CN109825438B - 培养红藻门单细胞海洋微藻生产生物活性成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及海洋微藻，尤其是红藻门单细胞海洋微藻的培养，包括用于海洋微藻培养的培养基及其培养方法。本发明的海洋微藻培养基中，碳与氮的摩尔比≥0.05。采用本发明的培养基培养海洋微藻，可促进海洋微藻的生长；且在特定的C/N比范围内，能提高藻细胞内油脂的含量以及ω‑6脂肪酸的占比。

Description

培养红藻门单细胞海洋微藻生产生物活性成分的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及红藻门单细胞海洋微藻培养生产生物活性成分的方法。

背景技术

紫球藻(Porphyridium purpureum)属于红藻门单细胞海洋微藻，能够天然高效积累藻红蛋白、硫酸酯多糖和多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)等多种生物活性成分。紫球藻天然含有丰富的ω-6系列(如亚油酸LA和花生四烯酸ARA)和ω-3系列(如亚麻酸ALA和EPA)多不饱和脂肪酸。正常生长情况下，紫球藻胞内油脂含量约为15-20％，总蛋白含量约40％左右，多糖含量约为25％。多糖和藻红蛋白已有大量文献报道在抗肿瘤、抗衰老、提高免疫力、天然荧光标记等方面具有重要的应用价值。紫球藻具有生长快、繁殖周期短和抗盐能力强等特点，且是具有开发利用前景的生物活性物质的重要来源，因而在医药、食品、水产和畜牧业等领域具有广阔的市场。

目前，已有一些研究和国内外专利报道了利用紫球藻积累或生产多糖、花生四烯酸或藻红蛋白的方法。除了利用不同类型的光反应器来实现高密度培养外，利用环境因子或者改变培养条件来调节紫球藻积累胞内物质是重要的手段。例如，CN201810524456.6公开了一种紫球藻的两步培养法，该方法包括将稳定期的藻细胞通过胁迫(高光或缺氮)和营养盐回收循环利用，同时获取胞外多糖与藻红蛋白，并用于户外规模化生产)。CN201610123810公开了一种用尿液为主要氮源二级培养紫球藻的方法，培养9天的最高细胞密度为每毫升中2.5×10⁶。CN201510408149公开了在培养基中加入植物生长调节因子柠檬酸钛和镥盐等，实施例中最高细胞密度为每毫升中7.3×10⁷个。CN201210349293公开了一种紫球藻培养基配方及塑料薄膜袋半连续培养方法，采用NH₄NO₃作氮源，添加适量的NaHCO₃并补充植物生长刺激素(即赤霉素)，可以使得产量提高78％，最高细胞密度为每毫升中2×10⁶个。

由于环境因子是影响海洋微藻PUFAs含量和组成的重要因素。当外界环境改变时，微藻细胞会做出一系列的变化来适应外界刺激，例如通过改变脂质和脂肪酸的组成及含量来改变生物膜系统的流动性及渗透性。因此，光照强度、培养基组成、盐度和温度等因素均可显著影响微藻胞内脂肪酸的生物合成和积累。实际生产过程中，人们希望某一类特定功能的脂肪酸占比越丰富越好，这样可以显著降低后续的分离提取工艺成本。在调节脂肪酸组成方面，例如CN201410680315.5公开，在紫球藻培养的后期，加大光照强度和温度，胁迫藻细胞积累花生四烯酸，且在培养后期分批补充营养盐，紫球藻中花生四烯酸含量提高120％。US5338673A公开，通过低温胁迫(12℃)和不同稀释比例的处理，调节EPA/ARA的比例介于0.73-3.75。也有研究报道高温处理(30℃)，紫球藻内ARA/EPA比值从0.72升到1.70，而缺氮处理可以达到2.95(The effect of environmental conditions on fatty acidcomposition of the red alga Porphyridium cruentum[M].The Metabolism,Structure,and Function of Plant Lipids.Springer New York,1987.pp 641-643)。

综上，目前的文献和专利申请集中利用新型的培养装置、耦合半连续等培养方法、额外添加激素等培养基成分、以及改变温度和光强外界因素等方面，从而实现紫球藻生长和积累活性物质。事实上，在微生物培养领域，改变碳/氮比也是较为常见的手段，可用于调控细胞生长和产物积累，然而不同物种中的结论不太一致，具有种属特异性。例如，沈宏伟等采用恒化培养的方法，研究了碳氮比对圆红冬孢酵母积累油脂的影响，结果发现碳氮比对油脂的脂肪酸组成影响不明显，油脂的棕榈酸、硬脂酸和油酸总含量超过85％(恒化培养稀释率和碳氮比对圆红冬孢酵母油脂积累的影响，生物工程学报，2012，28(1)：56-64)；孙佼文等研究了海洋裂殖壶菌中不同碳氮比对脂肪酸的合成的影响，结果显示提高碳氮比可以大幅提高ω-3脂肪酸DHA的含量(《Schizochytrium sp.S31生产DHA底物流加策略及呼吸特性分析》，中国油脂，2018，43(2)：110-114)。在其他微藻中，有学者研究了碳/氮比对眼点拟微绿球藻生长、油脂含量和脂肪酸组成的影响，结果表明碳/氮比对眼点拟微绿球藻藻油脂肪酸组成成分的影响不显著(p>0.05)；当NaNO₃浓度增加到0.225g/L时，藻油中EPA含量大幅提高，达到11.6％，此时ARA仅为3.9％，ARA/EPA仅为0.34(碳源种类及碳氮比对眼点拟微绿球藻生长密度、油脂含量和脂肪酸组成的影响，生物工程学报，2013，29(3)：358-369)。

