CN106906142A - 一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法，包括藻种的培养、种瓶培养、封闭式管道光生物反应器培养、室内池光生物反应器培养和室外池反应器虾青素累积培养；藻种先在实验室内优化的生长条件下，使其快速生长繁殖，待累积到一定的细胞量后，通过无菌管路接种到封闭式管道光生物反应器中进行二级扩大培养，待红球藻生长到一定密度，再接种到室内池式光生物反应器中进行三级生长培养，达到最高藻细胞数，随后将培养完成后的红球藻绿色细胞转入室外池式生物反应器中，在胁迫条件下使其大量累积虾青素，最终完成雨生红球藻的规模化生产流程。与现有技术相比本发明虾青素含量超过目前报道的国际水平，达7.2%以上。

Description

一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法

技术领域

本发明涉及生物培养技术领域，具体涉及一种高含量虾青素血球藻培养方法。

背景技术

虾青素具有超强的抗氧化和捕获自由基的能力，能有效淬灭在剧烈活动过程中肌肉内产生的大量单线态氧和自由基等废物。自由基的化学性质非常活泼，极易参加氧化还原反应，能触发链式反应而导致生物膜上的脂质发生过氧化，从而破坏膜的结构和功能；它能引起蛋白质变性和交联，使酶和激素失活；使机体的免疫能力降低，破坏核酸的结构并导致代谢异常等。虾青素分子有很长的共轭双键，有羟基和位于共轭双键链末端的不饱和酮基，其中羟基和酮基又构成a- 羟基酮（见图1），这些结构都具有活泼的电子效应，能向自由基提供电子或吸引自由基的未配对电子，易与自由基反应而清除自由基，起到抗氧化作用。许多类胡萝卜素都具有生物抗氧化剂的功能，但虾青素的抗氧化作用比一般的类胡萝卜素更强，其还原活性是其它类胡萝卜素的10倍，为维生素E 的100~550 倍，被称为超级维生素E。虾青素具有增强免疫力，抗癌症，防止皮肤衰老，维护眼睛及中枢神经系统健康等多种生理功能。

虾青素进入生物体后可以不经修饰或生物转化直接贮存在组织中，使一些水生动物的皮肤和肌肉出现健康而鲜艳的颜色，使禽的羽毛、皮肤、脚及禽蛋呈现金黄色或红色。此外，在增加养殖对象着色，提高存活率，促进生长、繁殖、发育等方面也具有显著作用。欧美及日本等国已批准将其作为安全的动物饲料。近年，虾青素已广泛应用于水产养殖中。此外，在保健品、化妆品及医药方面，虾青素强大的生理功效和广阔的市场前景也引起了国际上的普遍关注。

目前，国外已成功实现了虾青素的商业化生产，其市场售价约为每千克2500美元，且需求量正在迅速上升中。美国Cyanotech公司已从雨生红球藻中提取虾青素，生产出了BioAstin天然虾青素胶囊，并通过了美国食品及药品管理局认证，达到GMP 标准。该产品在美国、俄罗斯、澳大利亚、日本等地区已成为人们首选的纯天然补充食品。

国际上已具备的虾青素生产工艺有化学合成和生物提取两种，但化学合成的虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面均较天然虾青素逊色。目前，世界各国对化学合成虾青素的管理越来越严，如美国已禁止其进入保健食品市场。动物和人体实验的结果表明，天然虾青素无任何致病效应或毒副作用，对人体绝对安全。因此，开发天然虾青素及其生物来源已成为虾青素生产研究的一项重要课题。

如今，在天然虾青素的生物来源中，雨生红球藻中的虾青素含量最高，该藻在逆境中可积累虾青素，其细胞内积累的虾青素占类胡萝卜素总量的90% 以上，虾青素含量可达藻体干重的8%。所含虾青素的结构形式亦与水生动物所需一致，所以被公认为自然界中生产虾青素最好的生物来源，并已成为近年来国内外虾青素研究的热点。

雨生红球藻Haematococcus pluvialis是一种生活在淡水中的单细胞绿藻，隶属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲（Chlorophyceae)、团藻目(Volvocales)、红球藻科(Haematococceae)、红球藻属(Haematococcus)，是目前已知的虾青素含量最高的生物。雨生红球藻因自身所积累虾青素物质可高达干重的1.5%～3.0%，被视为天然虾青素的“浓缩品”。因此规模化培养雨生红球藻成为获取天然虾青素的最佳途径，是目前得到各国大力推进的新型生物技术产业。

在自然界中，雨生红球藻常分布于小面积间歇性水体。雨生红球藻生长过程可分为两个阶段，游动阶段和不动阶段。游动阶段的红球藻细胞呈卵形或椭圆形，细胞宽3~5μm，长3~8μm，有时甚至更大些。原生质体和细胞壁间由很多分枝或不分枝的细胞质连丝相连，空隙充满胶状物质；原生质体前端常呈乳头状突起；伸缩泡数个至数十个，不规则地分散于原生质体内；运动细胞具两条顶生、等长、约等于体长的鞭毛，通过前端的叉状胶质管伸出细胞壁；细胞核位于细胞中央；叶绿体呈杯状、复杂的网状或颗粒状，并且具有典型的绿藻蛋白核；具一个眼点，位于细胞近中部的一侧。游动阶段细胞呈绿色，不动阶段细胞呈圆形，无鞭毛，不会游动，大多沉在水底。细胞大小变化幅度较大，细胞大小宽19~51μm，长28~63μm。细胞壁由纤维素层和果胶层组成，且含有花粉素样成分。环境胁迫下，形态发生巨大变化：鞭毛逐渐消失，成为不能运动的休眠细胞；原生质中积累了大量含虾青素的脂质小体；细胞壁增厚，以抵抗氧化性损伤；细胞体积增大，直径可达原来10倍；分裂停止；细胞逐渐变红。此时的细胞称为静孢子或厚壁孢子(陈峰等，1999； Fabregas et al.，2001：朱劲华等.2003)，该阶段细胞壁与膜的距离较近，有的壁薄，有的则较厚。不动阶段的细胞常因虾青素积累使整个细胞呈红色。

雨生红球藻生长的营养类型有二种：(1)光合自养型，即利用光能吸收二氧化碳进行光合自养生长；(2)异养生长型，利用有机碳源如醋酸盐在黑暗条件下进行异养生长：(3)混合营养型，即在光照条件下同时利用有机碳源和二氧化碳进行混合营养生长。生长的营养类型不同，雨生红球藻的适宜生长条件也有差异。

通常，处于旺盛生长阶段的雨生红球藻细胞为绿色。在弱光、氮磷丰富的环境中，雨生红球藻生长旺盛，细胞内含有少量虾青素，主要以绿色的游动细胞形式存在；而在不利于生存的条件(高光照、高温、高盐和营养盐饥饿)下，细胞分裂减慢，细胞变成不动状态(厚壁孢子)并积累虾青素。此时，藻细胞中常因含有大量虾青素而呈现红色。

国内外已进行了大量雨生红球藻中虾青素积累机制的研究工作，所获结论多有争议。主要有两种观点，一种观点认为，强光下虾青素的积累主要起到滤光作用，保护旺盛生长的雨生红球藻细胞及其光合作用免受强光的伤害；另一种观点认为，虾青素的积累是不动细胞的次生代谢产物，仅限于逆境条件下发生。Tjahjono等(1994)研究表明，光诱导产生活性氧，促进虾青素合成，抵抗逆境引起的氧化损伤。

作为一种次生的类胡萝卜素，虾青素及其在细胞内的积累部位一直是研究的焦点。庄惠如等(2000)应用透射电镜研究了在胁迫条件下，雨生红球藻积累虾青素过程中藻细胞的超微结构变化。发现随着细胞丧失运动能力，转变成厚壁孢子，在核周围开始迅速沉积色素，色素颗粒几乎占据细胞质的大部分区域并相互融合，但其沉积位置则保持不变。证实环境胁迫可导致雨生红球藻细胞大量沉积次生类胡萝卜素，积累部位在质体外，细胞核周围的细胞质基质中。随着色素颗粒的增多，酯溶性色素小颗粒彼此融合，形成更大的颗粒，进而掩盖了叶绿素使得细胞呈现出明亮的红色。

然而，虾青素的雨生红球藻生产技术仍有待完善，尤其在雨生红球藻培养、虾青素积累及提取等方面仍存在相当的技术难题。

目前在培养雨生红球藻生产虾青素过程通常采用一步法，即在同一培养装置中完成全部的生产工艺。光生物反应器技术应用于雨生红球藻生产虾青素通常采取一步法的生产模式（ZL02138827.X ），即在同一生物反应器中需要完成雨生红球藻营养细胞的培养扩增，转化及虾青素累积，导致了一次性成本投入极高，调控复杂，产品效益不明显。如公告号为CN1966660 ，专利名称为“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”的发明专利，公开了一种设置在固定架上的光生物反应器系统的培养装置。

