPLC图谱见图2，通过与相应标准品的HPLC保留时间进行比较，可确定类胡萝卜素组成主要为紫黄素、新黄素、叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，其中叶黄素含量可占总类胡萝卜素含量约60%。
藻体碳水化合物组成的HPLC图谱见图3，通过与相应标准品的HPLC保留时间进行比较，可确定碳水化合物组成主要为葡萄糖，可占总碳水化合物含量约80%。
实施例2
1）种子培养：从固体平板上刮取藻种，接种于装有900 mL种子培养基的1 L柱状光生物反应器中，控制反应器中藻细胞初始浓度为75 mg/L，培养过程中，温度控制在30℃，光照强度控制在900 μmol/m2/s，在所通气体中二氧化碳浓度保持在1.0%，通气量控制在0.5 VVM，培养3天。种子培养基组成为硝酸钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.0183 g/L，七水硫酸镁0.035 g/L，二水氯化钙0.015 g/L，磷酸二氢钾0.048 g/L，氯化钠0.015 g/L，六水氯化铁0.770 mg/L，乙二胺四乙酸二钠0.44 mg/L，七水硫酸锌0.025 mg/L，七水硫酸钴0.016 mg/L，五水硫酸锰0.184 mg/L。
2）发酵培养：将步骤1）的种子，以1% (v/v)的接种量接入装有16 L发酵培养基的20 L柱状光生物反应器中，发酵过程中，温度控制在30℃，在所通气体中二氧化碳浓度保持在1.0%，通气量控制在0.5 VVM；初始光照强度控制在50 μmol/m2/s，之后光照强度每12小时提高50 μmol/m2/s，直至发酵结束。同时待发酵培养基中初始氮源浓度降至0 mg/L时，开始恒速流加氮浓度为2 g/L的氯化铵，流加速度为10 mg/L/h；发酵培养基组成为氯化铵0.47 g/L，氯化钠0.015 g/L，二水氯化钙0.015 g/L，七水硫酸镁0.025 g/L，碳酸氢钠1.26g/L，磷酸氢二钾0.035 g/L，磷酸二氢钾0.075 g/L，六水氯化铁0.002 g/L，硼酸0.011 mg/L，七水硫酸锰0.069 mg/L，七水硫酸锌0.187 mg/L，二水钼酸铵0.00124 mg/L，无水硫酸铜0.0025 mg/L。
检测方法同实施例1。发酵培养6 天，微藻生物量浓度可达4.0 g/L，叶黄素产量为25.2 mg/L，碳水化合物产量为1.60 g/L。
实施例3
1）种子培养：从固体平板上刮取藻种，接种于装有900 mL种子培养基的1 L柱状光生物反应器中，控制反应器中藻细胞初始浓度为15 mg/L，培养过程中，温度控制在28℃，光照强度控制在600 μmol/m2/s，在所通气体中二氧化碳浓度保持在3.0%，通气量控制在0.2 VVM，培养4天。种子培养基组成为硝酸钠0.75 g/L，磷酸氢二钾0.0383 g/L，七水硫酸镁0.075g/L，二水氯化钙0.025 g/L，磷酸二氢钾0.088 g/L，氯化钠0.025 g/L，六水氯化铁1.770mg/L，乙二胺四乙酸二钠5.500 mg/L，七水硫酸锌0.073 mg/L，七水硫酸钴0.016 mg/L，五水硫酸锰0.584 mg/L。
2）发酵培养：将步骤1）的种子，以7% (v/v)的接种量接入装有16 L发酵培养基的20 L平板式光生物反应器中，发酵过程中，温度控制在28℃，在所通气体中二氧化碳浓度保持在3.0%，通气量控制在0.2 VVM；初始光照强度控制在150 μmol/m2/s，之后光照强度每12小时提高100 μmol/m2/s，直至发酵结束。同时待发酵培养基中初始氮源浓度降至5 mg/L时，开始恒速流加氮浓度为12 g/L的氯化铵，流加速度为4 mg/L/h；发酵培养基组成为氯化铵0.47 g/L，氯化钠0.025 g/L，二水氯化钙0.035 g/L，七水硫酸镁0.125 g/L，碳酸氢钠1.68 g/L，磷酸氢二钾0.125 g/L，磷酸二氢钾0.300 g/L，六水氯化铁0.005 g/L，硼酸0.061 mg/L，七水硫酸锰0.169 mg/L，七水硫酸锌0.287 mg/L，二水钼酸铵0.00124 mg/L，无水硫酸铜0.0025 mg/L。
检测方法同实施例1。发酵培养5 天，微藻生物量浓度可达7 g/L，叶黄素产量为42mg/L，碳水化合物产量为2.5 g/L。
实施例4
1）种子培养：从固体平板上刮取藻种，接种于装有900 mL种子培养基的1 L柱状光生物反应器中，控制反应器中藻细胞初始浓度为5 mg/L，培养过程中，温度控制在32℃，光照强度控制在150 μmol/m2/s，在所通气体中二氧化碳浓度保持在10%，通气量控制在0.04 VVM，培养7天。种子培养基组成为硝酸钠1.5 g/L，磷酸氢二钾0.183 g/L，七水硫酸镁0.30 g/L，二水氯化钙0.15 g/L，磷酸二氢钾0.30 g/L，氯化钠0.15 g/L，六水氯化铁5.770 mg/L，乙二胺四乙酸二钠9.500 mg/L，七水硫酸锌0.250 mg/L，七水硫酸钴0.160 mg/L，五水硫酸锰1.80 mg/L。
