CN104152357A - 同时提高小球藻中叶绿素和蛋白质含量的高密度培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种小球藻高密度培养方法，包括如下步骤，(1)将活化后的小球藻进行连续光照培养，使其处于对数生长期；(2)将步骤(1)中处于对数生长期的小球藻培养液作为种子液，将其接入异养发酵容器中在黑暗条件下进行异养培养，培养温度为28～35℃，培养时间为3～5天，异养发酵容器中所用培养基其碳氮比为28.4～113.4；(3)将小球藻培养液稀释至小球藻细胞密度高达10～20 g/L，向小球藻培养液中加入氮源，使小球藻培养液中含有14.7～88.2 mmol/L的氮元素，再对小球藻进行光诱导培养，培养温度为28～35℃，培养时间为1～3天。该培养方法能同时提高小球藻中蛋白质和叶绿素含量。
Description
技术领域
本发明涉及小球藻培养方法，属于微藻生物技术领域，特别涉及一种同时提高小球藻中叶绿素和蛋白质含量的诱导高密度培养方法。
背景技术
小球藻是小球藻属的单细胞绿藻，小球藻生长速度快，蛋白质含量高，氨基酸组分齐全，能提供人和动物生长所需的必需氨基酸，经大规模培养用作健康食品或水产养殖饵料。小球藻作为一种新型蛋白资源，在毒性检测和动物实验中尚未发现任何不良反应。小球藻中含有色素、矿物质、维他命和微量元素，是一种与传统蛋白质资源品质相当甚至优于传统蛋白质资源的高价值蛋白质资源。微藻蛋白质的含量是微藻营养价值的主要决定因素(PaulineSpolaore,Claire Joannis-Cassan,Elie Duran et al.Commercial applications of microalgae[J].Journalof Bioscience and Bioengineering,2006,101(2):87-96)。在各个种类微藻中，小球藻其叶绿素含量高，能作为天然色素添加剂应用于食品加工行业。并且有研究表明，叶绿素具有抗胃溃疡活性、抗过敏活性、抗脑血管疾病活性等药学效应，能用作药用原料(Nakanishi Koichi.Chlorophyll rich and salt resistant Chlorella.European Patent 1142985[P]2001,10,10)，叶绿素还能作为色素原料应用于化妆品行业。
小球藻的大规模生产大都采用光合自养方式，主要有开放式水池培养和管道式生物反应器两种系统。开放式水池培养具有设备简单，生产投入资金低等优势，但是由于光照、温度、pH等生长条件不可控，容易受外来生物及杂藻的污染，导致生物量浓度低，加大了采收难度并提高了采收成本。管道式生物反应器虽然提高了小球藻的受光效率并能有效控制小球藻的生长条件，但是设备投资成本高，最大的生物量浓度依然偏低。
目前，异养培养的小球藻存在蛋白质和叶绿素含量低、油脂含量高的特点，不适宜用于健康食品或水产养殖。当前，研究者热衷于利用异养培养提高小球藻油脂含量来生产油脂制备生物柴油或者利用异养培养生产类胡萝卜素及其衍生物。而对于如何改善异养生产的小球藻的细胞组分以使其具备高细胞密度、高蛋白质含量和高叶绿素含量的生产优势，还未见相关报道。
发明内容
本发明为弥补现有技术的不足，提供一种同时提高小球藻中蛋白质和叶绿素含量的小球藻高密度培养方法。
本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：一种同时提高小球藻中叶绿素和蛋白质含量的高密度培养方法，包括如下步骤，
(1)将活化后的小球藻进行连续光照培养，使其处于对数生长期；
(2)将步骤(1)中处于对数生长期的小球藻培养液作为种子液，将其接入异养发酵容器中在黑暗条件下进行异养培养(种子液具体可以按照8％～40％的体积接种量进行接种)，培养温度为28～35℃，培养时间为3～5天，异养发酵容器中所用培养基其碳氮比为28.4～113.4。