国内外较多采用两步法诱导雨生红球藻细胞积累虾青素，根据雨生红球藻的不同存在形式，一般将虾青素的生产分成微藻培养和虾青素积累两阶段进行。即首先在最适生长条件下培养雨生红球藻的游动细胞，使其高密度生长，最大限度地获取生物量；接下来通过改变培养条件诱导虾青素的大量积累，同时伴随厚壁孢子的形成。在生产工序上，培养环节属于营养生长，需要常温、弱光、高营养盐，碳/氮比小，而转化与累积过程需要高温、强光、高营养盐，碳/氮比大，二步法具有更高的培养效率。其实，无论采用一步法还是二步法，培养雨生红球藻生产虾青素的关键环节之一是转化过程。转化的诱导与促进方法主要有三类：

其一是光因子的诱导，公告号为CN1966660 ，专利名称为“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”的发明专利，公开了人工LED光源对雨生红球藻照光培养。也有光因子与温度影响相结合的诱导方法。其二是营养的诱导，公告号为CN101586140 ，专利名称为“一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法”的发明专利，公开了调节和控制氮、磷含量，pH值，培养温度，光照强度，光照时间，添加矿盐，实现生长与转化。其三是利用植物生长调节剂，如公告号为CN101803600A ，专利名称为“雨生红球藻细胞生长促进剂及其使用方法”的发明专利，公开了萘乙酸、3-吲哚丁酸加入到雨生红球藻细胞的培养基中，促进生长。如公告号为CN101974599A ，专利名称为“利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法”的发明专利，公开了一种利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法，类似的还有茉莉酸甲酯、茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法。

尽管雨生红球藻是已知的天然虾青素含量最高的生物资源，但其含量仍然需要提高以适合规模化生产。以前实验室研究和规模化培养使用的藻株多为自然界分离的野生株，存在许多缺陷：养殖过程中易被其它微藻、变形虫、原生动物、细菌等污染；只适合低温培养，28℃以上生长受抑制；生长相对较慢，培养周期长等。因此，筛选出温度适应范围广、生长速率快、虾青素含量高的雨生红球藻株一直是本领域努力的方向，也是本课题首先解决的问题。其次，雨生红球藻积累虾青素的环境因素和营养条件还有待探索，应用开发上还有许多关键问题和技术需要突破。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种四步法的高含量虾青素血球藻的规模化生产方法，细胞生长培养所需时间从过去的20多天缩短到12天（缩短7-8天），虾青素含量提高了2倍多。

本发明采取的技术方案是：

一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法，其特征在于：包括藻种的培养、种瓶培养、封闭式管道光生物反应器培养、室内池光生物反应器培养和室外池反应器虾青素累积培养；藻种先在实验室内优化的生长条件下，使其快速生长繁殖，待累积到一定的细胞量后，通过无菌管路接种到封闭式管道光生物反应器中进行二级扩大培养，待红球藻生长到一定密度，再接种到室内池式光生物反应器中进行三级生长培养，达到最高藻细胞数，随后将培养完成后的红球藻绿色细胞转入室外池式生物反应器中，在胁迫条件下使其大量累积虾青素，最终完成雨生红球藻的规模化生产流程；

所述的种瓶培养阶段是采取诱变育种的方法筛选出室内外生长均适合，且生长周期短，生产率高，虾青素含量高的藻株，包括如下步骤：

1）EMS诱变：将Haematococcus pluvialis系列雨生红球藻天然藻种培养到对数生长期的藻液600ml，4000rpm离心5min，弃上清液；将不同剂量EMS加入到0.06M、pH值为7. 0的磷酸缓冲液中配置得到最终浓度分别为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的诱变液，分别将藻体加入六种诱变液中在黑暗条件下处理4h，然后加入1ml、5%的硫代硫酸钠终止诱变反应，离心去除诱变液，藻体用新鲜营养液洗涤两次，避光12h后置于光照条件下培养；

2）叠氮钠诱变：将Haematococcus pluvialis系列雨生红球藻天然藻种培养到对数生长期的藻液900ml均分到9个250ml的三角瓶中，取不同量的叠氮钠溶液加入各个三角瓶中，迅速混匀，使叠氮钠的最终的浓度分别为100 mg/L、120mg/L、140mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200mg/L、220mg/L、240mg/L、260mg/L，黑暗中处理12小时，4000rpm离心5min，去除诱变液并用新鲜的营养液洗涤两次，最后将处理后的藻体悬浮到100ml新鲜营养液中，于室温自然光下培养；

3）突变株的筛选：在超净工作台中，将步骤1）和2）处理后的样品分别在固体琼脂平板上划线，之后平板先在光强光照为50~100UM条件下培养，长出绿色藻落后置于200 UM光强条件下诱导虾青素积累，然后挑取藻落大颜色最红的单藻落，分离得到了30个雨生红球藻较优诱变株，再分别接入液体培养液；

4）优良藻株的筛选：将步骤3）筛选出的经过步骤1）EMS诱变的较优诱变株按照步骤2）叠氮钠诱变的方法再次诱变；将步骤3）筛选出的经过步骤2）叠氮钠诱变的较优诱变株按照步骤1）EMS诱变的方法再次诱变；经琼脂平板划线培养再次分离得到30个变异藻株，培养四、五代后详细测定各自的生长速率和虾青素含量，从中找出15个生长速率和虾青素含量排名靠前的藻株；之后连续培养半年，经20多代后，对于各项特征稳定的藻株，再次测其生长和虾青素积累情况，从中找到3个可以用于生产试验的优良藻株；

5）最优藻株的筛选：以BBM培养基作为基础培养基，接种处在对数生长期的优良变异株于三角瓶内，再放入光照培养箱内培养，以浓度为1.25g/L的NaNO₃为氮源，53.3mg/L-80.0mg/L的中高磷浓度； 1g/L以下较低浓度的碳酸氢钠为碳源， 0.25~0.5%的盐度，VB_l2浓度为50~75μg/L，pH值为7.0~8.0，培养温度24士0.5℃，由40W日光灯提供照明，光照强度为90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12∶12，培养时间10~12d，每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁，从中选出最优藻株。

进一步地，当所述的封闭式管道光生物反应器为柱式光生物反应器时，其聚乙烯透明塑料袋的底部逐渐窄缩成漏斗状，保证其底部四周藻液充分流动，营养分布均匀一致，氧气解析和二氧化碳交换补偿充分，采用环形牵引支架增强其抗倒伏性。

附图说明

图1是虾青素的分子结构。

图2是雨生红球藻的绿色游动细胞。

图3是雨生红球藻的红色厚壁孢子。

图4是诱变株在硝酸钠氮源不同浓度培养基的生长情况。

图5是诱变株在硝酸铵氮源不同浓度培养基的生长情况。

图6是诱变株在硝酸钠氮源培养基的生长曲线。

图7 是诱变株在NaNO₃为氮源培养基的OD值变化曲线。

图8 是H.P-1的细胞形态。

图9 是H.P-2的细胞形态。

图10 是H.P-3的细胞形态。

图11 是H.P-1在不同p浓度培养基的生长曲线。

图12是H.P-1在不同P浓度培养基的OD值变化曲线。

图13是H.P-1在不同醋酸钠浓度培养时的生长曲线。

图14是H.P-1在不同NaHCO₃浓度培养时的生长曲线。

图15 是H.P-1在不同NaHCO₃浓度培养时OD值变化曲线。

图16是H.P-1在不同NaCl浓度培养时的生长曲线。

图17是H.P-1在不同NaCl浓度培养时的OD值变化曲线。

图18是H.P-1在不同温度培养时的生长曲线。

图19是H.P-1在不同温度培养时的OD值变化曲线。

图20是H.P-1在不同光照培养时的生长曲线。

图21是H.P-1在不同光照培养时的OD值变化曲线。

图22是H.P-1在不同pH值培养时的生长曲线。

图23是H.P-1在不同pH培养时的OD值变化曲线。

图24是H.P-1在不同VB₁不同浓度培养时的生长曲线。

图25是H.P-1在不同VB₁₂不同浓度培养时的生长曲线。

图26是H.P-1在不同VB₁/VB₁₂不同浓度培养时的生长曲线。

具体实施方式

雨生红球藻诱变育种及突变株的筛选

尽管雨生红球藻是已知的天然虾青素含量最高的生物资源，但其含量仍然需要提高以适合规模化生产。以前实验室研究和规模化培养使用的藻株多为自然界分离的野生株，存在许多缺陷：养殖过程中易被其它微藻、变形虫、原生动物、细菌等污染；只适合低温培养，28℃以上生长受抑制；生长相对较慢，培养周期长等。因此，筛选出温度适应范围广、生长速率快、虾青素含量高的雨生红球藻株一直是本领域努力的方向，也是本课题首先解决的问题。本课题采取诱变育种的方法，在我们的合作伙伴—德国布鲁拜尔国家公司初步筛选出15个藻株，再经我们的复筛得到3个用于生产试验的藻株。

诱变育种

采用各种物理的或化学的手段，人工诱发有机体产生遗传物质的变异，并经过人工选择、鉴定，培育所创造新品种的育种途径称为诱变育种。诱变育种可以提高生物体变异的频率，大幅度改良某些性状，加速育种进程，对微生物育种来说是有效且实用的方法。