2）发酵培养：将步骤1）的种子，以10% (v/v)的接种量接入装有16 L发酵培养基的20 L平板式光生物反应器中，发酵过程中，温度控制在32℃，在所通气体中二氧化碳浓度保持在10%，通气量控制在0.04 VVM；初始光照强度控制在300 μmol/m2/s，之后光照强度每12小时提高150 μmol/m2/s，直至发酵结束。同时待发酵培养基中初始氮源浓度降至10 mg/L时，开始恒速流加氮浓度为14 g/L的氯化铵，流加速度为4 mg/L/h；发酵培养基组成为氯化铵0.47 g/L，氯化钠0.15 g/L，二水氯化钙0.15 g/L，七水硫酸镁0.125 g/L，碳酸氢钠1.68g/L，磷酸氢二钾0.125 g/L，磷酸二氢钾0.300 g/L，六水氯化铁0.05 g/L，硼酸0.110 mg/L，七水硫酸锰0.669 mg/L，七水硫酸锌1.500 mg/L，二水钼酸铵0.0124 mg/L，无水硫酸铜0.025 mg/L。
检测方法同实施例1。发酵培养4 天，微藻生物量浓度可达5 g/L，叶黄素产量为30mg/L，碳水化合物产量为1.5 g/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）种子培养：从固体平板上刮取藻种接种于装有种子培养基的光生物反应器中，控制反应器中藻细胞初始浓度为5~75 mg/L，培养过程中，温度控制在25~35℃，光照强度控制在150~900 μmol/m2/s，在所通气体中二氧化碳浓度保持在0.03~10%，通气量控制在0.01~0.5VVM，培养3~7天；
2）发酵培养：将步骤1）的种子，以1~10%vol的接种量接入装有发酵培养基的光生物反应器中，发酵过程中，温度控制在25~35℃，在所通气体中二氧化碳浓度保持在0.03~10%，通气量控制在0.01~0.5 VVM；初始光照强度控制在60~300 μmol/m2/s，之后光照强度每12小时提高50~150 μmol/m2/s，直至发酵结束；同时待发酵培养基中初始氮源浓度降至0~10mg/L时，开始恒速流加氮浓度为2-14 g/L的氮源，流加速度为1~10 mg/L/h；发酵周期4~6天，生物量浓度4~9 g/L，叶黄素产量20~60 mg/L，碳水化合物产量1.4~3.3 g/L。
2.如权利要求1所述的一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法，其特征在于在步骤1）中，种子培养基组成为：硝酸钠0.5~1.5 g/L，磷酸氢二钾0.0183~0.183g/L，七水硫酸镁0.035~0.350 g/L，二水氯化钙0.015~0.150 g/L，磷酸二氢钾0.048~0.480g/L，氯化钠0.015~0.150 g/L，六水氯化铁0.770~7.770 mg/L，乙二胺四乙酸二钠0.440~10.250 mg/L，七水硫酸锌0.025~0.250 mg/L，七水硫酸钴0.016~0.160 mg/L，五水硫酸锰0.184~1.84 mg/L。
3.如权利要求1所述的一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法，其特征在于在步骤2）中，发酵培养基组成为：初始氮浓度30~200 mg/L，氯化钠0.015~0.150g/L，二水氯化钙0.015~0.150 g/L，七水硫酸镁0.025~0.250 g/L，碳酸氢钠0.025~2.5 g/L，磷酸氢二钾0.035~0.350 g/L，磷酸二氢钾0.075~0.750 g/L，六水氯化铁0.002~0.050g/L，硼酸0.011~0.110 mg/L，七水硫酸锰0.069 ~0.690 mg/L，七水硫酸锌0.187~1.870mg/L，二水钼酸铵0.00124~0.0124 mg/L，无水硫酸铜0.0025~0.025 mg/L。
4.如权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于所述初始氮源种类为硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵、硝酸铵、尿素中的一种。
5.如权利要求1所述的一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法，其特征在于在步骤2）中，流加氮源的种类为硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵、硝酸铵、尿素中的一种。
6.如权利要求1所述的一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法，其特征在于所述光生物反应器为封闭式的平板式光生物反应器、柱式光生物反应器或管道式光生物反应器。
7.如权利要求1所述的一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法，其特征在于所述微藻为小球藻属藻种。
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