(3)将经过步骤(2)培养获得的小球藻培养液稀释至小球藻细胞密度高达10～20 g/L，向小球藻培养液中加入氮源，使小球藻培养液中含有14.7～88.2 mmol/L的氮元素，再对小球藻进行光诱导培养，培养温度为28～35℃，培养时间为1～3天。对步骤(2)培养获得的小球藻培养液进行稀释具体可以用Basal培养基来稀释。
步骤(3)中，向小球藻培养液中加入氮源，使小球藻培养液中含有14.7～88.2 mmol/L的氮元素，在此范围内有利于在短时间内实现蛋白质和叶绿素最大速度的积累，小球藻的蛋白质含量和叶绿素含量分别可在较短时间内达到30％以上、及1.5％以上的水平，达到光自养细胞状态下蛋白质和叶绿素的自然含量。较为优选的，步骤(3)中，向小球藻培养液中加入氮源，使小球藻培养液中含有44.1～88.2 mmol/L的氮元素，在优选条件下，小球藻的蛋白质含量和叶绿素含量分别可在较短时间内提高到53％以上、及3％以上的水平。
进一步的，步骤(2)中，异养发酵容器中所用培养基其配方由如下含量的各组分组成：KH2PO4 1200～1300 mg/L、MgSO4·7H2O 950～1050 mg/L、EDTA-2Na 450～550 mg/L、H3BO3110～120 mg/L、CaCl2·2H2O 105～120 mg/L、FeSO4·7H2O 45～55 mg/L、ZnSO4·7H2O 85～90 mg/L、MnCl2·4H2O 12～16 mg/L、MoO3 6.5～7.5 mg/L、CuSO4·5H2O 15.5～16 mg/L、(CoNO3)2·6H2O4.5～5.5 mg/L、培养基中还添加有碳源和氮源，其中所述碳源其在培养基中的含量以使培养基中含有0.03～0.33 mol/L的碳元素为准，所述氮源其在培养基中的含量以使培养基的碳氮比保持在28.4～113.4为准。本发明在步骤(2)的异养阶段，通过调控异养阶段培养基的碳氮比为28.4～113.4，可使小球藻达到高生物量浓度、高蛋白质含量和高叶绿素含量，形成有利于后期光诱导的平台。步骤(2)培养基中的碳氮比进一步优选为28.4～38，最优选为28.4，在优选条件下，异养阶段，小球藻的生物量浓度可达到20g/L以上，蛋白质和叶绿素含量也分别可提高到17％以上、及0.6％以上。
优选的，步骤(2)中，异养发酵容器中所用培养基为改良的Basal培养基，其配方由如下浓度的各组分组成：KH2PO41250 mg/L、MgSO4·7H2O 1000 mg/L、EDTA-2Na 500 mg/L、H3BO3 114.2 mg/L、CaCl2·2H2O 111 mg/L、FeSO4·7H2O 49.8 mg/L、ZnSO4·7H2O 88.2 mg/L、MnCl2·4H2O 14.2 mg/L、MoO37.1 mg/L、CuSO4·5H2O 15.7 mg/L、(CoNO3)2·6H2O 4.9 mg/L、培养基中还添加有碳源和氮源，其中所述碳源其在培养基中的含量以使培养基中含有0.03～0.33mol/L的碳元素为准，所述氮源其在培养基中的含量以使培养基的碳氮比保持在28.4～113.4为准。培养基中碳元素浓度进一步可优选为0.25～0.33 mol/L，更优选为0.27～0.28mol/L(例如向培养基中添加葡萄糖50g/L)。
进一步的，步骤(2)中所用培养基，其所加氮源为有机氮源或无机氮源，所述氮源可选自硝酸钠、尿素、硝酸钾、氨水、碳酸氢铵、硫酸铵、硝酸铵等，所加碳源为有机碳源，所述有机碳源可选自葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉糖、木质纤维素水解物等。
进一步的，步骤(3)中向小球藻培养液中加入的氮源为无机氮源，所述无机氮源选自硝酸钠、硝酸钾、碳酸氢铵、硝酸铵、氨水、硫酸铵等。
