CN110283867A - 一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法 - Google Patents
一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110283867A CN110283867A CN201910439206.7A CN201910439206A CN110283867A CN 110283867 A CN110283867 A CN 110283867A CN 201910439206 A CN201910439206 A CN 201910439206A CN 110283867 A CN110283867 A CN 110283867A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- zuo
- astaxanthin
- green alga
- fuse
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000013793 astaxanthin Nutrition 0.000 title claims abstract description 91
- JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N Astaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C(=C/C=C/C1=C(C)C(=O)C(O)CC1(C)C)/C)C=CC=C(/C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)C(=O)C(O)CC2(C)C JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N 0.000 title claims abstract description 90
- MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N astaxanthin Chemical compound C([C@H](O)C(=O)C=1C)C(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C(=O)[C@@H](O)CC1(C)C MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N 0.000 title claims abstract description 90
- 229940022405 astaxanthin Drugs 0.000 title claims abstract description 90
- 239000001168 astaxanthin Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 21
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 7
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 7
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 27
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 21
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 6
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 5
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 5
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000168517 Haematococcus lacustris Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229910052927 chalcanthite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001514 astaxanthins Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 230000009569 heterotrophic growth Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- JKQOBWVOAYFWKG-UHFFFAOYSA-N molybdenum trioxide Chemical compound O=[Mo](=O)=O JKQOBWVOAYFWKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- KKCBUQHMOMHUOY-UHFFFAOYSA-N sodium oxide Chemical compound [O-2].[Na+].[Na+] KKCBUQHMOMHUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001948 sodium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003519 ventilatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法,包括步骤:S1,对佐夫色绿藻进行快速扩种提高细胞密度,并将其接种至摇瓶培养基中进行胁迫诱导;混合碳源浓度中醋酸钠浓度为0~3.0g/L,接种密度为0.24×108~1.22×108cfu/mL,光照强度80~320μmol s‑1.m‑2,过氧化氢诱导剂浓度0~137.5mg/L;S2,将步骤S1摇瓶获得实验条件在光发酵罐中不同操作方式下进行放大验证。本发明提供的利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法,能够提高佐夫色绿藻生产虾青素的产量和产率,大大缩短了培养时间、成本,提高生产效率,在利用佐夫色绿藻生产虾青素方面具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效生产虾青素的方法,属于生物工程发酵技术领域,特别是涉及一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法。
背景技术
虾青素(astaxanthin)是一种脂溶性紫红色的类胡萝卜素,普遍存在于多种微生物和海洋生物中,一些甲壳类动物如虾、蟹及鲑科鱼类等呈现的颜色均是由于存在虾青素所致。虾青素具有较强的着色功能,抗氧化、抗癌等生理活性,在饲料、食品、营养品和制药行业具有广泛的应用。
虾青素的来源分为天然提取和人工合成。天然提取的虾青素主要源于藻类、酵母、一些鱼虾类等,相较于合成虾青素,天然虾青素具有更好的稳定性。尽管目前市场上虾青素主要是合成虾青素,然而消费者对于天然产品日益增长的需求,促进天然虾青素产业的发展。天然虾青素的来源主要分为三种:
1)从甲壳类副产品中获取。甲壳类副产品内含有类胡萝卜素,然而其虾青素含量很低,而灰分和几丁质含量较高,导致消化率较低,不利于在饵料中的应用。
2)从真菌或细菌中获取。红发夫酵母可以快速生长并实现高细胞密度,但是虾青素含量较低且细胞壁比较厚,阻碍了鱼类对于虾青素的利用,因此需要破壁。一些细菌如海洋细菌也可以产生虾青素,但是成本高,虾青素含量少。
3)从微藻中获取。微藻是生产天然虾青素最具潜力的来源。目前利用雨生红球藻生产虾青素的含量最高,并且已经应到了虾青素的工业生产中,但是它的细胞密度低,培养时间长且易污染,此外,虾青素的诱导和积累需要极高的光照强度,这些问题阻碍了虾青素的进一步商业化的应用。
佐夫色绿藻是一种淡水绿藻,能够利用光能和二氧化碳进行光合自养,也能够利用多种有机碳源异养生长,同时又能够利用光照与有机碳源混养生长。由于其高生长率,高细胞密度,不易污染且能快速产生虾青素而被认为生产虾青素的潜在替代者。
相较于雨生红球藻,除了生长速度快外,在胁迫条件下(如高光、缺氮等)能够提高细胞内虾青素含量,生产效率较高,具有较好的发展前景。因此,针对佐夫色绿藻的生长以及虾青素积累的特性进行研发,如何提高佐夫色绿藻的虾青素产量以及工业化应用是当前所属领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的目的是提供一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法,对于提高佐夫色绿藻的虾青素产量以及工业化应用具有重要的意义。
为了达到上述目的,本发明采用以下的技术方案。
一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法,包括如下步骤:
S1,摇瓶两阶段培养诱导:快速扩种和虾青素的诱导;具体的,第一阶段:低光强提高细胞密度作为种子液;第二阶段:虾青素的诱导:将第一阶段种子液接入进行虾青素的诱导,具体如下:混合碳源浓度中醋酸钠浓度为0-3.0g/L,接种密度为0.24×108~1.22×108cfu/mL,光照强度80-320μmol.s-1.m-2,过氧化氢诱导剂浓度0-137.5mg/L;
S2,光发酵诱导验证:将步骤S1所述条件在光发酵罐进行效果验证,并在不同操作方式:恒定高光强、低光强-高光强、低光强-高光强-补加诱导剂进行佐夫色绿藻诱导。
优选的,步骤S1中,培养基中碳源:20g/L的葡萄糖和2.5g/L的醋酸钠的混合碳源。
优选的,步骤S1中,佐夫色绿藻的诱导阶段接种密度为1.22×108cfu/mL。
优选的,步骤S1中,佐夫色绿藻的诱导阶段光照强度为240μmol s-1.m-2。
优选的,步骤S1中,佐夫色绿藻的诱导阶段过氧化氢的添加范围为107.5-137.5mg/L。
优选的,所述光发酵诱导验证是在恒定高光强条件下进行操作的具体步骤为:
5L的发酵罐装置采用外置光源,通过调节电流控制光照强度,调节电流至最大(光照强度为653μmol.m-2.s-1)并维持恒定培养佐夫色绿藻。
优选的,步骤S2中,采用低光强-高光强的光照方式(312-653μmol.m-2.s-1),并培养至72h进行过氧化氢诱导剂补料,补料浓度为107.5mg/L过氧化氢。
优选的,步骤S1和S2中,均采用完全无氮的Bristol培养基。接种密度为2.30g/L,其中培养基中葡萄糖浓度为30g/L、硝酸钠为碳源、碳氮比为34;在光照为10μmol.m-2.s-1、温度为26℃、转速为150r/min的恒温培养箱中培养。
其中,快速扩种Bristol培养组成为:NaNO3 750mg/L;FeCl3·6H2O 5.0mg/L;
KH2PO4 175mg/L;ZnSO4·7H2O 0.287mg/L;K2HPO4 75mg/L;MnSO4·H2O 0.169mg/L;MgSO4·7H2O 75mg/L;H3BO3 0.061mg/L;CaCl2·2H2O 25mg/L;CuSO4·5H2O 0.0025mg/L;NaCl 25mg/L;(NH4)6Mo7·H2O 0.00124mg/L。