上述研究表明碳/氮比可以影响微生物的生长，且可改变细胞内油脂等大分子物质的含量，或对ω-3脂肪酸(如DHA)有提高作用，但是在酵母或者微藻细胞中对脂肪酸组成的影响不明显，结果不显著。因此，尚未有报道碳/氮比可以实现精确调控微藻细胞内的脂肪酸组成，特别是如何提高ω-6脂肪酸的含量还没有有效的策略；值得强调的是，ω-6脂肪酸(例如亚油酸LA和花生四烯酸ARA)具有重要的生物学功能，与其他海洋微藻或海洋真菌不同的是，紫球藻中ω-6脂肪酸占比相当丰富，如能选择性地在紫球藻中富集合成ω-6脂肪酸，或者通过策略实现多种活性成分(藻红蛋白或多糖)的耦合生产，则具有重要的应用潜力。

发明内容

本发明提供一种海洋微藻培养基，该培养基含有碳源和氮源，其中，碳与氮的摩尔比≥0.05。

在一个或多个实施方案中，所述培养基中的碳与氮的摩尔比≥6，如在6-12或8-12的范围内。

在一个或多个实施方案中，所述培养基的碳与氮的摩尔比在0.05-3的范围内，如在0.1-3或0.1-1.5的范围内。在一个或多个实施方案中，所述海洋微藻培养基是改进的ASW培养基。

在一个或多个实施方案中，所述海洋微藻培养基是添加了碳源的f/2培养基。

在一个或多个实施方案中，所述碳源为无机碳源和有机碳源中的一种或任意多种的混合物。

在一个或多个实施方案中，所述无机碳源为碳酸氢盐，如钠盐或钾盐，或者为二氧化碳；所述有机碳源选自甘油或葡萄糖或醋酸盐；优选的碳源为碳酸氢盐和甘油。

在一个或多个实施方案中，所述培养基中碳的摩尔浓度可在1-50mM的范围内，优选在3-20mM的范围内。

在一个或多个实施方案中，所述氮源包括硝酸盐、铵盐、尿素和有机氮源中的一种或任意多种的混合物；优选的氮源是硝酸盐，如硝酸钾、硝酸钠。

在一个或多个实施方案中，所述培养基中氮的浓度可在0.1-30mM的范围内，优选在0.3-25mM的范围内。

在一个或多个实施方案中，所述培养基中氮源的浓度可在0.01-20g/L的范围内，优选在0.01-10g/L的范围内，更优选在0.03-5.0g/L的范围内。

在一个或多个实施方案中，所述培养基中的碳源是碳酸氢盐，其浓度在0.1-10g/L的范围内，优选在0.1-5g/L的范围内，更优选在0.1-3g/L的范围内；或甘油或葡萄糖或醋酸盐，其各自的浓度在0.1-50g/L的范围内，如0.1-30g/L或0.1-10g/L，更优选为0.1-3g/L；或二氧化碳，其浓度在0.01％-10％的范围内，优选在0.1-5％的范围内。

本发明提供一种海洋微藻培养方法，所述方法包括使用本发明所述的海洋微藻培养基培养所述海洋微藻的步骤。

本发明还提供一种利用海洋微藻生产蛋白质的方法，所述方法包括使用碳与氮的摩尔比被调整在0.05-3的范围内，如在0.1-3或0.1-1.5的范围内的海洋微藻培养基培养所述微藻的步骤。

本发明还提供一种利用海洋微藻生产多糖和/或脂肪酸的方法，所述方法包括使用碳与氮的摩尔比被调整到≥6，如在6-12或8-12的范围内的海洋微藻培养基所述微藻的步骤。

本发明还提供碳与氮的摩尔比在0.05-3的范围内，如在0.1-3或0.1-1.5的范围内的海洋微藻培养基在提高海洋微藻蛋白质产量中的应用。

本发明还提供碳与氮的摩尔比≥6，如在6-12或8-12的范围内的海洋微藻培养基在提高海洋微藻多糖和/或脂肪酸产量中的应用。

本发明还提供碳与氮的摩尔比≥6，如在6-12或8-12的范围内的海洋微藻培养基在提高海洋微藻中ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例或ARA与EPA的比例中的应用。在某些实施方案中，本发明可将ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例提高至5或5以上，如8或8以上，或者可将ARA与EPA的比例提高至3或3以上，或4.5或4.5以上。

在前述任一方法和应用中，所述海洋微藻包括但不限于红藻门单细胞海洋微藻、三角褐指藻、微拟球藻、金藻和扁藻，优选为红藻门单细胞微藻，更优选为紫球藻目的微藻，更优选为紫球藻属的微藻，更优选为紫球藻(Porphyridium purpureum)。