优选的，步骤(3)中，所述光诱导培养为间歇光照培养，光照强度为2000 lux～20000 lux。
更为优选的，步骤(3)中，进行间歇光照培养的光暗周期为12h/12h。
优选的，步骤(1)中，对小球藻进行光照培养所用的培养基为添加有5～15 g/L葡萄糖的Basal培养基，连续光照培养3～6天。
Basal培养基其配方为：1L水中含有KH2PO41250 mg，MgSO4·7H2O 1000 mg，EDTA-2Na500 mg，H3BO3 114.2 mg，CaCl2·2H2O 111 mg，FeSO4·7H2O 49.8 mg，ZnSO4·7H2O 88.2 mg，MnCl2·4H2O 14.2 mg，MoO3 7.1 mg，CuSO4·5H2O 15.7 mg，(CoNO3)2·6H2O 4.9 mg。
步骤(2)中所述的异养发酵容器选自摇瓶、发酵罐或生物反应器；步骤(3)的光诱导培养在摇瓶、开放式跑道池、圆池或封闭式的光生物反应器中进行，步骤(1)和/或步骤(3)所用的光源为自然光或者人工光。
所述小球藻选自绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)等可发酵培养的小球藻。
本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
1、本发明结合小球藻异养培养的高生物量优势和光自养培养的高蛋白质和高叶绿素含量的优势，提供一种同时提高小球藻中蛋白质和叶绿素含量的高密度诱导培养方法。该方法基于构建有利于光自养阶段小球藻快速恢复光自养能力的异养培养平台，相对快速提高异养阶段细胞的蛋白质含量和叶绿素含量，实现高细胞密度的异养种子液在光诱导条件下高效积累蛋白质和叶绿素。采用本发明的小球藻高密度培养方法，既能保持小球藻的高细胞密度状态，又能获得高含量蛋白质和叶绿素，为小球藻作为蛋白质资源、饲料蛋白资源和天然色素的工业化生产提供了高效的培养方法。
2、本发明在步骤(2)的异养阶段，通过调控异养阶段培养基的碳氮比，使小球藻达到高生物量浓度，形成有利于后期光诱导的平台。
3、本发明通过调节异养培养的碳氮比，构建异养阶段高细胞密度、相对富含蛋白质和叶绿素的物质平台，为光合作用储备了叶绿素，缩短了小球藻由异养状态转为光自养状态的适应周期，能使小球藻快速进入光自养状态；在相对富含蛋白质和叶绿素的基础上进一步调节光自养阶段氮源供给量，促使小球藻高效积累蛋白质和叶绿素，大大缩短了小球藻的光诱导时间。
4、本发明通过优化异养阶段的碳氮比，在小球藻的细胞干重浓度高达21.45g/l的状态下，蛋白质含量和叶绿素含量分别为22.98％和0.91％，而未经优化的异养培养基培养下，小球藻的细胞干重浓度为13.64g/l，对应的蛋白质含量和叶绿素含量分别为7.77％和0.10％。经过进一步光照培养，在起始细胞密度为11.09g/l的光诱导条件培养48h后，小球藻的生物量浓度为8.5g/l，同时获得了最高蛋白质含量54.10％和最高叶绿素含量3.14％。
5、本发明用异养发酵的方式获得高细胞浓度的小球藻培养液，其生长周期短，能实现自动化，藻种重现性好；光诱导培养阶段的起始细胞密度高，光诱导时间短，蛋白质含量和叶绿素含量高。本方法大大缩短了生产周期，提高了生产效率。
6、本发明在光诱导培养阶段，其起始细胞密度高，在高细胞密度下进行小球藻的光诱导培养，从而使得异养阶段获得的高细胞密度的种子液不用稀释太多倍数，从而大大减少了下游采收的压力，能很大程度上降低小球藻规模化生产的成本。光诱导的起始细胞密度高，在光自养阶段具有种群优势，能有效抵御细菌污染或杂藻污染，对环境耐受能力强，提高了藻液纯度。
大量分析本发明诸多实施例中蛋白质含量和叶绿素含量的关系，发现在异养阶段和光诱导自养阶段，小球藻的蛋白质含量和叶绿素含量具有正相关性，参见图7，这为实际生产中实时监控藻液品质提供了快速评价的方法依据。
附图说明