诱导虾青素合成Bristol培养组成为:FeCl3·6H2O 5.0mg/L;KH2PO4 175mg/L;ZnSO4·7H2O 0.287mg/L;K2HPO4 75mg/L;MnSO4·H2O 0.169mg/L;MgSO4·7H2O 75mg/L;H3BO3 0.061mg/L;CaCl2·2H2O 25mg/L;CuSO4·5H2O 0.0025mg/L;NaCl 25mg/L;(NH4)6Mo7·H2O 0.00124mg/L。
进一步而言,通过上述利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法制得虾青素。
借由上述技术方案,本发明具有如下优点和有益技术效果:
1)本发明提供的利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法,能够提高佐夫色绿藻生产虾青素的产量和产率,大大缩短了培养时间、成本,提高生产效率,在利用佐夫色绿藻生产虾青素方面具有重要的意义;
2)本发明除了提供利用佐夫色绿藻积累虾青素方法外,还采用光发酵罐系统此方法进行放大以及效果验证;此外,本发明还探索了利用佐夫色绿藻规模化生产虾青素的方式,对于佐夫色绿藻未来的商业化应用具有重要的价值。
附图说明
图1a和图1b分别为混合碳源下佐夫色绿藻生物量浓度的变化曲线及虾青素积累的影响图;
图2a和图2b分别为不同接种密度下佐夫色绿藻生物量浓度的变化曲线及虾青素积累的影响图;
图3a和图3b分别为不同光照强度下佐夫色绿藻生物量浓度的变化曲线及虾青素积累的影响图;
图4a和图4b分别为不同光氧化氢添加量下佐夫色绿藻生物量浓度的变化曲线及虾青素积累的影响图;
图5a和图5b分别为恒定高光强光发酵罐下佐夫色绿藻光照强度、生物量浓度及虾青素含量和产量随培养时间的变化曲线图;
图6a和图6b分别为低光强-高光强光发酵罐下佐夫色绿藻光照强度、生物量浓度及虾青素含量和产量随培养时间的变化曲线图;
图7a和图7b分别为低光强-高光强-补加诱导剂光发酵罐下佐夫色绿藻光照强度、生物量浓度及虾青素含量和产量随培养时间的变化曲线图。
具体实施方式
下面通过具体较佳实施例例结合附图,对本发明作进一步详细的说明,但本发明的实施方式不限于此。
本发明公开了一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法,包括步骤:
S1,对佐夫色绿藻进行快速扩种提高细胞密度,并将其接种至摇瓶培养基中进行胁迫诱导;混合碳源浓度中醋酸钠浓度为0~3.0g/L,接种密度为0.24×108~1.22×108cfu/mL,光照强度80~320μmol s-1.m-2,过氧化氢诱导剂浓度0~137.5mg/L;
S2,将步骤S1摇瓶获得实验条件在5L光发酵罐中不同操作方式下进行效果验证。
本发明提供的利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法,能够提高佐夫色绿藻生产虾青素的产量和产率,大大缩短了培养时间、成本,提高生产效率,在利用佐夫色绿藻生产虾青素方面具有重要的意义。
实施例1
1、混合碳源对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
1.1藻种活化及种子液的快速制备
从培养基平板上挑取一个单藻落,接种至含有10g/L葡萄糖的Bristol’s medium的250mL三角瓶中(装液量为100mL),在光照为10μmol.m-2.s-1、温度为26℃、转速为150r/min的恒温培养箱中连续培养4-5天。
将上述活化好的种子液接入Bristol培养基中(接种密度为2.30g/L),其中培养基中葡萄糖浓度为30g/L、硝酸钠为碳源、碳氮比为34。在光照为10μmol.m-2.s-1、温度为26℃、转速为150r/min的恒温培养箱中培养。
1.2混合碳源对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
以无氮的Bristol培养基为基本培养基,设置五组实验:只加20g/L的葡萄糖;只加2.5g/L的醋酸钠(NaAc);同时加20g/L的葡萄糖和3.0g/L的醋酸钠;同时加20g/L的葡萄糖和2.5g/L的醋酸钠;同时加20g/L的葡萄糖和1.5g/L的醋酸钠。调节培养基的pH为6.5,并分装至250mL三角瓶中(装液量100mL),然后于121℃、15min条件下高压蒸汽灭菌。培养基冷却至室温后接种,在温度为26℃,转速为150r/min,光照为130μmol.m-2.s-1的恒温培养箱中培养。
培养结束后,测定佐夫色绿藻细胞的生物量浓度;离心收集,去除上清,收集藻泥并冻干,分析藻细胞内的色素组成。
1.3实验结果
从图1a-1b和表1可知,混合碳源浓度对佐夫色绿藻虾青素的积累有很大的影响。其中当采用20g/L的葡萄糖和2.5g/L的醋酸钠的混合碳源时,佐夫色绿藻的虾青素的产量和生物量浓度最高,分别为16.98mg/L和6.5g/L。
表1混合碳源浓度对佐夫色绿藻虾青素的积累
注:采用t检验分析成对数据的显著性,用*标注显著性(p<0.05)。
实施例2
2、接种密度对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
2.1藻种活化及种子液快速制备
佐夫色绿藻的活化以及种子液的快速制备如1.1所述。
2.2接种密度对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
以无氮的Britol培养基为基本培养基,初始葡萄糖浓度为20g/L,接种密度设为:1.22×108、0.61×108、0.32×108和0.24×108cfu/mL。其他培养条件同1.2所述。
培养结束后,测定佐夫色绿藻细胞的生物量浓度;离心收集,去除上清,收集藻泥并冻干,分析藻细胞内的色素组成。
2.3实验结果
从图2a-2b和表2可知,当接种密度为1.22×108cfu/mL,佐夫色绿藻的虾青素的产量和生物量浓度最高,分别为60.28mg/L和16.96mg/L。
