CN106566775A - 含高活力雨生红球藻细胞制备方法 - Google Patents

含高活力雨生红球藻细胞制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含高活力雨生红球藻细胞制备方法，属于微藻培养、海藻深加工以及发酵食品技术领域。该制备方法以CO2和有机碳源以及营养盐为培养基质，以雨生红球藻作为微藻培养菌种，采用自养状态、混合状态培养的方法，包括：菌种选育及驯化处理、雨生红球藻细胞扩大培养、含发酵罐的培养系统及培养步骤及过程。本发明制备方法生产出的含高活力雨生红球藻细胞，赋予雨生红球藻细胞产生细胞浓度高、细胞活力高和虾青素生物转化活力高，可制备高虾青素含量的雨生红球藻藻粉。

Description

含高活力雨生红球藻细胞制备方法
技术领域
本发明属于微藻培养、海藻深加工以及发酵食品技术领域。本发明涉及适用于含高活力雨生红球藻细胞制备方法，特别涉及适用于雨生红球藻细胞高效培养及其制备，赋予该种雨生红球藻细胞具有高活力细胞和虾青素生物转化活力以及高的细胞浓度，可制备高活力雨生红球藻细胞。
背景技术
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，也称为雨生血球藻。它是一种广泛分布于自然界的单细胞绿藻，在分类学上属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。细胞呈卵形或椭圆形，游动细胞大小为宽3～5μm，长3～8μm；不动细胞大小为宽19～51μm，长28～63μm，细胞大小与细胞生长阶段有关。雨生红球藻生活史分为游动细胞和不游动细胞两个阶段，即主要有营养细胞和厚壁孢子两种形态。在光照较弱、氮磷丰富的环境条件下以游动的绿色营养细胞形态存在，在该条件下雨生红球藻生长旺盛，通常细胞内虾青素含量较低；而在不利生存的条件如高光照、高温、高盐或营养盐饥饿等胁迫条件下，游动细胞或孢子退去鞭毛，转入不游动细胞阶段，此阶段细胞的生长速率较游动细胞阶段慢，以不动的厚壁孢子形态存在，并积累大量的虾青素以抵御不良环境。
雨生红球藻细胞制备方法可分为雨生红球藻细胞自养培养模式、雨生红球藻细胞异养培养模式的制备方法以及工艺过程。雨生红球藻自养细胞培养、异养细胞培养的制备方法以及工艺过程的区别如表1所示。而不同雨生红球藻细胞培养模式能赋予其细胞一定的生物学功能，影响细胞浓度以及细胞活力和虾青素生物转化活力，以适合不同类型微藻细胞的制备和品质的需求。
天然虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，超强的抗氧化活性赋予虾青素突出的生理功能，如提高动物免疫力、抑制肿瘤、清除自由基和活性氧等，而且在调控基因表达及诱导细胞间通讯方面发挥着作用。因此，在药物、高级化妆品、食品加工以及养殖工业中发挥着重要作用。目前天然虾青素的生产来源包括甲壳类动物的壳、红法夫酵母菌和微藻类细胞。然而这些来源的虾青素含量很低，如虾壳油提取物和红法夫酵母中虾青素含量分别为0.15％和0.4％。与此相比之下，雨生红球藻中虾青素含量约1.5-3.0％。雨生红球藻在细胞内能够大量合成积累虾青素，最高含量可达到藻体干重的5％，被确认为是自然界中合成和积累虾青素效率最高的生物，因而受到了相关的科学家和生产企业的重视。另外，雨生红球藻合成的虾青素是3S，3'S异构体，与水生动物体内所含的虾青素完全相同，易被生物体吸收，因此雨生红球藻是极为理想的天然虾青素生产者，被认为是天然虾青素的富集形式。因此，雨生红球藻作为虾青素生产工业的来源具有广阔的应用前景。