诱变育种起始于20世纪20年代末。最早发现x射线和化学药剂可提高基因突变频率。到目前为止发现的诱变剂可谓多种多样，分为物理的、化学的和生物的三类。物理诱变剂中常用的有紫外线、X射线、γ射线、α射线、β射线、超声波、离子束和激光等。物理诱变剂对生物体的作用主要是高能辐射引起的生物系统的损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂反应；化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质，其种类极多。常用的有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、硫酸二乙酯、羟胺、氯化锂，氯化锰等；生物诱变剂，是指一段外源DNA片段，它能被导入到受体细胞，并整合(插入)到受体DNA中而引起基因突变和性状变化，而且这种变化可在后代中遗传。

雨生红球藻的育种工作中，关键的一步是分离得到单一藻株。从混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，以获纯种培养。

本实验所用藻种Haematococcus pluvialis系列，为德国布鲁拜尔国家公司在世界各地分离的天然藻种。

本研究选用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS)和叠氮钠(NaN₃)分别处理雨生红球藻，测定各种诱变剂的致死率，及对红球藻生长和虾青素积累的影响，根据实验结果确定合适的诱变剂量和诱变时间，通过初筛、复筛、再诱变，再初筛、复筛等过程，分离、筛选出生长速度快、虾青素含量高的藻株。

实验结果表明：浓度为0.3%~0.8% EMS处理2~4h，雨生红球藻的死亡率35%~60% ；叠氮钠100~260mg/L处理10~12h，雨生红球藻的死亡率为30%~100%。EMS处理后的存活细胞，呈圆球状，部分失去鞭毛和前端突起，游动缓慢，处理后第二天，细胞即恢复游动和分裂，分裂方式与正常细胞相似。叠氮钠处理后的存活细胞，胞壁加厚，呈深绿色，圆球状，部分失去鞭毛和突起，出现不动细胞，培养一段时间后才出现分裂细胞。游动的和不动的存活细胞主要是采用不对称无性繁殖。

诱变方法

EMS诱变

将雨生红球藻出发藻种培养到对数期的藻液600ml，4000rpm离心5min，弃上清液。用含不同剂量EMS的磷酸缓冲液(0. 06M， pH7. 0)悬浮至60ml，分装于6个试管，加EMS至最终浓度分别为：0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%。黑暗条件下处理4h，加入l ml硫代硫酸钠(5%)终止诱变反应。离心去除诱变液，用新鲜营养液洗涤两次，避光12h后置于光照条件下培养。

叠氮钠诱变

将雨生红球藻出发藻种培养到对数生长期的藻液分装到250m1的二角瓶中，每瓶100m1，取不同量的叠氮钠溶液加入各个三角瓶中，迅速混匀，使最终的浓度分别为100 mg/L、120mg/L、140mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200mg/L、220mg/L、240mg/L、260mg/L。黑暗中处理12小时，4000rpm离心5min，去除处理液并用新鲜的营养液洗涤两次，最后将处理的藻体悬浮到100m1新鲜营养液中，于室温自然光下培养。

突变株的筛选

在超净工作台中，将处理后的样品在固体琼脂平板上划线，之后平板先在光强光照为50~100UM条件下培养，长出绿色藻落后置于200 UM光强条件下诱导虾青素积累，然后挑取藻落大颜色最红的单藻落，分离得到了30个雨生红球藻诱变株，再分别接入液体培养液。在液体培养液中培养至一定细胞密度后测定生长速率和虾青素积累情况，筛选生长快、虾青素含量高的藻株。

诱变剂处理后，各组存活藻株的生长和虾青素积累情况同对照组相比发生了变化：EMS实验中，0. 6% EMS组生长速率提高34%，各组单细胞虾青素含量和积累速率均高于对照组，其中0. 8%处理组单细胞内虾青素含量分别提高了86%，积累速率提高了120%；叠氮钠实验中，160mg/L和200mg/L组细胞生长速率分别提高了 29%和15%，各组藻细胞内虾青素含量和虾青素积累速率得到明显的提高。其中160 mg/L和180 mg/L组单细胞内虾青素含量提高幅度最大，分别提高95%和130%。 180mg/L和220mg/L组虾青素积累速率提高幅度最大，分别为290%和240%。

每种诱变剂都有优点和缺点，单一诱变得到理想突变株的机率较小。复合诱变不仅大大提高诱变效率，还取长补短，弥补单一诱变的缺陷。

将两种诱变剂单独处理筛选得到的优良突变株，分别用另一种诱变剂处理，经琼脂平板划线培养再次分离得到30个变异藻株，培养四、五代后详细测定了各自的生长速率和虾青素含量，从中找出15个优良的藻株。之后连续培养半年，经20多代后，对于各项特征稳定的藻株，再次测其生长和虾青素积累情况。从中找到3个可以用于生产试验的优良藻株，命名为H.P-1、H.P-2、H.P-3。

最优培养条件筛选

影响雨生红球藻培养的营养及物理环境因子主要包括温度、光强、pH值、溶解氧及营养盐含量等参数，国内外已有相当多的研究报道。在通过对文献报道的虾青素生产两阶段的主要影响因子数值范围归纳总结基础上，找出关键影响因素，逐一进行最优培养条件试验。

培养方法的实验设计

到目前为止，可用于培养雨生红球藻的营养配方报道的很多，主要有BBM (Harker等，1996)、BG-11 (Torzillo等，2003)、OHM(Fabregas等，1998)、MAV(蒋霞敏等，2005)、MCM(金传荫等，1996)等。这些培养基配方间差异相当大，这说明了雨生红球藻具有比较强的生存适应能力。但是到底哪种培养基最适合雨生红球藻生长现在还没有定论，因此还需要对雨生红球藻生长的适宜营养条件进行研究。

本研究是以BBM培养基作为基础培养基，接种处在对数生长期的H. pluvialis 变异株于三角瓶内，再放入光照培养箱内培养。培养温度24士0.5℃，由40W日光灯提供照明，光照强度为90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12∶12。培养时间10~12d左右。每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁。之后转入最优培养条件试验。

培养雨生红球藻的BBM培养基组成(mg/L)如下：

(1)NaNO₃，250；(2)MgSO₄·7H₂O，75；(3) NaCl，25；(4)K₂HPO₄，75；(5)KH₂PO₄，175；(6)CaCl₂·2H₂O，25；(7)Trace elements solution∶ZnSO₄·7H₂O，8.82；MnCl₂·4H₂O，1.44；Na₂MoO₄·2H₂O，1.93；CuSO₄·5H₂O，1.57；Co(NO₃)₂·6H₂O，0.49；(8)H₃BO₃，11.4；(9)EDTA-KOH solution：Na₂-EDTA，50；KOH，31； (10)FeSO₄·7H₂O，4.98：Conc.H₂SO₄，l.0ml。

最优营养条件筛选

氮源

氮是雨生红球藻生长的必需营养素。资料显示，红球藻培养的最适氮源为硝酸盐，以2.5~10mmol/l的浓度范围为宜。也有报道NH₄NO₃的效果更好。氮缺乏可引起虾青素的大量积累。Fbbregas等(2001)指出只有培养液中的氮完全消耗时虾青素才出现明显积累。在雨生红球藻的生长末期，由于营养盐的减少，主要是氮营养的缺乏易引起雨生红球藻积累虾青素。多个实验结果表明氮缺乏会引起红球藻中虾青素的大量积累(Renstrom et al.，1981；Lee&Soh，1991；Borowitzka et al.，1991)。如Borowitzka等在实验观察到，红球藻的绿色游动细胞在0.01g/L的KNO₃培养基中培养10天即全部转变成红色细胞；而在0.1 g/L的KNO₃浓度下，38天时才有部分红色细胞形成。但Boussiba等认为虾青素合成不能没有氮，这很可能是由于红球藻细胞为支持虾青素的大量积累而连续合成蛋白质时对氮的需要上(Bousiba & Vonshak，1991)。Fabregas等(2001)指出当培养液中氮完全消耗时可以出现明显的虾青素积累。Boussiba等(1992)却报道氮的存在是虾青素积累的必要条件。

因此，需要研究NH₄NO₃和NaNO₃二种N源及浓度对诱变株生长的影响。

以BBM培养基中NaNO₃为氮源对照，设置5个处理组，各处理组设三个平行。一组为对照(NaNO₃浓度250 mg/L)，其它试验组的NaNO₃浓度分别为500 mg/L，750 mg/L，1000mg/L，1250mg/L，1500mg/L。NH₄NO₃浓度分别为150 mg/L，300 mg/L，450 mg/L，600mg/L，750mg/L，900mg/L。

将处于对数生长后期的雨生红球藻诱变株藻液，以4000 r/min离心5 min，去掉上清液。剩下的藻以BBM培养基(不含有任何氮元素)的培养液进行培养。48h后，再以4000rpm离心3min，去上清，并用蒸馏水重新悬浮、离心三次，再将藻泥接种于含有不同N源的培养液中，均分到250 mL三角瓶中，调整藻液密度约0.5×10⁵个/mL。置于光照培养箱内培养。培养温度24±0.5℃，由40W日光灯提供照明，光照强度为90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12：12。培养时间12天。每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁。不同实验组每隔24h取样进行观察并测定相关参数。