表2接种密度对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
注:采用t检验分析成对数据的显著性,用*标注显著性(p<0.05)。
实施例3
3、光照强度对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
3.1藻种活化及种子液快速制备
佐夫色绿藻的活化以及种子液的快速制备如1.1所述。
3.2光照强度对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
以无氮的Britol培养基为基本培养基,初始葡萄糖20g/L,光照梯度设为:88±8、160±5、240±6和320±5μmol.m-2.s-1其他培养条件同1.2所述。
培养结束后,测定佐夫色绿藻细胞的生物量浓度;离心收集,去除上清,收集藻泥并冻干,分析藻细胞内的色素组成。
3.3实验结果
从图3a-3b和表3可知,当光照强度为24 0μmol.m-2.s-1,佐夫色绿藻的虾青素含量和产量最高,分别为2.85mg/g和32.20mg/L。
表3光照强度对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
注:采用t检验分析成对数据的显著性,用*标注显著性(p<0.05)。
实施例4
4、过氧化氢添加量对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
4.1藻种活化及种子液快速制备
佐夫色绿藻的活化以及种子液的快速制备如1.1所述。
4.2过氧化氢添加量对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
以无氮的Britol培养基为基本培养基,过氧化氢浓度添加量:0、77.5、107.5、137.5mg/L,并加入18μmol/L硫酸亚铁,初始葡萄糖浓度为20g/L,培养过程中监测葡萄糖浓度变化,降至0-5g/L时进行补料,补至20g/L。其他培养条件同1.2所述。
培养结束后,测定佐夫色绿藻细胞的生物量浓度;离心收集,去除上清,收集藻泥并冻干,分析藻细胞内的色素组成。
4.3实验结果
从图4a-4b和表4可知,当过氧化氢添加量范围为107.5~137.5mg/L,佐夫色绿藻的最高虾青素产量和生物量浓度,分别为73.45mg/L和22.55g/L。
表4过氧化氢添加量对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
注:采用t检验分析成对数据的显著性,用*标注显著性(p<0.05)。
效果试验例1
1、光发酵罐恒定光强下佐夫色绿藻积累虾青素的效果
1.1藻种活化及种子液快速制备
佐夫色绿藻的活化以及种子液的快速制备如1.1所述。
1.2光发酵罐恒定光强下对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
以无氮的Bristol培养基为基本培养基,初始葡萄糖浓度为20g/L,醋酸钠浓度为2.5g/L,加入107.5mg/L的过氧化氢和18μmol/L的硫酸亚铁。pH设置范围6.5-8.5,温度设置范围为26℃-28℃,通气量为3.33L/min,转速为150r/min,培养期间采用0.1mol/L盐酸和氢氧化钠调节pH,温度通过冷却循环泵控制。5L的发酵罐装置采用外置光源,通过调节电流控制光照强度,调节电流至最大(光照强度为653μmol.m-2.s-1)并维持恒定培养佐夫色绿藻。
培养结束后,测定佐夫色绿藻细胞的生物量浓度;离心收集,去除上清,收集藻泥并冻干,分析藻细胞内的色素组成。
1.3实验结果
从图5a-5b和表5可知,恒定高光强下,佐夫色绿藻的最高虾青素产量和生产率,分别为21.46mg/L和2.76mg/L/d。
效果试验例2
2、光发酵罐低光强-高光强下佐夫色绿藻积累虾青素的效果
2.1藻种活化及种子液快速制备
佐夫色绿藻的活化以及种子液的快速制备如1.1所述。
2.2低光强-高光强下对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
以无氮的BM培养基为基本培养基,初始葡萄糖浓度为20g/L,醋酸钠浓度为2.5g/L,加入107.5mg/L的过氧化氢和18μmol/L的硫酸亚铁。在发酵罐中,采用无氮的BM培养基,发酵罐装置采用外置光源,光照强度采用逐渐提高光强的方式,调节范围为169-653μmol.m-2.s-1。其他培养条件同5.1所述。
培养结束后,测定佐夫色绿藻细胞的生物量浓度;离心收集,去除上清,收集藻泥并冻干,分析藻细胞内的色素组成。
2.3实验结果
从图6a-6b和表5可知,在低光强-高光强培养条件下更有利于提高佐夫色绿藻虾青素的产量,虾青素产量和产率最高可达38.38mg/L和6.25mg/L/d,相较于恒定高光强,分别提高了78.84%、126%。
效果试验例3
3、光发酵罐低光强-高光强—诱导剂下佐夫色绿藻积累虾青素的效果
3.1藻种活化及种子液快速制备
佐夫色绿藻的活化以及种子液的快速制备如1.1所述。
3.2光发酵罐低光强-高光强—诱导剂对佐夫色绿藻积累虾青素的效果
以无氮的BM培养基为基本培养基,初始葡萄糖浓度为20g/L,醋酸钠浓度为2.5g/L,加入107.5mg/L的过氧化氢和18μmol/L的硫酸亚铁。在光照强度采用低光强-高光照(312-653μmolm-2s-1)的方式,培养至72h进行过氧化氢诱导剂补料,补料浓度为107.5mg/L过氧化氢和18μmol/L的硫酸亚铁。其他培养条件同5.1所述。
培养结束后,测定佐夫色绿藻细胞的生物量浓度;离心收集,去除上清,收集藻泥并冻干,分析藻细胞内的色素组成。
7.3实验结果