在前述任一方法和应用中，所述培养基为常用海洋微藻培养基，但通过添加氮源和/或碳源而使得培养基中的碳与氮的摩尔比被调整到所述范围内。

在前述任一方法和应用中，所述培养基为本文任一实施方案所述的海洋微藻培养基。

本发明还包括采用上述任一方法得到的海洋微藻培养物。

本发明还包括一种海洋微藻，该海洋微藻的藻细胞内：

(1)ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例≥5，如≥8；和/或

(2)ARA与EPA的比例≥3，如≥4.5。

在一个或多个实施方案中，以细胞干重计，所述海洋微藻还具有以下一项或多项特征：

(3)总油脂含量≥30％；

(4)脂肪酸含量≥500mg/L，优选≥700mg/L；

(5)ARA含量≥150mg/L，优选≥200mg/L；

(6)亚油酸含量≥150mg/L，优选≥200mg/L。

本发明还提供一种海洋微藻，以藻细胞干重计，所述海洋微藻中多糖的含量≥20％，优选≥25％，更优选≥28％。

本发明还提供一种海洋微藻，该海洋微藻的藻细胞内：

(1)ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例≥5，如≥8；和/或

(2)ARA与EPA的比例≥3，如≥4.5；且

以藻细胞干重计，所述海洋微藻中多糖的含量≥20％，优选≥25％，更优选≥28％。

附图说明

图1：紫球藻细胞在不同碳氮组成下的生长曲线对比。

图2：紫球藻细胞在不同碳氮组成下的培养液颜色对比。

图3：紫球藻细胞在不同碳氮比下气相色谱测定的脂肪酸峰图。黑线为碳/氮比＝10.79的藻细胞(黄色)脂肪酸组成；红线为碳/氮比＝0.48的藻细胞(红色)脂肪酸组成；C17:0为测试过程中添加的标准品。

图4：紫球藻细胞在不同碳/氮下脂肪酸组成及含量变化。

图5：紫球藻细胞在不同碳/氮下胞内主要生化组分变化。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本发明涉及海洋微藻(尤其是红藻门单细胞海洋微藻)培养生产生物活性成分的方法。本发明涉及的红藻门微藻尤其包括紫球藻目的微藻，其藻体为单细胞，疏松的聚集成不规则的群体存在于粘液中，或借粘液质壁将假丝状细胞疏松的连着。更具体而言，本发明的微藻为紫球藻科的微藻，更优选为紫球藻属的微藻，更优选为紫球藻(Porphyridiumpurpureum)。

本发明所述的生物活性成分包括但不限于蛋白质、多不饱和脂肪酸和多糖。蛋白质优选为所述红藻门单细胞海洋微藻生产的蛋白，如藻红蛋白。多不饱和脂肪酸包括但不限于ω-6系列(如亚油酸LA和花生四烯酸ARA)和ω-3系列(如亚麻酸ALA、DHA和EPA)多不饱和脂肪酸。多糖包括硫酸酯多糖。

本发明通过改变海洋微藻培养基中碳、氮元素的摩尔比，通过调节高碳/氮比实现ω-6脂肪酸的高占比(ω-6/ω-3≥5，如≥8；或者ARA/EPA≥3，如≥4.5)，同时富集生产多糖组分，通过调节低碳/氮比实现藻细胞富集生产藻红蛋白。具体而言，本发明通过将海洋微藻培养基中的C/N摩尔比调整为≥6，如在6-12或8-12的范围内，以实现ω-6脂肪酸的高占比及多糖组分的富集；通过将C/N摩尔比调整为≤3，如在0.05-3、0.1-3或0.1-1.5的范围内，以实现藻细胞藻红蛋白的富集生产。应理解，该摩尔比指碳源中碳元素与氮源中氮元素之间的摩尔比。

适用于本发明的培养基中的成分可含有氮源、碳源、无机盐、微量元素、生长激素和水。

合适的氮源包括微藻培养中常用的各种氮源，包括但不限于硝酸盐、铵盐、尿素和有机氮源中的一种或任意多种的混合物。优选的氮源是硝酸盐，如硝酸钾、硝酸钠等。培养基中氮源的浓度可在0.1-30mM的范围内，优选在0.3-25mM的范围内。在某些实施方案中，培养基中氮源的浓度可在0.01-20g/L的范围内，优选在0.01-10g/L的范围内，更优选在0.03-5.0g/L的范围内。

合适的碳源可以是无机碳源和有机碳源中的一种或任意多种的混合物。无机碳源可以是碳酸氢盐，如钠盐或钾盐。无机碳源也包括二氧化碳。有机碳源可以是甘油、葡萄糖和醋酸盐。优选的碳源为碳酸氢盐和甘油。通常，培养基中碳源的摩尔浓度可在1-50mM的范围内，优选在3-20mM的范围内，更优选在9-20mM的范围内。在某些实施方案中，使用碳酸氢盐时，0.1-10g/L的范围内，优选在0.1-5g/L的范围内，更优选在0.1-3g/L的范围内；使用甘油或葡萄糖或醋酸盐时，其各自的浓度可在0.1-50g/L的范围内，如0.1-30g/L或0.1-10g/L，更优选为0.1-3g/L；使用二氧化碳时，其浓度可在0.01％-10％的范围内，优选在0.1-5％的范围内。