3株诱变株雨生红球藻H.P-1，H.P-2，H.P-3在试验培养基中培养12d的生长曲线和OD值的变化情况分别见图4和图5。由图中曲线的高度可以看出，以NH₄NO₃为氮源培养诱变株的生长量均不如以NaNO₃为氮源培养的好。其中最高点为1.25g/L的NaNO₃浓度，并以H.P-1表现的最好。

图6和图7是3株诱变株雨生红球藻H.P-1，H.P-2，H.P-3在以浓度为1.25g/L的NaNO₃为氮源的试验培养基中，培养12d的生长曲线和OD值的变化情况。

由图6和图7可以看出H.P-1的生长速率和最终的细胞密度都显著高于H.P-2和H.P-3两株藻。H.P-1的细胞密度最高可以达到8.4×10⁵个/L，而H.P-2与H.P-3最高细胞密度分别为7.5×10⁵个/L和6.2×10⁵个/L。680nm的OD值曲线也可明显看出：在生长初期，3株雨生红球藻的680mn处的吸光值相近，而在生长后期，H.P-1的吸光度明显增高。显微镜观察，H.P-1的细胞形态很好，在生长后期藻液浓绿。而H.P-2与H.P-3在生长后期藻细胞明显变大，藻液带有暗绿色或发黄，即出现向不动细胞转变的迹象，见图8和图9和图10。

从细胞干重和虾青素含量的比较可知（见表1），H.P-1、H.P-2和H.P-3三株诱变株生长到20d，测定它们单位体积的藻细胞干重和虾青素含量，在以1.25g/L浓度的NaNO₃为氮源的试样中，细胞干重明显高于其他两株雨生红球藻；在实验所用的10种培养基中，以浓度为1.25g/L的NaNO₃为氮源试样的H.P-1最终细胞干重最高，达到5.04g/L。H.P-2、H.P-3的最终细胞干重分别为3.64 g/L和2.45g/L。从虾青素含量方面来看，也是同样情况（见表1）。从上述实验对3株雨生红球藻诱变株生长情况的研究得出∶H.P-1的生长速率、最终细胞密度，最终的虾青素含量以及藻细胞干重明显高于其他藻株(见表1)。3株实验藻中H.P-1是比较适宜作为进一步试验及扩大化培养用于工业生产虾青素的藻株。

表1 不同NaNO₃浓度培养诱变株的最终细胞密度、干重及虾青素含量

磷源

营养盐中等浓度的磷(0.1g/l K₂HPO₄)即可满足雨生红球藻的生长需要。相关研究表明，磷饥饿可促进虾青素积累，但其作用不如氮显著。然而，Boroei tzka等(1991)指出高P有利于虾青素的积累。

本研究是以BBM培养基作为基础培养基，置换成氮源试验得出的最优（1.25g/L）NaNO₃浓度。以BBM培养基中的KH₂PO₄与K₂HPO₄为磷源及其比例，即P浓度53.3g/L为对照，以其0.25、0.5、1.5、2倍量的浓度设置4个处理组，各处理组设三个平行。试验组的P浓度分别为13.3mg/L，26.6 mg/L，53.3mg/L， 80mg/L和106.6mg/L。

将处于对数生长后期的H.P-1雨生红球藻藻液，以4000 r/min离心5 min，去掉上清液。剩下的藻以BBM培养基(不含有任何P元素)的培养液进行培养。48h后，再以4000rpm离心3min，去上清，并用蒸馏水重新悬浮、离心三次，再将藻泥接种于含有不同P浓度的培养液中，均分到250 mL三角瓶中，调整藻液密度约0.5×10⁵个/mL。置于光照培养箱内培养。培养温度24±0.5℃，由40W日光灯提供照明，光照强度为9μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12：12。培养时间10天左右。每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁。不同实验组每隔24h取样进行观察并测定相关参数。

不同P浓度条件下，H. P-1的生长曲线和OD值变化情况见图11、图12。在前7-8天，P浓度为13.3mg/L、26.6mg/L、53.3mg/L、80.0mg/L时，H. P-1的细胞密度和OD值都处于快速增长时期；而在8天后则增加较慢。五个浓度的试样，最终的藻液细胞密度还比较接近，见表2，其结果并没有明显差异(P>0.1)。在培养的末期，藻细胞光吸收值最高的为P浓度为80.0mg/L，OD值达到0.95；经数据分析仅与最高P浓度106.6mg/L试样藻液的OD值之间存在显著性差异(P<0.01)，与其他浓度下的没有明显差异。

表2 H.P-1在不同磷浓度培养基的最终细胞密度、干重及虾青素含量

不同P浓度培养，藻液单位体积的干重见表2。三种中等水平P浓度试样的单位体积干重比较接近，它们之间差异性不显著(P>0.1)。最低与最高P浓度试样藻液单位体积的干重较小，与最优实验组的差异性极显著(P<0.01)，通过镜检观察：在此P浓度下培养的藻细胞个体较小，不动孢子数目很少。藻液单位体积的虾青素含量见表2。虾青素含量最高为35.2mg/L，显著高于最高(106.6mg/L)和较低（13.3mg/L、26.6mg/L）P浓度试样的虾青素含量(P<0.01)。还可以得出结果，中高P浓度(53.3mg/L、80.0mg/L)的情况下，H. p -1的细胞干重以及虾青素含量都显著优于其它处理组(P<0.01)

碳源

资料显示，在培养基中加入一定浓度的醋酸盐利于雨生红球藻生长。合成类胡萝卜素的前体化合物(如甲羟戊酸盐、丙酮酸盐)对虾青素的合成起促进作用。当向红球藻生长相中加入醋酸盐或丙二酸钠时，会很快诱导运动细胞向厚壁孢子转变并加速积累虾青素。庄惠如等(2000)研究表明，醋酸钠较其它碳源更适于维持雨生红球藻的混合营养和异养生长。两种营养类型下，雨生红球藻对醋酸钠的浓度要求分别为0.5~1.0g/l和1~1.5g/l。充足的碳源对虾青素的积累也很重要。但Orosa等(2001)提出，若碳源加入过量将严重抑制红球藻的生长。

醋酸盐对虾青素积累的促进作用分别受到DNA转录和蛋白翻译抑制剂ActinomycinD和Cycloheximide的阻抑，说明醋酸盐的这种调控作用发生在虾青素合成酶的基因转录水平上(Kobayashi et al.，1993)。Kokizono等(1992)的实验结果表明：仅在红球藻的生长相添加醋酸盐会诱导细胞形成富含虾青素的厚壁孢子；当醋酸盐与高浓度的硝酸盐一同加入时，红球藻内虾青素的合成受到剧烈抑制，这表明虾青素的合成可能受到碳氮比的影响，进一步证实了培养液中较低的氮浓度对虾青素积累的重要性(Orosa et al.，2001)。

由上所述，需要研究不同浓度醋酸钠和碳酸氢钠对H.P-1虾青素积累的影响。醋酸钠浓度设置为：0g/L，0.5g/L，1.0L，2g/L和3 g/L。设置5个处理组，各处理组设三个平行。将处于对数生长后期的雨生红球藻藻液，以4000 r/min离心5 min，去掉上清液。藻泥用优化调整了N、P的BBM培养基重新悬浮，调整藻液密度约0.5×10⁵个/mL，均分到250 mL三角瓶中。置于光照培养箱内培养。培养温度24±0.5℃，由40W日光灯提供照明，光照强度为90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12：12。培养时间12天。每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁。不同实验组每隔24h取样进行观察并测定相关参数。

不同浓度醋酸钠条件下，藻液的OD值的变化情况见图13。从图可以看出，在添加醋酸钠条件下，第六、七天前，各处理组藻液的OD值均高于对照。第七天后，醋酸钠浓度为2g/L以上时，藻液的OD值增长低于对照。第十天以后，高浓度处理组细胞密度开始下降。因而可知，高浓度醋酸钠抑制藻细胞的生长。对照组在实验初期生物量略低于处理组，第七天后其生物量持续增加，藻细胞的最终OD值高于添加醋酸钠的各处理组。

尽管醋酸钠抑制藻细胞的生长，H. P-1细胞在实验初期仍然维持较高速率的生长，随着时间的延长，醋酸钠对藻细胞的生长抑制作用增强，最终对照和低浓度醋酸钠浓度（1g/L）的试样中细胞生物量差异不大。

研究不同浓度碳酸氢钠对H.P-1虾青素积累的影响时，碳酸氢钠浓度设置设置5个处理组，各处理组设三个平行。分别为：0，0.5，1.0，1.5，2.0 g/L。将处于对数生长后期的雨生红球藻藻液，以4000 r/min离心5 min，去掉上清液。藻泥用调整氮源和磷源为最优浓度的BBM培养基重新悬浮，调整藻液密度约0.5×10⁵个/mL，均分到250mL三角瓶中。分别加入设定的碳酸氢钠。置于光照培养箱内培养。培养温度24±0.5℃，由40W日光灯提供照明，光照强度为90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12：12。培养时间12天。每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁。不同实验组每隔24 h取样进行观察并测定相关参数。