表1.雨生红球藻自养细胞培养、异养细胞培养制备方法及工艺过程
雨生红球藻是一种典型的经济微藻。利用微藻进行CO2减排具备诸多优势:与森林、农业植物相比，微藻具有更高的生长效率和CO2固定能力。微藻可实现CO2的彻底固定。通过光合作用，CO2被转化形成藻细胞体内的生物质成分，这些生物质是太阳能转化形成化学能的储存形式，可通过这一技术的利用，进一步提高细胞生物转化及利用效率。将微藻生物减排CO2与生物处理过程相结合，微藻被证明具有较高的N,P和金属离子的去除效率，微藻在养殖方面具有明显的优势，这将使微藻生物减排CO2这项技术的经济效益得到进一步的提高，其培养环境得到可持续性增强。
传统的雨生红球藻细胞培养及工艺过程存在的缺陷：
1、雨生红球藻细胞是一种光合自养生物。雨生红球藻细胞培养及生产一般采用光合自养培养，但光自养培养过程中光照已成为微藻细胞生长的主要限制性因素，往往使得培养过程细胞浓度很低。
2、一般雨生红球藻细胞培养往往细胞活力较低，易受到细胞生长及代谢、培养基质以及环境因素影响较大。
3、雨生红球藻细胞对培养环境耐受能力较弱，抗杂菌污染能力较弱，进而对细胞生长状态、细胞活力以及纯种培养产生影响，难以实现雨生红球藻细胞高浓度培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含高活力雨生红球藻细胞制备方法，赋予雨生红球藻细胞产生高活力细胞、高的虾青素生物转化的活力细胞，可用于制备高含量的雨生红球藻细胞或藻粉制剂。
其技术解决方案包括：
一种雨生红球藻细胞制备方法，依次包括以下步骤：
a菌种的选育及驯化处理，采用雨生红球藻菌种经过选育及驯化的菌株，获得细胞发育良好，细胞活力高的纯种细胞；
b雨生红球藻细胞的扩大培养步骤，包括藻种的扩大培养和雨生红球藻游动细胞的培养；
c发酵罐培养，包括两个阶段，
c1第一阶段：以10％的接种量将藻种接入灭菌的发酵罐的藻种培养基中，于1500-4000lx光照条件下，光照周期12h:12h，培养温度22±1℃，向培养系统中通入CO2，使培养系统中CO2含量达到1-3％，在自养状态下搅拌培养6-8天；
c2第二阶段：在该培养过程中，使培养系统中CO2含量达到1-3％，流加以乙酸钠为碳源的培养基质，使得雨生红球藻细胞处于混合培养状态，过程pH控制在pH7.0-8.5；采用LED照射培养与普通白炽灯光源相配合的方式，以置于2500-6000lx光照条件下，光照培养与暗培养周期相结合形式，在光照周期12h:12h，培养温度22-24℃的条件下，进行雨生红球藻细胞培养。
上述技术方案中，步骤a通过对菌种选育以及纯种分离，选择雨生红球藻菌株中细胞发育良好，其中所含的细胞生长速率快、细胞活力高、虾青素生物转化活力高的纯种细胞；接着对对雨生红球藻细胞进行耐酸和适应性驯化处理，可以提高该细胞对细胞生长环境的耐受力。在步骤c的培养过程中通过改变培养基质(CO2浓度和基质浓度)、光照以及培养环境条件，来控制细胞自养与异养生长状态及程度，进而达到控制培养系统中细胞浓度、细胞活力，对细胞培养进程进行调节和控制，制备出含高活力雨生红球藻细胞。
采用红光LED照射与普通白炽灯光源相配合的培养方式，红光LED照射与普通白炽灯光照比例为：1：2-6；并置于1500-6000lx光照条件下，光照培养与暗培养周期相结合形式，光周期12:12条件下；进行雨生红球藻细胞培养。光照培养与暗培养周期在含发酵罐培养系统的培养阶段采用控制发酵系统光照与暗培养停流时间的方式加以控制。