培养基中的无机盐可为通常培养海洋微藻所用的无机盐，包括但不限于钠盐、镁盐、钙盐和钾盐中的一种或任意多种的任意混合物。钠盐包括NaCl和NaSiO₃或其水合物；镁盐包括MgSO₄和MgCl₂，也包括其水合物；钙盐可以是氯化钙或其水合物；钾盐可以是其磷酸盐，如磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。在某些实施方案中，本发明使用的培养基中的无机盐包括NaCl、MgSO₄·7H₂O、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂·2H₂O、KH₂PO₄和NaSiO₃·9H₂O中的一种或多种。无机盐在培养基中的浓度可为其常用浓度。例如，当含有时，钠盐的浓度可在15-35g/L的范围内；镁盐的浓度可在5-18g/L的范围内；钙盐的浓度可在0.5-4g/L的范围内；钾盐的浓度可在0.01-0.2g/L的范围内。在某些实施方案中，当含有时，NaCl的浓度可在15-35g/L的范围内，MgSO₄·7H₂O的浓度可在3-10g/L的范围内，MgCl₂·6H₂O的浓度可在2-8g/L的范围内，CaCl₂·2H₂O的浓度可在0.5-4g/L的范围内，KH₂PO₄的浓度可在0.01-0.2g/L的范围内，NaSiO₃·9H₂O的浓度可在0.01-0.1g/L的范围内。在某些实施方案中，本发明的培养基中含有NaCl、MgSO₄·7H₂O、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂·2H₂O、KH₂PO₄和NaSiO₃·9H₂O，其中，NaCl的浓度可在15-35g/L的范围内，MgSO₄·7H₂O的浓度可在3-10g/L的范围内，MgCl₂·6H₂O的浓度可在2-8g/L的范围内，CaCl₂·2H₂O的浓度可在0.5-4g/L的范围内，KH₂PO₄的浓度可在0.01-0.2g/L的范围内，NaSiO₃·9H₂O的浓度可在0.01-0.1g/L的范围内。

合适的微量元素为培养海洋微藻常用的微量元素，包括但不限于ZnCl₂、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O和(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O中的一种或多种。当含有时，ZnCl₂的浓度可在1-10μg/L、优选3-7μg/L的范围内，H₃BO₃的浓度可在30-100μg/L、优选50-70μg/L的范围内，MnCl₂·4H₂O的浓度可在20-80μg/L、优选3050μg/L的范围内，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O的浓度可在25-50μg/L、优选30-45μg/L的范围内。

此外，培养基中还可含有FeEDTA溶液。如培养基中可含有Na₂EDTA和FeCl₃·4H₂O，其中，Na₂EDTA的浓度可在0.5-5mg/L的范围内，FeCl₃·4H₂O的浓度可在10-50μg/L的范围内。

合适的生长激素包括微藻尤其是海洋微藻培养时常用的生长激素，包括但不限于6-苄氨基嘌呤(6-BA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、维生素B(VB)和生物素H中的任意一种或多种的混合物。当使用6-BA时，其浓度可在0.1-1.0mg/L的范围内，当使用ABA时，其浓度可在0.01-1.0mg/L的范围内，当使用GA时，其浓度可在0.01-1.5mg/L的范围内，当使用VB时，其浓度可在0.1-1.0μg/L的范围内，当使用生物素H时，其浓度可在0.1-1.0μg/L的范围内。

可使用合适的pH调节剂如Tris·HCl调节本发明培养基的pH。通常，本发明培养基的pH在7.0-9.0的范围内。

可使用本领域周知的海洋微藻培养基，并通过调整其C/N摩尔比来实施本发明。例如，可采用以下方法制备得到本发明的海洋微藻培养基：通过市售途径购买得到常规的海洋微藻培养基，然后通过向该培养基中添加碳源和/或氮源，以将C/N摩尔比控制在本发明所述的范围之内。或者，可购得常规海洋微藻培养基的各组分，根据本文所述浓度范围自行配制本文所述的海洋微藻培养基，或根据文献记载的培养基配方配制培养基，同时通过添加碳源和/或氮源，以将其C/N摩尔比控制在本发明所述的范围之内。应理解，本文中，在控制C/N摩尔比时，碳源和氮源在培养基中的质量体积比浓度或摩尔浓度宜控制在本发明所述的范围之内。

在某些实施方案中，本发明的培养基是一种改进的ASW培养基。与已知的ASW培养基(如Tao Y,Barnett SM(2004)Effect of light quality on production of extra-cellular polysaccharides and growth rate of Porphyridium cruentum.Biochem EngJ 19:251–258中所披露的ASW培养基)相比，本发明改进的ASW培养基中C/N摩尔比被调整到≥6，如在6-12或8-12的范围内，或者≤3，如在0.05-3、0.1-3或0.1-1.5的范围内。

在某些实施方案中，本发明使用改进的f/2培养基，与已知的f/2培养基(如Guillard,R.R.L.和Ryther,J.H.(1962)Studies on Marine Planktonic DiatomsI.Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea(Cleve)Gran.CanadianJournal of Microbiology,8,229-239中披露的培养基)相比，本发明改进的f/2培养基中添加了碳源，并将C/N摩尔比控制在本文所述的范围内。在某些实施方案中，本发明经改进后的f/2培养基以过滤海水配制，其碳源浓度在1-50mM、优选3-20mM、更优选9-20mM的范围内，氮源浓度在0.1-30mM、优选0.3-25mM的范围内，每升该培养基还含有KH₂PO₄·2H₂O0.001-0.1g、优选0.004-0.02g，NaSiO₃·9H₂O 0.005-0.1g、优选0.005-0.05g，盐酸硫胺素50-150μg，f/2微量元素母液1mL，VB₁₂ 0.1-1μg，生物素H 0.1-1μg，Na₂EDTA 0.5-5mg和FeCl₃·4H₂O 10-50μg。所述f/2微量元素母液为常规的f/2培养基中含有的微量元素母液。

在某些实施方案中，也可改造本领域周知的其它用于海洋微藻培养的培养基，包括Kock培养基(无碳源，只有硝酸钾0.75g/L)(如Koch W(1952)Untersuchungen anbakterienfreien Masenkulturen der einzel-ligen Rotalge Porphyridium cruentumNaegeli.Archiv für Mikrobiologie18(1–4):232–241所披露)和Pringsheim medium II培养基(无碳源，只有硝酸钾0.2g/L)(如Ernest G,Pringsheim O(1949)The growthrequirements of Porphyridium cruen-tum:with remarks on the ecology ofbrackish water algae.J Ecol:57–64所披露)，使其碳源和氮源浓度以及C/N比在本发明所述的范围内，用于本发明的海洋微藻培养。