藻液生长曲线的变化情况见图14。从图14可以看出，添加碳酸氢钠为碳源培养H.P-1的试样，在第8d前，生长速度均高于对照，此后，碳酸氢钠浓度高的试样，其生长速度逐步低于对照，而碳酸氢钠浓度1g/L以下的试样，其生长速度直到12d时，仍然高于对照。

各处理组中藻液的OD值随碳酸氢钠浓度升高产生的变化见图15。同样情况，碳酸氢钠浓度为1.5gL/以下时，藻液的OD值增长平稳，前9d均高于对照组。碳酸氢钠浓度为2g/L时，前6d藻液OD值增长幅度高于对照，第7d后OD值增长速度开始下降。说明高浓度的碳酸氢钠抑制藻细胞的生长。对照组在实验初期生物量低于处理组，第8d后其OD值持续增加，藻液的最终OD值接近各较低浓度碳酸氢钠处理组。

表3不同浓度碳酸氢钠条件下H.P-1的细胞数量、干重及虾青素含量

由表3可知，在碳酸氢钠浓度为0.5 g/L时，H.P-1的细胞干重最高，明显高于其它各处理组(P＜0.01)；碳酸氢钠浓度为1.0g/L时，H.P-1的细胞干重与对照接近；碳酸氢钠浓度为1.5g/L以上时，H.P-1的细胞干重均低于对照组。说明碳酸氢钠浓度较高时，H.P-1的细胞受到抑制。

由表3可知，在碳酸氢钠浓度为0.5~1.5g/L范围内，各组虾青素含量都有不同程度的升高，碳酸氢钠浓度为1.0g/L时，升高幅度最大，虾青素含量最高达到0.411mg/L。与对照组差异显著(P＞0.05)。醋酸钠浓度为2g/L时，藻液虾青素含量处于较低的水平。

试验证明：在BBM培养基中增加碳酸氢钠为碳源，在较低浓度1g/L以下时，细胞干重和虾青素含量都有显著的提高。

盐度

在培养液中适当加入NaCl可促进雨生红球藻的孢子形成和虾青素积累。 Sarada等(2002)研究表明，培养液中NaCl的浓度不能大于1.0%，否则会使雨生红球藻大量死亡。Kobayashi等(1997)认为在雨生红球藻绿色营养细胞阶段适量增加培养液中的NaCl，可以促进不动孢子的形成并且积累虾青素。盐度增加不利于雨生红球藻的生长，但有利于虾青素的积累。随着盐度的增加，雨生红球藻的光合作用下降，生长减慢，虾青素含量上升。当盐度升到1%时，雨生红球藻就会由游动状态转为不动，同时积累大量的虾青素(Sommeretal.，1991)。Boussiba用BG-11培养基，盐度提高到0.8%时有红色色素积累(Boussiba&Vonshak，1991)。庄惠如等(2000)用BBM培养基，同样盐度条件下，却无色素积累，二者得出的结论相反，原因有待进一步考察。Sarada等(2002)研究得出：一定浓度(0.5%~1.0%)的NaCl有利于虾青素的合成，但在虾青素合成的同时，伴随着细胞分裂的停止。叶勇等(2001)的研究表明对雨生红球藻外加盐的量达到0.4%时导致雨生红球藻细胞数的减少，而外加盐浓度为0.2%时，细胞数的反应因株系和光照的不同而有所差异；并且发现盐的加入仅在弱光照下诱导雨生红球藻的虾青素积累，在强光照下却导致雨生红球藻虾青素含量的下降。但盐胁迫使得虾青素含量升高的作用机理尚不清楚。NaCl可能是通过阻止细胞的分裂间接影响虾青素的含量。

由上所述，关于食盐及其含量对雨生红球藻的作用，文献报道对此有莫衷一是的看法，因而需要研究不同盐度对雨生红球藻H.P-1的生长和虾青素积累的影响。将处于对数生长后期的雨生红球藻藻液，以4000r/min离心5 min，去掉上清液。藻泥用前面试验优化调整过的BBM培养基重新悬浮，调整藻液密度至0.5×10⁵个/mL左右，再均分到250mL三角瓶中。设置5个处理组，各处理组设三个平行。第一组为对照，以无食盐的BBM培养基培养；其它4组分别加入氯化钠，使各组盐度分别为0， 0.25， 0.5， 0.75， 1% (W/V)。置于光照培养箱内培养。培养温度24±0.5℃，由6支40W日光灯提供照明，光照强度为90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12∶12。培养时间12天。每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁。不同实验组每隔24h取样进行观察并测定相关参数。

藻液的生长情况和OD值的变化情况见图16和图17。从图可以看出，盐度为0~0.5%范围内，藻液的生长情况和OD值增加趋势相同，随着时间的推移，藻液的细胞数和OD值逐渐增加。第8d后，藻液的细胞数和OD值的增幅有所下降。盐度为0.5%~1.0%范围内，藻液的细胞数和OD值在第5d以后增加缓慢。第12d时，盐度为0.25%的细胞数和OD值达到最高，但与对照组差异不显著(P＞0.05)。此时其余各处理组中藻液细胞数和OD值随盐度的升高而依次降低。

表4为不同盐度条件下H.P -1的细胞干重。由表可知，在盐度为0.5%时，H.P-1的细胞干重高于其它处理组。在盐度为0 %，0.25%时，H.P-1的细胞干重略低于0.5%处理组，1.0%时，H.P-1的细胞干重低于0.5%处理组和对照组。

表4 不同浓度食盐条件下H.P-1的细胞数量、干重及虾青素含量

从表4也可以看出不同盐度对雨生红球藻H.Pl-1虾青素积累的影响。由表4可知，在盐度为0.25%~0.5%范围内，各组虾青素含量都有不同程度的升高，盐度为0.5%条件下，升高幅度最大，与对照组差异极显著。其次是盐度为0.25%条件下，也高于对照组。当盐度大于0.75%时，藻液中虾青素含量逐渐下降，虾青素含量水平较低。

实验证明食盐在较低浓度时，有促进H.P-1生长和积累虾青素的作用，较高食盐对H.P -1的生长具有抑制作用。盐度控制在0.25~0.5%范围为宜。

二价铁离子

Kobayashi等(1991)指出，高浓度的二价铁离子可促进雨生红球藻对虾青素的积累。当KI存在时这种作用受到抑制。二价铁离子能够加强醋酸盐对虾青素合成的促进作用，这种促进作用不要求蛋白质的从头合成，推测其机理可能是由于Fe²⁺的加入引起虾青素合成酶系活化，但这种促进作用受到自由基HO·的淬灭剂KI的抑制，从而暗示着Fe²⁺对虾青素合成的促进作用可能需要通过铁催化的Fenton反应产生的羟基自由基来实现(Kobayashi etal.，1993)。Fe²⁺与醋酸盐一同加入时，将更有利于虾青素的合成。Harke：等(1996)研究表明，Fe²⁺的效果不如氮、磷营养盐显著。

BBM培养基配方中有Fe²⁺的加入，本研究对此做了简单的验证试验，采取在优化处理的BBM培养基保留Fe²⁺和去掉Fe²⁺两种培养基培养雨生红球藻H. p -1，Fe²⁺对H.P-1的细胞数量、干重及虾青素含量的影响见表5

表5 Fe²⁺对H.P-1的细胞数量、干重及虾青素含量

环境条件实验

温度对H. p -1生长的影响

温度是影响雨生红球藻生长的一个重要的环境因素。雨生红球藻适宜在低温环境下生长。主要介于14~28℃之间，最适宜的生长温度为20℃左右。较高的温度有利于雨生红球藻中虾青素的积累。Borowitzka等(1999)观察到红球藻在15℃时基本上全是绿色的游动细胞，当培养温度升高到25℃时，有一部分细胞转化成了积累大量虾青素的红色厚壁孢子；而在28℃下培养20天，细胞即全部转化成了厚壁孢子。Tjahjono等(1994)认为高温促进了活性氧的产生，而活性氧最终有利于虾青素的积累。也可能是较高的温度抑制了红球藻细胞的正常分裂生长，从而使虾青素的相对含量提高。Tjahjono等(1994)研究发现，在30℃的培养条件下红球藻的虾青素积累量是20℃时的3倍。 Tripathi等(2002)认为35℃的培养温度可促进各种营养条件下虾青素的累积。

综上所述，温度对雨生红球藻生长繁殖和虾青素积累的影响是完全不同的。但我们首先需要的是繁殖足够大的藻体数量，然后才是促进虾青素的积累。因此，本课题首先需要探讨不同温度对雨生红球藻H. p-1生长的影响。

本实验设置5个处理组，一组为对照(24℃)，使各组温度分别为16、20、 24、 28、32℃。各处理组设三个平行。将处于对数生长后期的雨生红球藻藻液，以4000 r/min离心5min，去掉上清液。藻泥用本课题对N、P、C源及食盐浓度优化调整过的BBM培养基（以下写做BBM-Y）重新悬浮，调整藻液密度约0.5×10⁵个/mL，均分到1000 mL三角瓶中，置于光照培养箱内调节到实验设计的各温度进行培养。由40W日光灯提供照明，光照强度为90μmolphotons·m^-2·s^-1，光周期为12∶12。培养时间12天。每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁。不同实验组每隔24 h取样进行观察并测定相关参数。