分别测定细胞培养过程的细胞浓度、细胞活力(叶绿素含量、细胞形态观察)，绘制出三角瓶培养阶段或者在含光照培养发酵罐的培养系统培养阶段细胞浓度以及细胞活力变化动态。根据细胞培养过程的细胞浓度、细胞活力变化，通过改变培养基质、光照以及培养条件等，来控制细胞自养与异养状态，进而达到控制培养系统中细胞浓度、细胞生物活力，对细胞培养进程进行调节和控制。得到高活力的、绿色、游动营养细胞。
上述步骤b和步骤c1中雨生红球藻细胞培养处于自养状态,这样处理一者可防止杂菌污染的影响；二者可使细胞保持高活力细胞状态。
作为本发明的一个优选方案，在雨生红球藻细胞的扩大培养步骤中，调节CO2浓度，控制细胞自养生长状态；在发酵罐培养过程调节CO2浓度以及流加乙酸钠基质，使得雨生红球藻细胞处于混合培养状态；并且调节光照波长、光照强度以及光源类型，改善雨生红球藻细胞生长行为以及状态，减少对细胞生长限制性的影响；利用培养过程的培养基质、光照、温度、pH、通风量环境因素以及细胞浓度和细胞活力，对细胞培养进程进行调节和控制。
作为本发明的另一个优选方案，LED照射与普通白炽灯光照比例为：1：2-6；所述的LED照射培养主要是红光LED照射培养，普通光源照射培养主要是白炽灯照射培养；在培养过程中，采用光照培养与暗培养周期相结合的形式，进行雨生红球藻细胞培养。
优选的，在菌种选育及驯化处理步骤，通过菌种选育以及纯种分离，选择雨生红球藻菌株中细胞发育良好，其中所含的细胞生长速率快、细胞活力高、虾青素生物转化活力高的纯种细胞；并对高活力雨生红球藻细胞进行耐酸和适应性驯化处理，提高该细胞对其生长环境的耐受力。
优选的，步骤b中，藻种的扩大培养步骤包括：以10％的接种量接入灭菌的藻种培养基中，置于500-1000lx光照条件下，在光周期12h:12h，培养温度20-22℃条件下在自养状态下培养7天。
优选的，步骤b中，雨生红球藻游动细胞的培养包括：以10％的接种量将藻种接入灭菌的藻种培养基中，置于1500-4000lx光照条件下，控制光照周期为12h:12h，在自养状态下缓慢通入无菌空气搅拌培养8天。
优选的，在雨生红球藻扩大培养过程中，采用20-22℃的较低培养温度。
优选的，在菌种选育及驯化处理、含发酵罐的培养系统培养步骤中，分别测定不同细胞浓度、细胞生物活力以及细胞的虾青素生物转化活力，绘制出细胞培养过程中细胞浓度、细胞生物活力的变化动态，根据细胞培养过程细胞浓度以及细胞生物活力变化，利用细胞培养过程的培养基质、光照、温度、pH、通风量以及细胞浓度，对细胞培养进程进行调节和控制。
优选的，在培养细胞中，雨生红球藻细胞形态处于绿色、游动营养细胞，细胞大而健壮；雨生红球藻细胞叶绿素含量较高及细胞活力高，细胞虾青素生物转化活力较高
本发明含高活力雨生红球藻细胞的制备方法适用于实验室人工气候箱(调温光照培养箱)、小型细胞培养的发酵罐以及工业生产的含光照培养发酵罐的培养系统进行微藻细胞培养过程。微藻细胞培养条件主要通过光照、温度、培养基质以及细胞光照与暗培养停留时间等，来实现对微藻细胞培养进程的控制。
本发明所带来的有益技术效果为：
1、常规的雨生红球藻菌株是依据雨生红球藻菌种、细胞个体大而生长健壮进行选择。本发明根据细胞发育良好，其中所含的细胞生长速率快、细胞活力高、虾青素生物转化活力高的纯种细胞进行选择。本发明雨生红球藻菌株选择雨生红球藻菌种、细胞个体大而生长健壮和细胞生长速率快作为出发菌株，而且所选菌株细胞适合虾青素生物转化及制备的细胞活力高、虾青素生物转化活力高的纯种细胞。所选择雨生红球藻菌株适合于自养培养、异养培养以及混合培养；在异养培养以及混合培养过程中保持高的细胞活力；其细胞虾青素生物转化能力，经虾青素生物转化细胞的虾青素含量大于3％。