在本发明培养海洋微藻的过程中，可通过初始培养基配置和/或通过补料控制发酵过程中的碳和氮的摩尔比稳定在一定的比值范围内，从而实现不同生物活性成分的生产。例如，生产藻红蛋白时，可将C/N比控制在≤3，如在0.05-3、0.1-3或0.1-1.5的范围内；在生产脂肪酸和多糖时，可将C/N比控制为≥6，如在6-12或8-12的范围内。

可采用本领域周知的方法培养海洋微藻。例如，获得种子液后，可将种子液接入反应器内进行培养。培养的温度、光照强度和通气量等可根据不同海洋微藻种类而不同，可由本领域技术人员容易确定。例如，培养温度通常可在室温，如20-30℃的范围内；可连续光照，光照强度可在20-200μmol/m²/s的范围内；通气量可依反应器规格而不同，例如可在0.5-5vvm的范围内。

可采用分批补料和流加补料的方式，或本领域熟知的其它培养方式培养海洋微藻，只要在培养过程中将培养基中的C/N比控制在本文所述的范围内即可。

采用本发明的培养基培养海洋微藻，可促进海洋微藻的生长。因此，本发明提供一种海洋微藻培养方法，所述方法包括使用本发明所述的海洋微藻培养基培养所述海洋微藻的步骤。由于海洋微藻生长加快，因此，生物活性成分的产率得以提高。因此，本发明还提供一种利用海洋微藻生产生物活性物质，包括蛋白质、油脂和/或多糖的方法，所述方法包括使用本发明所述的海洋微藻培养基培养所述海洋微藻的步骤。进一步地，本发明还提供一种利用海洋微藻生产蛋白质，尤其是藻红蛋白的方法，所述方法包括使用碳与氮的摩尔比被调整在0.05-3的范围内，如在0.1-3或0.1-1.5的范围内的海洋微藻培养基培养所述微藻的步骤；以及碳与氮的摩尔比在0.05-3的范围内，如在0.1-3或0.1-1.5的范围内的海洋微藻培养基在提高海洋微藻蛋白质(尤其藻红蛋白)产率中的应用。

采用本发明的培养基培养海洋微藻还能使海洋微藻的代谢朝着多糖和脂肪酸方向积累，从而大量产生多糖和特定不饱和脂肪酸。因此，本发明还提供一种利用海洋微藻生产多糖和/或脂肪酸的方法，所述方法包括使用碳与氮的摩尔比被调整到≥6，如在6-12或8-12的范围内的海洋微藻培养基所述微藻的步骤；以及碳与氮的摩尔比≥6，如在6-12或8-12的范围内的海洋微藻培养基在提高海洋微藻多糖和/或脂肪酸产量中的应用。

本发明还提供碳与氮的摩尔比≥6，如在6-12或8-12的范围内的海洋微藻培养基在提高海洋微藻中ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例或ARA与EPA的比例中的应用。在某些实施方案中，本发明可将ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例提高至5或5以上，如8或8以上，或者可将ARA与EPA的比例提高至3或3以上，或4.5或4.5以上。

在本发明所述的方法和应用中，所述海洋微藻包括但不限于红藻门单细胞海洋微藻、三角褐指藻、微拟球藻、金藻和扁藻，优选为红藻门单细胞微藻，更优选为紫球藻目的微藻，更优选为紫球藻属的微藻，更优选为紫球藻(Porphyridium purpureum)。在本发明所述的方法和应用中，所述培养基为常用海洋微藻培养基，但通过添加氮源和/或碳源而使得培养基中的碳与氮的摩尔比被调整到所述范围内；优选地，所述培养基为本文任一实施方案所述的海洋微藻培养基。

本发明还包括采用上述任一方法得到的海洋微藻培养物。通常，该培养基含有海洋微藻和培养基。优选地，所述培养基为本文所述的培养基。在某些实施方案中，所述海洋微藻培养物为种子液。

本发明还包括一种海洋微藻，该海洋微藻的藻细胞内：(1)ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例≥5，如≥8；和/或(2)ARA与EPA的比例≥3，如≥4.5。在某些实施方案中，以细胞干重计，所述海洋微藻还具有以下一项或多项特征：(3)总油脂含量≥30％；(4)脂肪酸含量≥500mg/L，优选≥700mg/L；(5)ARA含量≥150mg/L，优选≥200mg/L；和(6)亚油酸含量≥150mg/L，优选≥200mg/L。

本发明还提供一种海洋微藻，以藻细胞干重计，所述海洋微藻中多糖的含量≥20％，优选≥25％，更优选≥28％。优选地，以细胞干重计，该海洋微藻还具有以下一项或多项特征：总油脂含量≥30％；脂肪酸含量≥500mg/L，优选≥700mg/L；ARA含量≥150mg/L，优选≥200mg/L；和亚油酸含量≥150mg/L，优选≥200mg/L。