在各培养温度条件下，H. p -1的生长状况如图18所示。经过12d的培养，温度为24℃和28℃的情况下，H.p -1的生长速率比较接近，并显著快于其他温度条件，在12d 时细胞密度达到最高（12.4×10⁵~12.6×10⁵个/l），见图18。光密度的变化情况如图19所示，24℃时，藻液的OD值高于其他温度下试样的藻液，最高可达到0.97。但与28℃条件下的差异并不显著(P>0.05 )。在20℃以下，随着温度的降低，细胞生长的速率变得缓慢了。当温度过高，在32℃时，第12d最高光吸收值为0.72，显著低于24℃的水平(P<0.01)。因此，中等温度（24℃）有利于H. p -1保持较长的生长周期以及较高的生长速率。

不同温度条件下，单位体积培养的藻体干重和虾青素含量见表6。24℃与28℃的情况下，单位体积的干重和虾青素含量都处于较高的水平，且两者都没有显著的差异(P>0.1)。在32℃高温的条件下，虽然可以较早的进入不动孢子阶段积累虾青素，但由于藻细胞浓度相对较低所产的虾青素也并不高，要显著低于24℃与28℃的含量。在低温16℃的情况下，其单位体积的干重和虾青素含量相对其他温度条件时都是最低的。在温度为28℃和24℃时，H. p -1生长速率和生物量都要高于其他水平，因此可以得出结论：H. p -1生长适宜的温度范围为24℃~28℃。

表6 不同温度培养的藻液最终细胞密度、OD值、干重及虾青素含量

光照对H. p -1生长的影响

光照是诱导雨生红球藻大量积累虾青素的最重要因素，强光照会促进虾青素的合成。一般认为，2klx以下的弱光有利于雨生红球藻营养细胞的培养。高光强可促进虾青素的快速积累，但光强过高会导致红球藻的大量死亡。

研究不同光照强度对H. p-1生长的影响，实验采用40W日光灯光照，将处于对数生长后期的雨生红球藻藻液，以4000 r/min离心5 min，去掉上清液。细胞团用BBM-Y培养基重新悬浮，调整藻液密度约0.5×10⁵个/mL，均分到5000mL瓶中。设置5个处理组，各处理组设2个平行。使各组光照强度分别设置为：2支、4支、6支、8支、10支。置于光照培养室内培养。培养温度24±0.5℃，光周期为12∶12。培养时间12天。每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁。不同实验组每隔24 h取样进行观察并测定相关参数。在不同光照强度条件下，藻液的细胞密度和 OD值的变化情况见图20、图21以及表7。

如表7所示：在前12d，除10支40W日光灯光照条件下，H. p -1一直处在快速生长期，6支与8支40W日光灯光照条件下，藻的生长速度最快，且细胞密度最高达到14.6×10⁵个/l。在低光强（2支40W日光灯）下，藻细胞生长和OD值一直处于较为缓慢增长的状态，到16d时藻液仍呈鲜绿色，镜检观察藻细胞还是以游动细胞为主。因此到了收获后干重和虾青素含量都明显低于其他水平的。高光强(10支40W日光灯)对H. p -1生长有一定抑制作用，藻液在第9d时就变为黄绿色，并有不动孢子出现；到11d时藻液呈现出暗绿色；到15d时藻液则变为红褐色，说明已经积累了不少的虾青素。

表7 不同光照培养的藻液最终细胞密度、OD值、干重及虾青素含量

不同光照强度条件下，藻液单位体积的干重和虾青素含量见表7。8支40W日光灯光照的最高，要显著高于其他光照强度条件下的虾青素含量(P<0.01)。过强的光照10支40W日光灯光照下，藻液细胞浓度在后期下降，过早进入不动孢子期，收获的干重和虾青素含量都下降了。

pH值对H. p -1生长的影响

一般认为，红球藻适宜在中性或稍碱性条件下生长。Sarada等(2002)研究表明，在培养液pH值为7.0时可获得最大细胞产量，同时虾青素的产量亦显著增加。

在不同初始pH的环境下，H. p -1的生长曲线和oD值的变化情况见图22和图23。在前9d，H. p -1生长迅速，其中，在pH值为7.0和8.0情况下，平均生长速率显著高于其它pH条件(P<0.01) ，最终细胞密度两者的水平接近。因此，可以得出H. p -1适宜生长在pH值为7.0~8.0的环境。考虑较高的pH值有利于避开其它杂藻的生长，选择pH值为8.0的培养环境。

表8 pH值培养的藻液最终细胞密度、OD值、干重及虾青素含量

不同初始pH环境条件下，藻液单位体积的干重和虾青素含量见表8，在pH值8.0条件下，H. p -1的干重和虾青素含量都高于其他条件下。其次在pH值为7.0即中性条件下，H. p -1的生物量次之。而在碱性相对强的pH9.0环境下，H. p -1的干重和虾青素含量显著低于其他水平(P<0.01)。因而，也可以证明H. p-1适宜在中性或稍偏碱性的环境中生长。

添加维生素对雨生红球藻H.P-1生长和虾青素积累的影响

目前，有关维生素对雨生红球藻生长的作用仍有争议。金传荫等(1997)认为添加适量的维生素B₁，B₁₂可促进雨生红球藻生长。但Fbbregas等(2001)研究则表明，维生素的加入对红球藻的生长并无显著影响。

本课题通过添加不同浓度的维生素B₁，B₁₂，并通过单因子、双因子实验考察它们对雨生红球藻H.P-1生长和虾青素积累的影响。试验设3个维生素处理组，I组：单独添加VB₁，添加浓度分别为0、5、10、15和20mg/L ；II组：单独添加VB₁₂，添加浓度分别为0、25、50、75和100μg/L∶III组∶同时添加维生素VB₁/ VB₁₂ ，添加浓度分别为0/0、5/25、10/50、15/75和20/100 （mg）μg/L。采用优化的BBM配方。以上每种处理均设三个平行组。

将处于对数生长后期的H.P-1藻液，以4000r/min离心5 min，去掉上清液。细胞团用前面试验优化调整过的BBM培养基重新悬浮，调整藻液密度至0.5×10⁵个/mL左右，再均分到250mL三角瓶中。将配制好的维生素母液按照设定浓度添加到三角瓶中。于光照培养箱内培养。培养温度24±0.5℃，由6支40W日光灯提供照明，光照强度为90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12：12。培养时间12天。每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁。不同实验组每隔24h取样进行观察并测定相关参数。

VB₁单独添加的效应

首先研究单种维生素添加的效应。VB₁不同浓度范围下雨生红球藻生长曲线如图24所示。在第12天基本进入稳定期，由试验结果可知：凡添加VB₁的4个浓度等级处理，藻细胞密度值均显著高于未添加VB₁的对照。在浓度0 ~10mg/L的范围内，藻细胞密度随着VB₁浓度的增加而提高。浓度10 mg/L处理的藻细胞密度值最大，比对照提高了33.8% (P<0.01)。而当VB₁添加浓度达到实验最高浓度20mg/L时，藻细胞密度值虽然高于对照，但却是添加处理中的最低者。由此来看，VB₁添加浓度10mg/L对H.P-1细胞的生长促进效果最好。

表9 不同浓度VB_l条件下H.P-1的细胞数及虾青素含量

在VB_l不同浓度处理的H.P-1积累虾青素含量变化见表9。在添加VB₁的4个浓度处理中，在较低浓度时，H.P-1的虾青素含量随着VB₁浓度的增加而增加，当添加浓度为10mg/L时，虾青素含量最高，比对照提高了17.9%。而当VB₁浓度进一步增加时，虾青素含量有所降低，但高于对照。

VB₁₂单独添加的效应

在VB₁₂添加试验中，藻细胞密度值随着VB₁₂浓度的提高而增加。见图25，其中浓度75μg/L处理的藻细胞密度值为最大，浓度50μg/L处理的藻细胞密度值为其次，并明显高于其它处理。培养第12d时，比对照提高了46.5% (P<0.01)。但VB₁₂浓度达到100μg/L时，藻细胞密度却开始降低，但仍高于对照。因此，在雨生红球藻游动细胞培养阶段VB₁₂的适宜添加浓度为50~75μg/L。

表10 不同浓度VB_l2条件下H.P-1的细胞数及虾青素含量

在VB_l2添加试验中，虾青素含量随着VB_l2浓度的提高而增加。其中，浓度75μg/L处理的虾青素含量值为最大，见表10，并显著高于对照(P<0.05)。但在VB_l2添加浓度继续增加到试验最高浓度100μg/L时，虾青素含量却有所降低。因此从细胞数和虾青素含量两方面来看，对于H.P-1来说，在藻体生长阶段，VB_l2的适宜添加浓度为50~75μg/L。