本发明所选择雨生红球藻菌株考虑到微藻细胞的细胞发育良好、细胞生长速率快，而且细胞活力高和虾青素生物转化活力高的细胞，不但考虑到雨生红球藻菌株、微藻的生长发育状态，而且还涉及到细胞活力高情况，其目的使所选雨生红球藻菌株，更适合制备细胞活力高和虾青素生物转化活力高的雨生红球藻细胞。
2、本发明对高活力雨生红球藻细胞进行耐酸和适应性驯化处理，提高该细胞对细胞生长环境的耐受力。一般雨生红球藻细胞易受环境因素的影响，在适宜的环境条件下以游动的绿色营养细胞形态存在，在该条件下雨生红球藻生长旺盛；而在不适宜的条件，游动细胞或孢子退去鞭毛，转入不游动细胞阶段，在环境胁迫条件下以不动的厚壁孢子形态存在。
所选雨生红球藻细胞采用逐渐降低pH的耐酸驯化以及适应环境的驯化处理，游动的绿色营养细胞对培养环境适应能力大大提高，促进细胞生长速率的提高，激活原有的酶系，有利于新酶的合成、分泌，使细胞生长活力大大提升。
3、本发明采用LED照射与普通光源相配合的培养方式，光照培养与暗培养周期相结合形式进行雨生红球藻细胞培养，适当提高光照强度，为提高培养过程的细胞浓度和细胞活力打下基础。一般雨生红球藻细胞培养采用普通白炽灯光照的方法，细胞生长速率较低；采用LED照射与普通光源相配合的培养方式，大大促进雨生红球藻生长速率。本发明中雨生红球藻细胞培养采用“随着细胞浓度的提高，适当增加光照强度”方法，减少对细胞生长的光限制因素的影响，使细胞浓度得到大幅度提高，特别在细胞浓度较高时效果明显。
4、本发明有利于雨生红球藻细胞浓度和细胞活力的提高。本发明在雨生红球藻细胞适应性培养以及扩大培养过程及步骤中，采用20-22℃的较低培养温度，使培养细胞处于自养生长状态，所培养的细胞生长发育良好，其中所含的细胞生长速率快、细胞活力高、虾青素生物转化活力高。本发明在含光照培养发酵罐的培养系统培养过程中，采用混合培养，控制发酵系统中CO2含量和培养基质中有机碳源浓度，来控制细胞自养与异养状态，处于混合生长状态，有利于控制培养系统中细胞浓度、细胞生物活力。表2分别是在细胞培养过程中乙酸钠浓度、光照强度对雨生红球藻细胞生长的影响。
表2.在细胞培养过程中乙酸钠浓度、光照强度对雨生红球藻细胞生长的影响
从表2可以看出，在细胞培养过程中，光照和乙酸钠添加量对雨生红球藻的生物量是交互影响的。在不添加乙酸钠的情况下，随着光照强度的增加，光照从0增加到为2500lx，雨生红球藻细胞浓度增加4-7倍多。这时细胞培养处于自养状态。在自然光照射条件下，随着乙酸钠浓度的增加，乙酸钠浓度从0增加到为3.0g/L，雨生红球藻细胞浓度增加3-6倍多。这时细胞培养处于异养状态。而培养处于混合培养状态时，光照从2000lx增加到为4000lx，乙酸钠浓度从1.5g/L增加到为3.0g/L，雨生红球藻细胞浓度增加9-15倍多。这也说明处于混合培养状态的细胞浓度和细胞生长速率较自养培养状态、异养培养状态都要高得多，这也证明处于混合培养状态细胞在细胞浓度增加量和细胞活力保持等方面来得更加优良。
5、本发明采用分别测定细胞培养过程的细胞浓度、细胞活力(叶绿素含量、细胞形态观察)，绘制出雨生血球藻细胞培养过程的细胞浓度以及细胞活力变化动态。根据细胞培养过程的细胞浓度、细胞活力变化，通过改变培养基质、光照以及培养条件等，来控制细胞自养与异养状态及程度，进而达到控制培养系统中细胞浓度、细胞活力，对细胞培养进程进行调节和控制。
6、本发明采用雨生红球藻菌种选育及驯化，控制细胞自养与异养状态，在培养过程光照波长、光照强度以及光源类型对雨生红球藻细胞生长行为以及状态影响，减少或者消除光照对培养过程限制性因素；可有效提高培养过程的细胞浓度、细胞活力及虾青素生物转化活力，制备出含高活力雨生红球藻细胞制备。表3是一般雨生红球藻细胞培养与利用本申请技术生产的雨生红球藻细胞的比较。