本发明还提供一种海洋微藻，该海洋微藻的藻细胞内：(1)ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例≥5，如≥8；和/或(2)ARA与EPA的比例≥3，如≥4.5；且以藻细胞干重计，所述海洋微藻中多糖的含量≥20％，优选≥25％，更优选≥28％。优选地，以细胞干重计，该海洋微藻还具有以下一项或多项特征：总油脂含量≥30％；脂肪酸含量≥500mg/L，优选≥700mg/L；ARA含量≥150mg/L，优选≥200mg/L；和亚油酸含量≥150mg/L，优选≥200mg/L。

本发明还提供一种海洋微藻制品，其由本发明任一实施方案所述的海洋微藻制备得到。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的保护范围。实施例中所用到的材料和方法，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法，如这些材料可从市售途径购买获得。

实施例1：低碳氮比(0.48)下高效合成藻红蛋白

取同一状态下摇床中扩培的紫球藻种子液，6000rpm、10min离心去上清，按照接种量5％(1.59×10⁶细胞/mL)接入到1L柱式反应器(直径3cm)中进行培养，培养温度为25度，连续光照，光照强度100μmol/m²/s，通气量为1vvm(持续通无菌空气)。

培养基组成如下：经优化后ASW(以1升为标准，用水配制)，NaHCO₃ 0.8g、KNO₃2.0g、NaCl 27.0g、MgSO₄·7H₂O 6.6g、MgCl₂·6H₂O 5.6g、CaCl₂·2H₂O 1.5g、KH₂PO₄ 0.07g、NaSiO₃·9H₂O 0.03g、1mol/L Tris·HCl(pH＝7.6)20mL、微量元素母液1mL、6-BA 0.6mg、VB0.5μg、生物素H 0.5μg、Na₂EDTA 1.68mg和FeCl₃·4H₂O 24μg；其中，1升培养基中，所述微量元素为ZnCl₂ 4μg/L、H₃BO₃ 60μg/L、MnCl₂·4H₂O 40μg/L和(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 37μg/L。碳氮比为：0.48(摩尔比)。

培养到18天后，紫球藻生长达到稳定期，藻液呈现深红色(图2)，此时细胞密度1.83×10⁸细胞/mL(图1)，细胞干重为14.5g/L；可溶性总蛋白含量为5524mg/L(采用Bradford试剂盒定量测定)，占细胞干重的38.1％(对数生长期时总蛋白最高可占干重的40.8％，与目前文献报道的相当)；其中藻红蛋白为4915mg/L，占干重的33.9％(对数生长期时藻红蛋白最高可占干重的36.2％)，占总蛋白的88.9％；总油脂(取0.1g紫球藻粉采用氯仿-甲醇3:1抽提，再经吹氮仪挥发有机相)占干重的23.9％，总脂肪酸含量(采用GC-MS分析)为264mg/L(图4)，其中ARA含量为66mg/L，ω-6/ω-3＝2.97，ARA/EPA＝1.83，各脂肪酸分布较均匀，比值属于在文献中常见的范围内；胞内多糖含量(采用苯酚-硫酸法)较少，占干重的8.5％。

上述结果表明该碳氮比下可以实现藻红蛋白的高效生长，但不适合脂肪酸和多糖的合成(图5)。

实施例2：高碳氮比(10.79)下定向积累脂肪酸并联产多糖

取同一状态下摇床中扩培的紫球藻种子液，6000rpm、10min离心去上清，按照接种量5％(1.59×10⁶细胞/mL)接入到1L柱式反应器(直径3cm)中进行培养，培养温度为25度，连续光照，光照强度100μmol/m²/s，通气量为1vvm(持续通无菌空气)。

培养基组成如下：经优化后ASW(以1升为标准，用水配制)，NaHCO₃ 0.8g、NaNO₃0.075g、NaCl 27.0g、MgSO₄·7H₂O 6.6g、MgCl₂·6H₂O 5.6g、CaCl₂·2H₂O 1.5g、KH₂PO₄0.07g、NaSiO₃·9H₂O 0.03g、1mol/L Tris·HCl(pH＝7.6)20mL、微量元素母液1mL、6-BA0.6mg、VB 0.5μg、生物素H 0.5μg、Na₂EDTA 1.68mg和FeCl₃·4H₂O 24μg；其中，1升培养基中，所述微量元素为ZnCl₂ 4μg/L、H₃BO₃ 60μg/L、MnCl₂·4H₂O 40μg/L和(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O37μg/L。碳氮比为：10.79(摩尔比)。

培养到18天后，紫球藻生长达到稳定期，藻液呈现金黄色(图2)，此时细胞密度1.53×10⁸细胞/mL(图1)，细胞干重为12.3g/L，总体而言长势和低碳氮比情况下差异不大。此时由于碳氮比差异导致紫球藻在生长过程中消耗胞内蛋白以补充生长过程中所需的氮源，培养结束时胞内总蛋白含量为1377mg/L，占细胞干重的11.2％，其中藻红蛋白418mg/L，占干重的3.4％；此时，该条件下(C/N＝10.79)的紫球藻代谢朝着多糖和脂肪酸方向积累，大量产生多糖和特定不饱和脂肪酸。总油脂含量38.6％，总脂肪酸含量为841mg/L(图4)，其中定向性的使得ω-6脂肪酸大量积累(见图3)，ARA产率为248mg/L，亚油酸产率为238mg/L，EPA含量仅为49mg/L，ω-6/ω-3＝10.14，ARA/EPA＝5.06，这一结果无论是比值还是ARA的产率都是目前已有报道的最高值，实现了在特定碳氮比下ω-6PUFAs的选择性富集。目前文献中较高的为一篇关于利用甘油对紫球藻进行混合培养，当甘油添加量为50％w/v时，ARA最高产率为214.9mg/L，而此时ARA/EPA仅为2.88(Using a trait-based approach tooptimize mixotrophic growth of the red microalga porphyridium purpureumtowards fatty acid production.Biotechnology for Biofuels,2018,11,273)。在多糖积累方面，培养到18天时紫球藻产多糖达4.28g/L，占细胞干重的34.8％，而一篇关于紫球藻的户外大规模培养报道多糖最高含量仅为1.32g/L(Extracellular polysaccharideproduction in outdoor mass cultures of Porphyridium sp.in flat plate glassreactors.Journal of Applied Phycology,2000,12(3-5):269-275)，表明本技术下通过碳氮比调节，使得紫球藻高效定向富集ω-6PUFAs并同时实现多糖的积累(图5)。