图1是实施例1～4中，在不同碳氮比的异养培养基下生长的蛋白核小球藻的生物量浓度变化趋势图，图中所示的数字28.4、37.8、56.7、113.4均为碳氮比；
图2是实施例1～4中，在不同碳氮比的异养培养基下生长的蛋白核小球藻的蛋白质含量变化趋势图，图中所示的数字28.4、37.8、56.7、113.4均为碳氮比；
图3是实施例1～4中，在不同碳氮比的异养培养基下生长的蛋白核小球藻的叶绿素含量变化趋势图，图中所示的数字28.4、37.8、56.7、113.4均为碳氮比；
图4是实施例5～10中，在不同氮源浓度的光诱导培养下生长的蛋白核小球藻的蛋白质含量变化趋势图，图中所示的14.7、29.4、44.1、58.8、73.5、88.2 mmol/L均为氮元素浓度；
图5是实施例5～10中，在不同氮源浓度的光诱导培养下生长的蛋白核小球藻的叶绿素含量变化趋势图，图中所示的14.7、29.4、44.1、58.8、73.5、88.2 mmol/L均为氮元素浓度；
图6是实施例11中，蛋白核小球藻在5L玻璃发酵罐中进行光诱导下蛋白质含量和叶绿素含量变化趋势图；
图7是各实施例中蛋白质含量和叶绿素含量的正相关关系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明：
本发明中，各个实施例选用的藻种均为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，由北京大学陈峰教授惠赠。
实施例1：
按如下步骤培养蛋白核小球藻：
(1)将活化后的蛋白核小球藻接种于装有100ml Basal培养基(含10g/l葡萄糖)的250 ml三角瓶中，在28±1℃、2000 lux、130 r/m条件下连续光照培养6天，使其处于对数生长期；
(2)将步骤(1)中获得的种子液按8％(v/v)接种量接入含有装液量为50 ml培养基的250ml三角瓶中，起始生物量浓度为0.25±0.05g/l。其中，培养基其配方为：KH2PO4 1250 mg/L、MgSO4·7H2O 1000 mg/L、EDTA-2Na 500 mg/L、H3BO3 114.2mg/L、CaCl2·2H2O 111mg/L、FeSO4·7H2O 49.8 mg/L、ZnSO4·7H2O 88.2 mg/L、MnCl2·4H2O 14.2mg/L、MoO3 7.1mg/L、CuSO4·5H2O 15.7 mg/L、(CoNO3)2·6H2O 4.9 mg/L、同时在Basal培养基中添加葡萄糖和硝酸钠，葡萄糖添加量为50g/L(培养基中碳元素的摩尔浓度约为0.28mol/L)，硝酸钠的添加量以使培养基中碳氮比为113.4为准。将三角瓶置于黑暗控温摇床中，温度为28±1℃，转速为160r/m，pH为6.1±0.1。异养培养5天。每天取样4 ml藻液，离心洗涤后在70℃烘干至恒重称干重，剩余藻液离心洗涤后冷冻干燥，用于测试蛋白质和叶绿素的含量。
蛋白质测定方法：准确称取40mg冷冻干燥至恒重的蛋白核小球藻藻粉，放入FOSS公司KJELTECTM2300型半自动凯氏定氮仪配套消化管中，加入10ml浓硫酸于消化管中，再加入催化剂片剂，放入消化炉，420℃消化2h，待消解液冷却后放入已去除空白的凯氏定氮仪中测量蛋白质含量。
叶绿素测定方法：准确称取10mg冷冻干燥后至恒重的蛋白核小球藻藻粉，放入10ml螺口刻度试管中，加入90％乙醇溶液，用锡纸包裹试管，超声2min后放入4℃冰箱，如此反复提取至藻粉无色，在4000r/m、4℃下离心10min。取上清并定容至10ml，用紫外可见分光光度计测量其在648nm和664nm下的吸光值，计算出叶绿素含量。
实施例2～4
实施例2～4与实施例1均基本相同，不同点在于步骤(2)中所用培养基的碳氮比不同，实施例2～4中步骤(2)所用培养基的碳氮比分别为56.7、37.8、28.4。
实施例1～4培养效果分析：