从图7a-7b和表5可知,低光强-高光强-补加诱导剂操作方式下,利用低光强-高光强-补加过氧化氢诱导剂进行培养,细胞的虾青素产量和产率分别41.41mg/L和6.77mg/L/d,相较于恒定高光强,佐夫色绿藻的虾青素产量和产率分别提高了92.96%和163%。
表5光发酵罐恒定光强下对佐夫色绿藻积累虾青素的影响
实验条件 | 恒定高光 | 低光强-高光强 | 低光强-高光强-补加诱导剂 |
平均比生长速率(d<sup>-1</sup>) | 0.07±0.01 | 0.13±0.02* | 0.10±0.02 |
最大生物量浓度(g/L) | 8.15±0.51 | 16.50±0.99* | 11.08±0.20* |
生物量产率(g/L/d) | 0.39±0.02 | 1.39±0.03* | 0.83±0.02* |
虾青素含量(mg/g) | 2.80±0.10 | 2.66±0.14 | 3.82±0.12* |
虾青素产量(mg/L) | 21.46±0.52 | 38.38±0.52* | 41.41±0.93* |
虾青素产率(mg/L/d) | 2.76±0.07 | 6.25±0.15* | 6.77±0.11* |
注:采用t检验分析成对数据的显著性,用*标注显著性(p<0.05)。
8测定方法:
8.1生物量浓度
生物量浓度采取干重法进行测定。吸取2mL佐夫色绿藻培养液于烘干称重的2mL离心管中,在3800×g的离心力下离心3min、并用蒸馏水进行洗涤。将离心得到的藻泥置于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重,置于分析天平准确称量,计算样品干重。
8.2葡萄糖浓度
利用SBA生物传感分析仪测定培养基内葡萄糖浓度。取待测样品上清液过滤并稀释至量程范围内(0.5~1.0g/L),测定前先用1.0g/L的葡萄糖标准品定标,定标通过后,吸取25μL样品进行测定。
8.3细胞中的色素组成分析
细胞内色素提取方法、成分及测定参考相关文献。离心收集的藻泥冷冻后置于冷冻干燥机冻干成藻粉,准确称量10mg藻粉于装有陶瓷珠的振荡管中,加入1mL甲醇/二氯甲烷的提取液(体积比为3:1,含有0.1%的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)。
振荡30s后,迅速置于液氮中冷却,离心收集上清液,如此反复操作直至藻细胞变成无色。合并收集的所有上清液并在通风橱中利用氮气吹干。
然后用甲醇/MTBE混合溶剂(1:1,v/v)进行定容,最后过滤并转移至棕色瓶中保存,用于高效液相分析。以上操作均需避光。
色素的HPLC的测定如下:
采用YMC carotenoid column C 30色谱柱和PDA检测器,柱温为30℃,进样量为20μL,流速为0.8mL/min。流动相分别为甲醇(A)及MTBE(B)。具体洗脱条件如下:
0-2min,90%-80%A、10%-20%B;2-6min,80%-60%A、20%-40%B;6-18min,60%-50%A、40%-50%B;18-21min,50%-90%A、50%-10%B;21-24min,90%A、10%B。
检测波长为480nm、645nm和665nm,并在300-800nm下进行全波长扫描以测定光谱。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,故凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,对佐夫色绿藻进行快速扩种提高细胞密度,并将其接种至摇瓶培养基进行胁迫诱导;混合碳源浓度中,醋酸钠浓度为0-3.0g/L,接种密度为0.24×108~1.22×108cfu/mL,光照强度80-320μmol.s-1.m-2,过氧化氢诱导剂浓度0-137.5mg/L;
S2,将步骤S1摇瓶获得诱导虾青素实验条件在光发酵罐中不同操作方式下进行效果验证。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤S1中,摇瓶两阶段培养诱导:快速扩种和虾青素的诱导;具体的,分别是:
第一阶段:低光强提高细胞密度作为种子液;
第二阶段:虾青素的诱导:将第一阶段种子液接入进行虾青素的诱导。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤S1中,混合碳源组合方式为20-30g/L的葡萄糖和1.5-3.0g/L的醋酸钠。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤S1中,摇瓶诱导阶段,将种子液接种至摇瓶培养基中进行诱导的接种密度为1.22×108cfu/mL。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤S1中,摇瓶诱导阶段,光照强度为240μmol.s-1.m-2,过氧化氢诱导剂的添加范围为107.5-137.5mg/L。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤S2中,光发酵诱导验证:将步骤S1所述条件在光发酵罐进行效果验证,并在不同操作方式:恒定高光强、低光强-高光强、低光强-高光强-补加诱导剂进行佐夫色绿藻诱导。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述光发酵诱导验证是在恒定高光强条件下进行操作的具体步骤为:
5L的发酵罐装置采用外置光源,通过调节电流控制光照强度,调节电流至最大(光照强度为653μmol.m-2.s-1)并维持恒定培养佐夫色绿藻。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:步骤S2中,在光发酵罐中低光强-高光强的培养方式(312-653μmol.m-2s-1),并培养至72h进行过氧化氢诱导剂补料,补料浓度为107.5mg/L过氧化氢。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其特征在于:步骤S1和S2中,均采用完全无氮的Bristol培养基为基本培养基;接种密度为2.30g/L,其中培养基中葡萄糖浓度为30g/L、硝酸钠为碳源、碳氮比为34;在光照为10μmol.m-2.s-1、温度为26℃、转速为150r/min的恒温培养箱中培养。
10.权利要求1-8中任一项所述的利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法制得的虾青素。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910439206.7A CN110283867A (zh) | 2019-05-24 | 2019-05-24 | 一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910439206.7A CN110283867A (zh) | 2019-05-24 | 2019-05-24 | 一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110283867A true CN110283867A (zh) | 2019-09-27 |
Family
ID=68002601
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910439206.7A Pending CN110283867A (zh) | 2019-05-24 | 2019-05-24 | 一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110283867A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111567700A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-25 | 深圳大学 | 一种水产养殖用藻类组合物、水产养殖饲料及养殖方法 |
CN114317277A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-04-12 | 南京益纤生物科技有限公司 | 一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9113607B1 (en) * | 2015-03-25 | 2015-08-25 | Heliae Development, Llc | Methods for treating a culture of Haematococcus pluvialis for contamination using hydrogen peroxide |
CA3109156A1 (en) * | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Academia Sinica | Recombinant polynucleotide sequence for producing astaxanthin and uses thereof |
CN106119331A (zh) * | 2016-08-29 | 2016-11-16 | 华南理工大学 | 一种诱导色绿藻高效合成虾青素的方法 |
CN106906142A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-06-30 | 烟台布鲁拜尔生物制药有限公司 | 一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法 |
CN107326058A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-11-07 | 李彤 | 使用雨生红球藻生产虾青素的方法 |
CN109439611A (zh) * | 2018-11-20 | 2019-03-08 | 华南理工大学 | 提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法 |
-
2019
- 2019-05-24 CN CN201910439206.7A patent/CN110283867A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3109156A1 (en) * | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Academia Sinica | Recombinant polynucleotide sequence for producing astaxanthin and uses thereof |
US9113607B1 (en) * | 2015-03-25 | 2015-08-25 | Heliae Development, Llc | Methods for treating a culture of Haematococcus pluvialis for contamination using hydrogen peroxide |
CN106119331A (zh) * | 2016-08-29 | 2016-11-16 | 华南理工大学 | 一种诱导色绿藻高效合成虾青素的方法 |
CN106906142A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-06-30 | 烟台布鲁拜尔生物制药有限公司 | 一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法 |