通过本发明制备方法生产出的含高活力雨生红球藻细胞，赋予雨生红球藻细胞产生细胞浓度高、细胞活力高和虾青素生物转化活力高，可制备高虾青素含量的雨生红球藻藻粉。
表3.一般雨生红球藻细胞培养与利用本专利技术生产的雨生红球藻细胞的比较
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
实施例1：
本实施例为工业规模的、在含光照培养发酵罐的培养系统中进行的雨生红球藻细胞培养及制备过程。
本实施例雨生红球藻菌株选自雨生红球藻712品系菌株、雨生红球藻GB-235菌株和雨生红球藻NIES-144品系菌株。雨生红球藻菌株及其特性如表4所示。
本发明的具体步骤包括：
第一、菌种的选育及驯化处理，所用菌株：通过菌种选育以及纯种分离，选择雨生红球藻菌株中细胞发育良好，其中所含的细胞生长速率快、细胞活力高、虾青素生物转化活力高的纯种细胞。雨生红球藻藻粉虾青素含量大于3％。经对细胞进行耐酸和适应性驯化处理，提高该细胞对细胞生长环境的耐受力和抗杂菌污染能力。
第二、雨生红球藻细胞的扩大培养步骤，包括雨生红球藻细胞保藏阶段、藻种的扩大培养和雨生红球藻游动细胞的培养；
雨生红球藻细胞保藏阶段：低浓度微藻细胞保存在自养培养液中，在4-6℃条件下每月接种进行短期保藏。
表4雨生红球藻菌株及其特性
三角瓶培养阶段的藻种扩大培养：以10％的接种量将藻种接入灭菌的藻种培养基中，置于1000lx光照条件下，光周期12:12条件下，培养温度22℃条件下在自养状态下培养7天。
藻种培养基(液)：KNO3：0.5g/L，KH2PO4：0.02g/L，MgSO4：0.1g/L，CaCl2：0.08g/L，Fe-EDTA：100μl/L，微量元素：100μl/L。其中Fe-EDTA组成为：EDTA·2Na 3.72g/L，FeSO4·7H2O 4.17g/L。微量元素母液组成为(单位：mg/L)：H3PO4 12.37,MnSO4·H2O 84.51,ZnSO471.89,CuSO4·5H2O 62.42,Na2MoO4·2H2O 7.26,CoCl2·2H2O 4.76.pH为8.0。
三角瓶培养阶段的雨生红球藻游动细胞的培养：以10％的接种量将藻种接入灭菌的生长培养基中，置于1500-4000lx光照条件下，光周期12:12条件下，培养温度22℃条件下，在自养状态下，缓慢通入无菌空气搅拌培养8天。雨生红球藻细胞形态处于绿色、游动营养细胞。
第三、含光照培养发酵罐的培养系统培养阶段的初期培养阶段：以10％的接种量将藻种接入灭菌的发酵罐的培养生长培养基质中，置于1500-4000lx光照条件下，随着细胞浓度提高增加光照强度；光周期12:12条件下，培养温度22±1℃条件下，向培养系统中通入CO2，使培养系统中CO2含量达到1％；在自养状态下搅拌培养6-8天；
含光照培养发酵罐的培养系统培养阶段的恒定培养过程pH、流加培养：在该培养过程中，使培养系统中CO2含量达到3％，流加以乙酸钠为碳源的培养基质，使得雨生红球藻细胞处于混合培养状态(自养与异养结合的状态)，过程pH控制在pH7.0-8.5。采用红光LED照射培养与普通白炽灯光源相配合的方式，置于2500-6000lx光照条件下，随着细胞浓度提高增加光照强度；光照培养与暗培养周期相结合形式，光周期12:12条件下，培养温度22-24℃条件下，进行雨生红球藻细胞培养。雨生红球藻细胞形态处于绿色、游动营养细胞。