由图1所示，在葡萄糖浓度为50g/l，培养基碳氮比范围为28.4～113.4的范围内，随着碳氮比的下降，蛋白核小球藻最大生物量浓度呈增加趋势。实施例1～4获得的最大生物量浓度分别为13.64g/l、20.01g/l、20.31g/l、21.45g/l，在实施例4中获得的最大生物量浓度最高。由图2和图3可以看出，种子液接种于培养基进行异养培养后的第一天，蛋白核小球藻由光能自养生长变为异养生长，蛋白质含量和叶绿素含量骤然下降。对比实施例1～4可知，蛋白质含量和叶绿素含量随着碳氮比的降低而增加，实施例1中，蛋白质和叶绿素含量一直降低，而实施例4中的蛋白质和叶绿素含量在后期培养过程中会增加。实施例1的最终蛋白质含量和叶绿素含量为7.77％和0.10％，实施例2的最终蛋白质含量和叶绿素含量为12.41％和0.32％，实施例3的最终蛋白质含量和叶绿素含量为17.07％和0.63％，实施例4的最终蛋白质含量和叶绿素含量为22.98％和0.91％。由实施例1～4的结果可以看出，异养阶段培养基中碳氮比的优化，不仅能在异养阶段实现高生物量浓度，还能相对提高蛋白质含量和叶绿素含量，构建有利于光诱导进一步提高蛋白质和叶绿素含量的种子液平台。在实施例1-4中，可以看出碳氮比为28.4和碳氮比为37.8的实施例在生物量干重上几乎没有差异，但碳氮比为28.4的实施例的蛋白质含量和叶绿素含量明显高于碳氮比为37.8的实施例3。碳氮比为113.4的实施例1中小球藻的生物量浓度低，是因为过高的碳氮比使小球藻处于氮缺乏状态，不仅不利于生长，也不利于合成蛋白质和叶绿素。分析可知，在碳源浓度一定时，低碳氮比不仅能达到高生物量浓度，还能获得高的蛋白质和叶绿素含量。在实施例4中，碳氮比为28.4的情况下获得了最高的生物量浓度21.45g/l、最高的蛋白质含量22.98％和最高的叶绿素含量0.91％。
实施例5
按如下步骤培养蛋白核小球藻：
(1)将活化后的蛋白核小球藻接种于装有100 ml Basal培养基(含10g/l葡萄糖)的250ml三角瓶中，在28±1℃、2000 lux、130 r/m条件下连续光照培养6天，使其处于对数生长期；
(2)将步骤(1)中获得的种子液按8％(v/v)接种量接入培养基装液量为50ml的250ml三角瓶中，起始生物量浓度为0.30±0.05g/l。其中，培养基其配方为：KH2PO4 1250 mg/L、MgSO4·7H2O 1000 mg/L、EDTA-2Na 500 mg/L、H3BO3 114.2mg/L、CaCl2·2H2O 111mg/L、FeSO4·7H2O 49.8 mg/L、ZnSO4·7H2O 88.2 mg/L、MnCl2·4H2O 14.2mg/L、MoO3 7.1mg/L、CuSO4·5H2O 15.7 mg/L、(CoNO3)2·6H2O 4.9 mg/L、同时在Basal培养基中添加葡萄糖和硝酸钠，葡萄糖添加量为50 g/L，硝酸钠的添加量以使培养基中碳氮比为28.4为准。将三角瓶置于黑暗控温摇床中，温度为28±1℃，转速为160 r/m，pH为6.1±0.1，异养培养4天。
(3)将步骤(2)获得的异养种子液用Basal培养基将其稀释1倍后用三角瓶培养，稀释完后立即放入摇床进行光照，光暗周期为12h/12h，光照强度为5000±400 lux，起始细胞密度为11.09±0.07g/l，培养温度为28±1℃，转速为160r/m，同时向培养液中加入硝酸钠(氮源)，使培养液中含有14.7 mmol/L的氮元素，培养时间为60h。每12小时取一次样，样品离心洗涤后冷冻干燥，用于测蛋白质含量和叶绿素含量。
实施例6～10
与实施例5基本相同，不同点在于步骤(3)中向培养液中加入氮源的浓度不同，实施例6～10中步骤(3)的培养液中的氮元素浓度分别为29.4、44.1、58.8、73.5、88.2 mmol/L。
实施例5～10培养效果分析：