实施例3：更换碳氮源组成，维持固定范围的碳氮比，仍可实现活性成分的选择性生产

取同一状态下摇床中扩培的紫球藻种子液，6000rpm、10min离心去上清，按照接种量5％(1.59×10⁶细胞/mL)接入到1L柱式反应器(直径3cm)中进行培养，培养温度为25度，连续光照，光照强度100μmol/m²/s，通气量为1vvm(持续通无菌空气)。

培养基组成与实施例1类似，但其中无机碳源NaHCO₃更换为有机碳源甘油0.8g/L，氮源KNO₃ 0.3g/L，其余组份和含量保持不变。碳氮比为：8.78(摩尔比)。

或，培养基组成与实施例1类似，但其中无机碳源NaHCO₃更换为有机碳源甘油0.5g/L，氮源从KNO₃更换为NH₄Cl 1.0g/L，其余组份和含量保持不变。碳氮比为：0.87(摩尔比)。

经18天生长培养后，藻细胞进入稳定期，藻液呈现黄色。碳氮比8.78条件下的最高细胞密度达到1.95×10⁸细胞/mL(图1)，细胞干重为15.6g/L；此时藻细胞中可溶性总蛋白含量为2689mg/L，占细胞干重的17.2％，其中藻红蛋白含量864mg/L，占干重的5.5％；而总油脂含量为34.3％，脂肪酸含量为789mg/L，其中ARA产率为225mg/L，亚油酸产率为214mg/L，EPA含量仅为42mg/L，ω-6/ω-3＝10.67，ARA/EPA＝5.36；藻细胞中多糖的含量为31.7％。表明高碳氮比下，即使改变碳源组成，仍然可以实现ω-6PUFAs和多糖的高效生产(图5)。

而在碳氮比0.87条件下的藻细胞，到达稳定期后密度为1.67×10⁸细胞/mL(图1)，干重为13.2g/L；藻细胞呈现红色(图2)，此时藻细胞中可溶性总蛋白含量为4568mg/L，占细胞干重的34.6％，其中藻红蛋白含量3537mg/L，占干重的26.8％；而总油脂含量为24.7％，脂肪酸含量为286mg/L，其中ARA产率为62mg/L，亚油酸产率为51mg/L，EPA含量仅为33mg/L，ω-6/ω-3＝3.63，ARA/EPA＝1.88；藻细胞中多糖的含量为13.8％。上述结果表明低碳氮比下，即使改变碳氮源的组成和含量，仍然可以实现藻红蛋白的高效合成，但低碳氮比下，PUFAs和多糖的含量显著降低，ω-6PUFAs也无法得到有效的富集(图5)。

实施例4：使用改进的f/2培养基的培养及其结果

取同一状态下摇床中扩培的紫球藻种子液，6000rpm、10min离心去上清，按照接种量5％(1.50×10⁶细胞/mL)接入到1L柱式反应器(直径3cm)中进行培养，培养温度为25度，连续光照，光照强度100μmol/m²/s，通气量为1vvm(持续通无菌空气)。

培养基组成如下：经改进后的f/2培养基(以1升为标准，用过滤海水配制)，NaHCO₃0.8g、NaNO₃ 0.075g、KH₂PO₄·2H₂O 0.006g、NaSiO₃·9H₂O 0.01g、盐酸硫胺素100μg、f/2微量元素母液1mL、VB₁₂ 0.5μg、生物素H 0.5μg、Na₂EDTA 1.68mg和FeCl₃·4H₂O 24μg。碳氮比为：10.79(摩尔比)。

或，培养基组成无机碳源NaHCO₃含量维持不变，氮源从NaNO₃增加到2g/L，其余组份和含量保持不变。碳氮比为：0.40(摩尔比)。

经18天生长培养后，碳氮比10.79条件下的最高细胞干重为9.4g/L，藻细胞为黄色；藻细胞中藻红蛋白含量723mg/L，占干重的7.69％；而总油脂含量为36.2％，脂肪酸含量为801mg/L，其中ARA产率为247mg/L，亚油酸产率为221mg/L，EPA含量仅为47mg/L，ω-6/ω-3＝9.84，ARA/EPA＝5.26；藻细胞中多糖的含量为32.9％。表明高碳氮比下，即使改变基础培养基组成，仍然可以实现ω-6PUFAs和多糖的高效生产。

而在碳氮比0.40条件下的藻细胞，到达稳定期后细胞干重为10.8g/L；藻细胞呈现红色，此时藻细胞中可溶性总蛋白占细胞干重的35.3％，其中藻红蛋白含量3215mg/L，占干重的29.8％；而总油脂含量为22.1％，脂肪酸含量为259mg/L，其中ARA产率为51mg/L，亚油酸产率为49mg/L，EPA含量仅为35mg/L，ω-6/ω-3＝3.89，ARA/EPA＝1.46；藻细胞中多糖的含量为14.1％。上述结果表明低碳氮比下，即使改变基础培养基组成，仍然可以实现藻红蛋白的高效合成，但低碳氮比下，PUFAs和多糖的含量显著降低，ω-6PUFAs也无法得到有效的富集。