通过控制细胞培养过程的光照、基质及其浓度、pH，得到绿色、游动营养细胞，雨生红球藻细胞形态处于绿色、游动营养细胞，细胞大而健壮。叶绿素含量20-60mg/g菌体。
在微藻细胞培养过程中分别测定细胞培养过程的细胞浓度、细胞活力，绘制出细胞培养过程的细胞浓度以及细胞活力变化动态。根据细胞培养过程的细胞浓度、细胞活力变化，通过改变培养基质、光照以及培养条件等，来控制细胞自养与异养状态及程度，进而达到控制培养系统中细胞浓度、细胞生物活力，对细胞培养进程进行调节和控制。得到高活力的、绿色、游动营养细胞。
雨生红球藻细胞扩大培养、含发酵罐的培养系统及培养条件如表5所示。
表5雨生红球藻细胞扩大培养、含发酵罐的培养系统及培养条件
通过以上雨生红球藻细胞扩大培养、含发酵罐的培养系统的工艺制备雨生红球藻藻粉如表6所示。
表6.雨生红球藻藻粉成品质量指标
实施例2：
本实施例是在实验室10L含光照培养发酵罐的培养系统中进行雨生红球藻细胞培养过程，模拟工厂生产细胞培养工艺进行雨生红球藻小型规模的细胞制备过程。
在实验室条件下模拟工厂雨生红球藻细胞培养工艺及过程，在10L培养系统中进行。本实例的试验材料为雨生红球藻GB-235菌株。雨生红球藻菌株形态、生理特性及其菌株特性如表7所示。
表7雨生红球藻菌株及其特性
雨生红球藻细胞培养参照工厂生产细胞培养工艺条件，具体参数如下：
(1)三角瓶培养阶段的藻种扩大培养：接种量为10％，在气候培养箱中，置于1000lx光照条件以及光周期12:12条件下，培养温度22℃条件下在自养状态下培养7天。
(2)三角瓶培养阶段的雨生红球藻游动细胞的培养：接种量为10％，在气候培养箱中，置于1500-4000lx光照以及光周期12:12条件下，培养温度22℃条件下，在自养状态下，缓慢通入无菌空气搅拌培养8天。雨生红球藻细胞形态处于绿色、游动营养细胞。
(3)含光照培养发酵罐的培养系统培养阶段的初期培养阶段：以10％的接种量将藻种接入灭菌的发酵罐的培养生长培养基质中，置于1500-4000lx光照条件下，随着细胞浓度提高增加光照强度；光周期12:12条件下，培养温度22±1℃条件下，向培养系统中通入CO2，使培养系统中CO2含量达到1％；在自养状态下搅拌培养6天。
(4)含光照培养发酵罐的培养系统培养阶段的恒定培养过程pH、流加培养：在该培养过程中，培养系统CO2含量3％，流加以乙酸钠为碳源的培养基质，使得雨生红球藻细胞处于混合培养状态，过程pH控制在pH7.0-8.0。采用红光LED与普通白炽灯光源相配合的光照方式，置于2500-6000lx光照条件下，随着细胞浓度提高增加光照强度；在光周期12:12条件下，培养温度22-24℃条件下，进行雨生红球藻细胞培养。雨生红球藻细胞形态处于绿色、游动营养细胞。
中试细胞培养工艺及过程中，选择培养系统中CO2含量3％，流加以乙酸钠为碳源的培养基质，使得雨生红球藻细胞处于混合培养状态，过程pH控制在pH7.0-8.0。采用红光LED与普通白炽灯光源相配合的光照方式，置于2500-6000lx光照条件下，随着细胞浓度提高增加光照强度。
通过以上细胞培养工艺及制备的含光照培养发酵罐的培养系统中雨生红球藻细胞及生物学特性如表8所示。
表8.含光照培养发酵罐的培养系统中雨生红球藻细胞及生物学特性
需要说明的是，在本说明书的教导下本领域技术人员所做出的任何等同方式，或明显变型方式均应在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种雨生红球藻细胞制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
a菌种的选育及驯化处理，采用雨生红球藻菌种经过选育及驯化的菌株，获得细胞发育良好，细胞活力高的纯种细胞；