CN107326058A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-11-07 | 李彤 | 使用雨生红球藻生产虾青素的方法 |
CN109439611A (zh) * | 2018-11-20 | 2019-03-08 | 华南理工大学 | 提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
JIN LIU等: "Chlorella zofingiensis as an alternative microalgal producer of astaxanthin: biology and industrial potential", 《MAR DRUGS》, vol. 12, no. 6, 10 June 2014 (2014-06-10), pages 3487 - 3515 * |
姜雪亚等: "营养强化混养条件下提高色绿藻生物量和虾青素产量", 《现代食品科技》 * |
姜雪亚等: "营养强化混养条件下提高色绿藻生物量和虾青素产量", 《现代食品科技》, vol. 34, no. 8, 19 July 2018 (2018-07-19), pages 156 * |
彭志英等: "食品生物技术", 中国轻工业出版社, pages: 134 - 137 * |
陈俊辉: "佐夫色绿藻高效积累虾青素的诱导调控机制研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)工程科技Ⅰ辑》 * |
陈俊辉: "佐夫色绿藻高效积累虾青素的诱导调控机制研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)工程科技Ⅰ辑》, no. 12, 15 January 2019 (2019-01-15), pages 2 - 3 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111567700A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-25 | 深圳大学 | 一种水产养殖用藻类组合物、水产养殖饲料及养殖方法 |
CN114317277A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-04-12 | 南京益纤生物科技有限公司 | 一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103396979B (zh) | 一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法 | |
CN101703214A (zh) | 灵芝菌丝粉或灵芝茶及其双重发酵工艺 | |
CN112501029B (zh) | 松蕈及其用于生产麦角硫因的方法 | |
CN104429604A (zh) | 一种绣球菌液体菌种培养基及培养方法 | |
CN102875225A (zh) | 桑黄菌株液体发酵培养基和发酵产桑黄多糖的方法 | |
CN102242069A (zh) | 一种蝉拟青霉菌株及其应用 | |
CN109337895A (zh) | 一种优质高产富硒猴头菇菌种的生产方法 | |
CN110283867A (zh) | 一种利用佐夫色绿藻生产虾青素的方法 | |
CN105755088A (zh) | 诱导雨生红球藻生产虾青素的方法 | |
CN105969674A (zh) | 一种富硒地顶孢霉菌株及其应用 | |
CN102925527A (zh) | 一种金针菇、灵芝混菌发酵的方法 | |
CN108060096A (zh) | 一种益生菌组合及其在凡纳滨对虾苗种培育中的应用 | |
CN107805617A (zh) | 一株马胃葡萄球菌zh810及其应用 | |
CN105296392B (zh) | 防治十字花科根肿病解淀粉芽孢杆菌Bam22的发酵方法 | |
CN109392600A (zh) | 一种富硒蛹虫草的培养方法 | |
CN108841889A (zh) | 利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法 | |
CN108823110A (zh) | 一株产灰黄霉素的菌株及其应用 | |
WO2003033683A1 (fr) | Micro-organismes et production de composes de carotinoide | |
CN104152503B (zh) | 一种提高异养下微藻脂肪酸产率的方法 | |
CN101492644A (zh) | 一种生物合成15n标记螺旋藻的方法 | |
CN110024623A (zh) | L-脯氨酸在提高冬虫夏草菌芽生孢子数量和菌丝生物量中的应用 | |
CN109810902A (zh) | 一种金藻的快速培养方法 | |
CN105441344B (zh) | 一株具有抗氧化功能的产朊假丝酵母及其应用 | |
Hansson et al. | Effects of cultivation techniques and media on yields and morphology of the basidiomycete Armillaria mellea | |
CN104962549B (zh) | 一种沼泽红假单胞菌同步化浓缩的方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190927 |