参见图4和图5，在氮元素浓度为14.7 mmol/l和29.4 mmol/l的光诱导培养条件下，蛋白核小球藻的蛋白质含量和叶绿素含量相对异养种子液有一定程度的增加，但显著性低于高浓度氮源(44.1、58.8、73.5、88.2 mmol/L)下生长的蛋白核小球藻的蛋白质含量和叶绿素含量。实施例5的最高蛋白质含量和叶绿素含量分别为30.16％和1.65％，实施例6的蛋白质小球藻的最高蛋白质含量和叶绿素含量分别为45.17％和2.62％。在氮元素浓度为44.1、58.5、73.5、88.2 mmol/l的光诱导培养条件下，蛋白核小球藻的蛋白质含量和叶绿素含量显著性高于低浓度氮源下培养的蛋白核小球藻，但是各浓度之间无显著差异。实施例7的最高蛋白质含量和叶绿素含量分别为54.10％和3.14％，实施例8的最高蛋白质含量和叶绿素含量分别为53.08％和3.04％，实施例9的最高蛋白质含量和叶绿素含量分别为53.86％和3.07％，实施例10的最高蛋白质含量和叶绿素含量分别为53.50％和3.05％。由实施例5～10的结果可见，氮源浓度是影响光诱导阶段蛋白质积累和叶绿素积累的关键因素，在一定范围内，蛋白质含量和叶绿素含量随着氮源浓度的增加而增加，但是过多的氮源并不能进一步促进蛋白质和叶绿素的积累。各实例中蛋白核小球藻都在48h达到最高蛋白质含量和最高叶绿素含量。在实施例7中，在获得最高蛋白质含量54.1％和最高叶绿素含量3.14％的同时，生物量浓度高达8.5g/l。
实施例11
(1)将活化后的蛋白核小球藻接种于装有100 ml Basal培养基(含10g/l葡萄糖)的250ml三角瓶中，在28±1℃、2000lux、130r/m条件下连续光照培养6天，使其处于对数生长期；
(2)将步骤(1)中获得的种子液按8％(v/v)接种量接入培养基的装液量为50ml的250ml三角瓶中，起始生物量浓度为0.35±0.05g/l。该步骤所用的培养基与实施例5中的培养基相同，不再赘述。将三角瓶置于黑暗控温摇床中，温度为28±1℃，转速为160 r/m，pH为6.1±0.1，异养培养4天。
(3)将步骤(2)获得的1.5L异养种子液用Basal培养基稀释1倍后用5L玻璃发酵罐培养，工作体积为3L，光暗周期为12h/12h，光照强度为6000±500 lux，起始细胞密度为10.03±0.1g/l，培养温度为28±1℃，搅拌速率为200 r/m，pH控制在6.1，同时向培养液中加入氮源，使培养液中含有44.1 mmol/l的氮元素，培养时间为60h。每12小时取一次样，样品离心洗涤后冷冻干燥，用于测蛋白质含量和叶绿素含量，结果参见图6。
实施例11中，蛋白核小球藻在48h获得最大蛋白质含量和最大叶绿素含量，分别为51.4％和2.91％，与此同时，生物量浓度高达8.1g/l。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种同时提高小球藻中叶绿素和蛋白质含量的高密度培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将活化后的小球藻进行连续光照培养，使其处于对数生长期；
(2)将步骤(1)中处于对数生长期的小球藻培养液作为种子液，将其接入异养发酵容器中在黑暗条件下进行异养培养，培养温度为28～35℃，培养时间为3～5天，异养发酵容器中所用培养基其碳氮比为28.4～113.4；