对比例1

使用常规的f/2培养基(以1升为标准，用过滤海水配制，NaNO₃ 0.075g、KH₂PO₄·2H₂O 0.006g、NaSiO₃·9H₂O 0.01g、盐酸硫胺素100μg、f/2微量元素母液1mL、VB₁₂ 0.5μg、生物素H 0.5μg、Na₂EDTA 1.68mg和FeCl₃·4H₂O 24μg)，按照实施例4所述的方法培养。由于常规的f/2培养基中未添加碳源，因此碳氮比无法计算。但结果显示，藻细胞生长迟缓，18天生长后最高仅为1.8g/L，各物质成分的产率过低，无法适用于活性成分的生产。

对比例2

按照实施例1所述的方法，使用常规的人工海水培养基ASW进行培养。该培养基中碳酸氢钠浓度为0.04g/L，硝酸钾是1g/L，碳氮比为0.048。结果显示，藻细胞生长适中，最高细胞浓度为4.6g/L；藻体呈现红色，藻红蛋白含量为37.1％；总脂肪酸含量为252mg/L，多糖含量为8.2％。ω-6/ω-3＝2.43，ARA/EPA＝1.26。

Claims (15)

1.海洋微藻培养基在提高海洋微藻多糖和脂肪酸产量，同时将海洋微藻中ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例提高至≥8和/或将海洋微藻中的ARA与EPA的比例提高至≥4.5中的应用；其特征在于，所述海洋微藻为紫球藻属的微藻；所述海洋微藻培养基含有碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长激素和水；其中，所述碳源选自碳酸氢盐和/或甘油；所述氮源是硝酸盐；所述无机盐包括NaSiO₃·9H₂O，其浓度为0.01-0.1g/L；所述生长激素包括6-苄氨基嘌呤、维生素B和生物素H，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.1-1.0mg/L，维生素B的浓度为0.1-1.0μg/L，维生素H的浓度为0.1-1.0μg/L；且培养基中碳与氮的摩尔比≥6。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述碳源的摩尔浓度为1-50mM，所述氮源的摩尔浓度为0.1-30mM。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述碳源的摩尔浓度为3-20mM，所述氮源的摩尔浓度为0.3-25mM。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述碳源的摩尔浓度为9-20mM。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述培养基中的碳与氮的摩尔比在6-12的范围内。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述培养基中的碳与氮的摩尔比在8-12的范围内。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述碳酸氢盐为钠盐或钾盐。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氮源是硝酸钾和/或硝酸钠。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述海洋微藻培养基选自：碳与氮的摩尔比被调整到所述范围的改进的ASW培养基和添加了碳源同时将碳与氮的摩尔比被调整到所述范围的改进的f/2培养基、改进的Kock培养基和改进的Pringsheim medium II培养基。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述海洋微藻培养基含有：氮源、碳源、无机盐、微量元素和生长激素，以水配制；其中：

所述氮源为硝酸盐，在培养基中的摩尔浓度为0.1-30mM；

所述碳源为碳酸氢盐或甘油，在培养基中的摩尔浓度为1-50mM；

所述无机盐包括NaCl、MgSO₄·7H₂O、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂·2H₂O、KH₂PO₄和NaSiO₃·9H₂O，其中，NaCl的浓度为15-35g/L，MgSO₄·7H₂O的浓度为3-10g/L，MgCl₂·6H₂O的浓度为2-8g/L，CaCl₂·2H₂O的浓度为0.5-4g/L，KH₂PO₄的浓度为0.01-0.2g/L，NaSiO₃·9H₂O的浓度为0.01-0.1g/L；

所述微量元素包括ZnCl₂、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O和(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，其中ZnCl₂的浓度为1-10μg/L，H₃BO₃的浓度为30-100μg/L，MnCl₂·4H₂O的浓度为20-80μg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O的浓度为25-50μg/L；

所述生长激素包括6-苄氨基嘌呤、维生素B和生物素H，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.1-1.0mg/L，维生素B的浓度为0.1-1.0μg/L，维生素H的浓度为0.1-1.0μg/L；

所述培养基还包括0.5-5mg/L的 Na₂EDTA和10-50μg/L的FeCl₃·4H₂O；

其中，所述培养基的pH在7.0-9.0之间，且所述碳源与所述氮源的摩尔比≥6。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述碳源与所述氮源的摩尔比为6-12。

12.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述海洋微藻培养基含有过滤海水，其碳源浓度为1-50mM，氮源浓度为0.1-30mM，每升该培养基还含有KH₂PO₄·2H₂O 0.001-0.1g、NaSiO₃·9H₂O 0.005-0.1g、盐酸硫胺素50-150μg、f/2微量元素母液1mL、VB₁₂ 0.1-1μg和生物素H 0.1-1μg，Na₂EDTA 0.5-5mg，和FeCl₃·4H₂O 10-50μg；其中，所述海洋微藻培养基的pH在7.0-9.0之间，且所述碳源与所述氮源的摩尔比≥6。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述碳源与所述氮源的摩尔比为6-12。

14.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多糖包括硫酸酯多糖。

15.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述海洋微藻为紫球藻（Porphyridium purpureum）。

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