VB_l/VB₁₂复合添加的效应

在VB_l/VB₁₂复合添加试验中，在添加浓度0/0、5/25、10/50（mg）μg/L 范围内，藻细胞密度值随着VB_l/VB₁₂浓度的提高而增加，见图26。添加浓度继续提升时，藻细胞密度值开始下降。当添加浓度为试验的最高浓度20/100 （mg）μg/L时，藻细胞密度值反而低于对照。

表11 不同浓度VB_l和VB_l2复合使用下H.P-1的细胞数及虾青素含量

以上实验结果表明：单独添加和复合添加维生素B₁，B₁₂均对H.P-1游动细胞的生长有明显的促进作用。H.P-1的细胞密度随着添加浓度的增加而上升。到达最高点后随着浓度的升高开始降低。VB₁₂的促进效果优于其它添加处理。单独添加维生素B₁和B₁₂和复合添加维生素B₁，B₁₂，在低浓度时对虾青素生成有促进作用。两种或两种复合添加的所有组合及浓度处理中，VB₁₂添加浓度为75μg/L时，藻液虾青素含量为最高，比对照提高了46.5%。经过测定虾青素含量，得出维生素促进雨生红球藻虾青素的效果为VB₁₂>VB₁> VB₁/VB₁₂。与促进细胞密度的规律相同的推理可知，维生素只是促进雨生红球藻的生长，从而增加了虾青素的含量。从经济意义上讲，单独添加VB₁₂既有利于大量培养雨生红球藻也可以节省购买维生素的开支。

雨生红球藻的生产模式

尽管雨生红球藻中虾青素含量高，雨生红球藻积累虾青素的环境因素和营养条件还有待探索，应用开发上还有许多关键问题和技术需要突破。

雨生红球藻的培养阶段现有的生产模式有两种，即所谓的有限培养(batchcultures)和半连续式培养(semi-continuous cultures)。有限培养是指在稳定的培养液条件下进行微藻培养。半连续培养则指在培养藻类细胞达到相当浓度后，每天取出一部分藻液转入胁迫环境，并补充等量的新培养液继续培养，使雨生红球藻在保持恒定的生长速度和稳定的生理特性的条件下连续生产。第二阶段是通过设置诸如高光照、高温、高盐、营养盐饥饿等一系列胁迫手段，促使雨生红球藻在恶劣的生存环境下转变为厚壁孢子，以达到积累虾青素的目的。在这两个阶段中，微藻所需的营养及环境条件不同，当前国内外研究既主要集中在这两个阶段的条件选择和控制上。

通过对前人相关研究报道的大量分析，我们认为突破目前限制雨生红球藻规模化培养的瓶颈要从采用新型光生物反应器培养系统入手，同时进一步研究对红球藻规模化培养有重要影响的某些生物学特性。本发明采取如下技术方案：

①结合烟台地区的气候和H.P-1的生物学特点，并综合考虑反应器成本等因素，在相关光生物反应器的基础上设计和构建新型的规模化光生物反应器。并将它们有机的结合，建立了一套雨生红球藻规模化培养流程。

②通过在实验室条件下研究获得的能够大幅度提高H.P-1生长速率和虾青素含量培养条件为依据，进行室内外规模化培养实验，确定规模化光生物反应器高效率培养红球藻的工艺条件。在实验结果的基础上，探索出一条雨生红球藻规模化培养的新路子。

③跟踪测定并分析H.P-1培养过程中反应器内藻液的温度、pH，OD值等相关指标，充分发挥各光生物反应器的性能和培养效率。为进一步优化反应器设计和培养工艺打好基础。

④通过本课题的研究，建立一种雨生红球藻规模化培养的模式，以开发这一具有高经济价值的微藻品种，同时为其它种类微藻的规模化培养提供参考模式。规模化光生物反应器和工艺流程的构建

封闭式光生物反应器相对于传统开放池技术具有比较容易防止污染、培养条件易于控制等优点。H.P-1的规模化培养条件要求较为苛刻、防止生物污染较为重要，因而构建新型、高效的规模化封闭式光生物反应器对H.P-1的规模化培养来说显得尤为重要。

本发明在前期研究的基础上，根据业已存在的各种光生物反应器不同的特点和H.P-1的生物学性质，首先构建了二种新型光生物反应器，分别为塑料柱式、管道式、室内外池式三种类型。其中柱式和管道光生物反应器用于H.P-1快速生长繁殖阶段的培养，室内外池式生物反应器用于雨生红球藻虾青素累积培养。并将它们有机的结合起来，组成了一套完整的雨生红球藻规模化培养模式。

光生物反应器的构建及其特点

柱式光生物反应器

柱式光生物反应器是将聚乙烯透明塑料袋放入中央，与物料(水、营养液、气体等)进出管道一起构成的简易光生物反应器。塑料柱式生物反应器具有投资小，排除溶解氧容易等特点，能够达到微藻资源开发较为经济的目的。并且一般体积都不是很大，适合做种质扩大使用。使用过程发现，这种封闭式的聚乙烯透明塑料袋光生物反应器存在系列问题。比如：存在处于静止状态的“死角区”(主要包括，透明塑料袋的底部不可避免的大量皱褶所形成的死角区，以及由于底部不能有效搅拌其外周区域所形成的死角区)，导致光生物反应器底部四周藻液不能充分流动，并进一步导致消毒不全，营养分布不均匀一致，氧气解析和二氧化碳交换补偿受到影响，综合结果降低了微藻培养效率。同时这种柱状光生物反应器也极易向侧向倾斜，容易发生倒伏。这些缺陷大大降低了这类封闭式光生物反应器的扩大应用。

根据这种反应器的优缺点，本课题对其做了较大改进，缩小底部面积，并采用一定的手段增强其抗倒伏性能，创建了一种新型的柱式光生物反应器。将这些反应器通过管路有机连接起来，构成一反应器组。每个反应器有效体积100L，可由20个反应器组成2吨级的光生物反应器组，作为更大规模反应器的扩大培养反应器，用于放大培养，也可以直接作为终端培养系统使用。

经相关性能指标测定，本柱式光生物反应器(组)虽具有良好的工作性能，其经济情况良好，但尚不能达到小试验取得的高密度培养H.P-1的指标。见表12。

表12柱式光生物反应器培养条件下H.P-1的细胞数量、干重及虾青素含量

管道光生物反应器

在封闭管道光生物反应器放大中，管道长度增加是重要手段。随着管道长度的增加，藻液中二氧化碳很快被耗尽，限制了细胞生长；同时由于藻细胞光合作用，大量氧气在藻液中积累，严重抑制藻细胞的光合作用。另外，气体在管道内形成气泡并逐渐增大形成气柱，阻碍了藻液的正常流动。因此管道长度增加是有限度的，一般不长于150米，大大限制了封闭管道光生物反应器的放大应用。因此，如何克服上述弊端，构建可应用到生产中的吨级以上新型封闭式光生物反应器装置，成为规模开发微藻资源的关键技术。

针对封闭式管道光生物反应器培养中出现的上述问题，本课题通过不断探索，采用传统透光材料，同时改变以往管道光生物反应器的管道结构布局，构建了一种新型的封闭式管道光生物反应器。结果表明，该封闭式光生物反应器解决了一般管道光生物反应器规模化放大中出现的气体交换问题，减少了气泡柱的形成而对水流的阻碍作用，增加了氧气有效解析，避免了积累过高的溶解氧，降低了溶解氧对微藻的氧化损伤作用。同时，通过有效补偿消耗的二氧化碳，保障微藻正常光合代谢的进行，突破了管道总长度增加的限制。因此，该封闭式管道光生物反应器能够把管道长度增加到1000米以上，规模可以从几吨放大到几十吨，甚至上百吨。

室内外池式生物反应器

由于H.P-1雨生红球藻的生长条件比较温和，各种危害雨生红球藻生长的污染生物，比如原生动物、轮虫、杂藻等都能在雨生红球藻的培养基中存活并大量繁殖。对于虾青素累积阶段来说，完成这一阶段培养所需的时间比较长，在此阶段中雨生红球藻基本都转化为不动细胞，藻细胞沉于培养液的底部，这就给了污染生物生长空间，使它们很容易在此阶段繁殖起来，吞食雨生红球藻细胞，或遮蔽射入藻液的光线使红球藻细胞得不到充足的光线，而严重影响虾青素的累积。我们研究发现利用传统的水培虾青素累积模式(即在雨生红球藻生长繁殖阶段的后期，给予不利于藻细胞生长繁殖的条件使其进行虾青素累积。但仍旧用原培养反应器或者直接将藻液转移到别的反应器中，藻细胞本身仍旧处于原培养液中)，培养液中就会很容易出现污染生物。有时培养液甚至因大量杂藻繁殖而成绿色，严重影响雨生红球藻虾青素含量的提高。

经多次试验后，我们构建了一种全新的室内外池式反应器用于雨生红球藻的虾青素累积培养，光照是影响微藻生长的最重要的环境因子之一，是藻细胞生长的主要能量来源。光强过高的时候将会产生光抑制现象，影响光能的利用。光强过低则会产生光限制现象，影响细胞的生长。用封闭式光生物反应器培养微藻，在其他营养成分充足的条件下，光对微藻的生长和光合作用起关键性作用。光的作用主要取决于封闭式光生物反应器集光器的几何构造及光在藻液中的衰减特性。