(3)将经过步骤(2)培养获得的小球藻培养液稀释至小球藻细胞密度为10～20g/L，向小球藻培养液中加入氮源，使小球藻培养液中含有14.7～88.2mmol/L的氮元素，再对小球藻进行光诱导培养，培养温度为28～35℃，培养时间为1～3天。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，异养发酵容器中所用培养基其配方由如下含量的各组分组成：KH2PO4 1200～1300 mg/L、MgSO4·7H2O 950～1050mg/L、EDTA-2Na 450～550 mg/L、H3BO3 110～120 mg/L、CaCl2·2H2O 105～120 mg/L、FeSO4·7H2O 45～55 mg/L、ZnSO4·7H2O 85～90 mg/L、MnCl2·4H2O 12～16 mg/L、MoO3 6.5～7.5mg/L、CuSO4·5H2O 15.5～16 mg/L、(CoNO3)2·6H2O 4.5～5.5 mg/L，培养基中还添加有碳源和氮源，其中所述碳源其在培养基中的含量以使培养基中含有0.03mol/L～0.33mol/L的碳元素为准，所述氮源其在培养基中的含量以使培养基的碳氮比保持在28.4～113.4为准。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，异养发酵容器中所用培养基其配方由如下含量的各组分组成：KH2PO41250 mg/L、MgSO4·7H2O 1000 mg/L、EDTA-2Na 500 mg/L、H3BO3 114.2 mg/L、CaCl2·2H2O 111 mg/L、FeSO4·7H2O 49.8 mg/L、ZnSO4·7H2O 88.2 mg/L、MnCl2·4H2O 14.2 mg/L、MoO3 7.1 mg/L、CuSO4·5H2O 15.7 mg/L、(CoNO3)2·6H2O 4.9 mg/L，培养基中还添加有碳源和氮源，其中所述碳源其在培养基中的含量以使培养基中含有0.03～0.33mol/L的碳元素为准，所述氮源其在培养基中的含量以使培养基的碳氮比保持在28.4～113.4为准。
4.根据权利要求2或3所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)的培养基中，其添加的氮源为有机氮源或无机氮源，其添加的碳源为有机碳源；步骤(3)中向小球藻培养液中加入的氮源为无机氮源。
5.根据权利要求2或3所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碳源其在培养基中的含量以使培养基中含有0.25～0.33 mol/L的碳元素为准。
6.根据权利要求1～3任一项所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，异养发酵容器中所用培养基其碳氮比为28.4～38；步骤(3)中，向小球藻培养液中加入氮源，使小球藻培养液中含有44.1～88.2 mmol/L的氮元素。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述光诱导培养为间歇光照培养，光照强度为2000 lux～20000 lux，光暗周期为12h/12h。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，对小球藻进行光照培养所用的培养基为添加有5～15g/L葡萄糖的Basal培养基，连续光照培养3～6天。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述的异养发酵容器选自摇瓶、发酵罐或生物反应器；步骤(3)的光诱导培养在摇瓶、开放式跑道池、圆池或封闭式的光生物反应器中进行；步骤(1)和/或步骤(3)所用的光源为自然光或者人工光。
10.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述小球藻选自绿藻门小球藻属中如蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、或原壳小球藻(Chlorella protothecoides)类的可发酵培养的小球藻。
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