b雨生红球藻细胞的扩大培养步骤，包括藻种的扩大培养和雨生红球藻游动细胞的培养；
c发酵罐培养，包括两个阶段，
c1第一阶段：以10％的接种量将藻种接入灭菌的发酵罐的藻种培养基中，于1500-4000lx光照条件下，光照周期12h:12h，培养温度22±1℃，向培养系统中通入CO2，使培养系统中CO2含量达到1-3％，在自养状态下搅拌培养6-8天；
c2第二阶段：在该培养过程中，使培养系统中CO2含量达到1-3％，流加以乙酸钠为碳源的培养基质，使得雨生红球藻细胞处于混合培养状态，过程pH控制在pH7.0-8.5；采用LED照射培养与普通白炽灯光源相配合的方式，以置于2500-6000lx光照条件下，光照培养与暗培养周期相结合形式，在光照周期12h:12h，培养温度22-24℃的条件下，进行雨生红球藻细胞培养。
2.根据权利要求1所述的雨生红球藻细胞制备方法，其特征在于：在雨生红球藻细胞的扩大培养步骤中，调节CO2浓度，控制细胞自养生长状态；在发酵罐培养过程调节CO2浓度以及流加乙酸钠基质，使得雨生红球藻细胞处于混合培养状态；并且调节光照波长、光照强度以及光源类型，改善雨生红球藻细胞生长行为以及状态，减少对细胞生长限制性的影响；利用培养过程的培养基质、光照、温度、pH、通风量环境因素以及细胞浓度和细胞活力，对细胞培养进程进行调节和控制。
3.根据权利要求1或2所述的雨生红球藻细胞制备方法，其特征在于：LED照射与普通白炽灯光照比例为：1：2-6；所述的LED照射培养主要是红光LED照射培养，普通光源照射培养主要是白炽灯照射培养；在培养过程中，采用光照培养与暗培养周期相结合的形式，进行雨生红球藻细胞培养。
4.根据权利要求1或2所述的雨生红球藻细胞制备方法，其特征在于：在菌种选育及驯化处理步骤，通过菌种选育以及纯种分离，选择雨生红球藻菌株中细胞发育良好，其中所含的细胞生长速率快、细胞活力高、虾青素生物转化活力高的纯种细胞；并对高活力雨生红球藻细胞进行耐酸和适应性驯化处理，提高该细胞对其生长环境的耐受力。
5.根据权利要求1所述的雨生红球藻细胞制备方法，其特征在于：步骤b中，藻种的扩大培养步骤包括：以10％的接种量接入灭菌的藻种培养基中，置于500-1000lx光照条件下，在光周期12h:12h，培养温度20-22℃条件下在自养状态下培养7天。
6.根据权利要求1所述的雨生红球藻细胞制备方法，其特征在于，步骤b中，雨生红球藻游动细胞的培养包括：以10％的接种量将藻种接入灭菌的藻种培养基中，置于1500-4000lx光照条件下，控制光照周期为12h:12h，在自养状态下缓慢通入无菌空气搅拌培养8天。
7.根据权利要求1或2所述的雨生红球藻细胞制备方法，其特征在于：在雨生红球藻扩大培养过程中，采用20-22℃的较低培养温度。
8.根据权利要求1或2所述的雨生红球藻细胞制备方法，其特征在于：在菌种选育及驯化处理、含发酵罐的培养系统培养步骤中，分别测定不同细胞浓度、细胞生物活力以及细胞的虾青素生物转化活力，绘制出细胞培养过程中细胞浓度、细胞生物活力的变化动态，根据细胞培养过程细胞浓度以及细胞生物活力变化，利用细胞培养过程的培养基质、光照、温度、pH、通风量以及细胞浓度，对细胞培养进程进行调节和控制。
9.根据权利要求1所述的雨生红球藻细胞制备方法，其特征在于：在培养细胞中，雨生红球藻细胞形态处于绿色、游动营养细胞，细胞大而健壮；雨生红球藻细胞叶绿素含量较高及细胞活力高，细胞虾青素生物转化活力较高。
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