前人已经对雨生红球藻生长阶段所需的适度光照条件进行了多方面的研究，本发明研究了H.P-1雨生红球藻在本课题构建的两种规模化光生物反应器(柱式和管道式)的光学性能。以便为室内和规模化培养雨生红球藻提供参考，并为进一步优化反应器构造提供依据。

在藻细胞培养体系中，影响光强的因素主要有：光程、细胞密度、光源的特性和几何形状以及反应器的结构和操作条件。当光源和反应器一定时，则主要取决于光程和细胞密度。通过测定光线通过不同藻密度和不同厚度雨生红球藻藻液时的光强变化情况，可知用柱式反应器培养雨生红球藻时须保持反应器内平均光强在10000~16000 lx的范围内，这就要求我们必须根据外界太阳光强度的变化适时的对反应器进行遮光或增光措施。

室内外池式反应器很容易扩大体积，反应器装有水流推动装置，它可以使从封闭式管道光生物反应器高密度培养的H.P-1红球藻细胞迅速分散到新的流水中；由于采用流水培养的方式，解决了藻细胞沉淀及藻细胞获得均匀光照的问题；由于管道光生物反应器的培养液被稀释4~5倍，营养物质被一下子稀释到极低浓度，既有利于虾青素的积累，又可以使营水中营养生活的各种污染生物如原生动物、轮虫、杂藻等较难繁殖，有利防止了生物污染的发生，从而解决了这一严重影响雨生红球藻虾青素累积过程的问题，使雨生红球藻最终累积的虾青素含量占细胞干重的比例平均达到6%~7%，最高可以达到7.3%，远高于文献报道通常培养虾青素累积2%~4%的水平。

工艺流程的构建

从实验室藻种到光生物反应器放大培养是实现微藻规模化培养的重要环节。如前所述，二步培养(细胞生长培养和虾青素累积培养)是雨生红球藻规模化培养的特点。我们在本课题中按照上述二种反应器不同的规模和用途，将它们合理搭配，构建了一套从实验室藻种培养到最终虾青素累积的规模化雨生红球藻培养流程。如下：

种瓶培养→封闭管道光生物反应器培养（500L)→室内池光生物反应器培养(2吨) →室外池反应器虾青素累积培养

先在实验室内给予H.P-1雨生红球藻优化的生长条件，使其快速生长繁殖。待累积到一定的细胞量后，通过无菌管路接种到封闭式管道光生物反应器中进行二级扩大培养，待红球藻生长到一定密度，再接种到室内池式光生物反应器中进行三级生长培养，达到最高藻细胞数。随后就是将培养完成后的红球藻绿色细胞转入室外池式生物反应器中，在胁迫条件下使其大量累积虾青素，最终完成雨生红球藻的规模化培养流程。

这样就形成了雨生红球藻规模化培养的一整套工艺模式。

综上，本发明针对雨生红球藻规模化培养过程中遇到的问题进行了研究，以突破限制红球藻规模培养成功的瓶颈。在解决相关生物学特性的基础上，通过设计和构建适合用于雨生红球藻规模化培养的光生物反应器，同时采用相应的控温、控光、控CO₂和pH等措施以实现雨生红球藻规模化培养。具有如下有益效果：

①本课题筛选的H.P-1雨生红球藻，是一株室内外生长均适合，且生长周期短，生产率高，虾青素含量高的藻株；室内最佳培养条件下，最终血球藻中虾青素含量超过目前报道的国际水平，达7.2%以上。

②采用经过优化的BBM培养基混合营养培养H.P-1雨生红球藻时，该藻的生长速率和生物量会随温度和光照条件的变化而不同。较高的温度24~28℃和较弱的光强12000~16000 lx条件是H.P-1雨生红球藻营养体生长的相对最佳条件。增加营养细胞密度，提高单位面积虾青素产量。

③本课题构建的柱式、管道、池式光生物反应器分别着重解决了以往反应器中存在的培养液混合效果差、管道长度和反应器规模增加困难、生物污染严重的问题，并且通过合理搭配的工艺过程，经济地放大了雨生红球藻的规模化培养。

④由管道、池式光生物反应器及其配套设施组成的雨生红球藻培养系统表现出了良好的控温、控光、控CO₂和pH的性能。能够保证温度、光线、CO₂及pH都在H.P-1雨生红球藻生长适合的范围内。

⑤室内外结合规模化培养雨生红球藻的方式，能有效提高藻细胞密度和生长速率，缩短培养周期，也能使藻细胞快速进入虾青素积累期。可以获得最高血球藻生长速度和最高虾青素积累量。这是一种非常有前途的规模化红球藻培养方式。

⑥与传统开放池技术相比较，年培养天数大约提高到300天。在每个批次培养中，细胞生长培养所需时间从过去的20多天缩短到12天（缩短7-8天），虾青素含量提高了2倍多。

⑦本课题构建的新工艺、设备设计年生产血球藻粉能力达到 100吨。设计年生产虾青素能力达到5100公斤。

Claims (3)

1.一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法，其特征在于：包括藻种的培养、种瓶培养、封闭式管道光生物反应器培养、室内池光生物反应器培养和室外池反应器虾青素累积培养；藻种先在实验室内优化的生长条件下，使其快速生长繁殖，待累积到一定的细胞量后，通过无菌管路接种到封闭式管道光生物反应器中进行二级扩大培养，待红球藻生长到一定密度，再接种到室内池式光生物反应器中进行三级生长培养，达到最高藻细胞数，随后将培养完成后的红球藻绿色细胞转入室外池式生物反应器中，在胁迫条件下使其大量累积虾青素，最终完成雨生红球藻的规模化生产流程。

2.根据权利要求1所述的一种高含量虾青素血球藻培养方法，其特征在于：所述的种瓶培养阶段是采取诱变育种的方法筛选出室内外生长均适合，且生长周期短，生产率高，虾青素含量高的藻株，包括如下步骤：

1）EMS诱变：将Haematococcus pluvialis 系列雨生红球藻天然藻种培养到对数生长期的藻液600ml，4000rpm离心5min，弃上清液；将不同剂量EMS加入到0.06M、pH值为7. 0的磷酸缓冲液中配置得到最终浓度分别为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的诱变液，分别将藻体加入六种诱变液中在黑暗条件下处理4h，然后加入1ml、5%的硫代硫酸钠终止诱变反应，离心去除诱变液，藻体用新鲜营养液洗涤两次，避光12h后置于光照条件下培养；

2）叠氮钠诱变：将Haematococcus pluvialis 系列雨生红球藻天然藻种培养到对数生长期的藻液900ml均分到9个250ml的三角瓶中，取不同量的叠氮钠溶液加入各个三角瓶中，迅速混匀，使叠氮钠的最终的浓度分别为100 mg/L、120mg/L、140mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200mg/L、220mg/L、240mg/L、260mg/L，黑暗中处理12小时，4000rpm离心5min，去除诱变液并用新鲜的营养液洗涤两次，最后将处理后的藻体悬浮到100ml新鲜营养液中，于室温自然光下培养；

3）突变株的筛选：在超净工作台中，将步骤1）和2）处理后的样品分别在固体琼脂平板上划线，之后平板先在光强光照为50~100UM条件下培养，长出绿色藻落后置于200 UM光强条件下诱导虾青素积累，然后挑取藻落大颜色最红的单藻落，分离得到了30个雨生红球藻较优诱变株，再分别接入液体培养液；

4）优良藻株的筛选：将步骤3）筛选出的经过步骤1）EMS诱变的较优诱变株按照步骤2）叠氮钠诱变的方法再次诱变；将步骤3）筛选出的经过步骤2）叠氮钠诱变的较优诱变株按照步骤1）EMS诱变的方法再次诱变；经琼脂平板划线培养再次分离得到30个变异藻株，培养四、五代后详细测定各自的生长速率和虾青素含量，从中找出15个生长速率和虾青素含量排名靠前的藻株；之后连续培养半年，经20多代后，对于各项特征稳定的藻株，再次测其生长和虾青素积累情况，从中找到3个可以用于生产试验的优良藻株；

5）最优藻株的筛选：以BBM培养基作为基础培养基，接种处在对数生长期的优良变异株于三角瓶内，再放入光照培养箱内培养，以浓度为1.25g/L的NaNO₃为氮源，53.3mg/L-80.0mg/L的中高磷浓度； 1g/L以下较低浓度的碳酸氢钠为碳源， 0.25~0.5%的盐度，VB_l2浓度为50~75μg/L，pH值为7.0~8.0，培养温度24士0.5℃，由40W日光灯提供照明，光照强度为90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12∶12，培养时间10~12d，每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁，从中选出最优藻株。

3.根据权利要求1所述的一种高含量虾青素血球藻培养方法，其特征在于：当所述的封闭式管道光生物反应器为柱式光生物反应器时，其聚乙烯透明塑料袋的底部逐渐窄缩成漏斗状，保证其底部四周藻液充分流动，营养分布均匀一致，氧气解析和二氧化碳交换补偿充分，采用环形牵引支架增强其抗倒伏性。