CN101492644A - 一种生物合成15n标记螺旋藻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物合成15N标记螺旋藻的方法以及实现所述方法的培养基。所述培养基中含有碳源、氮源、磷源、无机盐及微量元素，并且以15N尿素为氮源，以葡萄糖和碳酸氢钠为碳源。本发明所述的方法包括富集驯化15N螺旋藻藻种，将15N螺旋藻藻种接种于所述的15N培养基中培养，得到含有15N标记螺旋藻的培养液；以及从培养液中分离15N标记螺旋藻。所述方法还包括将所述培养液回收再利用。本发明的方法可得到高丰度的15N标记螺旋藻，产量高且成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物学或藻类培育领域，更具体地，本发明涉及一种15N标记螺旋藻的生物合成方法。
背景技术
螺旋藻(Spirulina)属于蓝藻门、蓝藻纲、颤藻科、段殖体目、螺旋藻属，是一种多细胞丝状水生微藻植物，因其在显微镜下呈螺旋状而得名，螺旋藻种有35个以上，目前用于生产的主要有钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)和极大螺旋藻(Spirulina maxima)。螺旋藻含有丰富的优质蛋白质及多种维生素、矿物质、叶绿素、γ-亚麻酸等不饱和脂肪酸和β-胡萝卜素、多糖、藻胆蛋白、微量元素等对人体有特殊药效功能的多种活性物质，其蛋白质含量约为细胞总量的60～70％，螺旋藻所含营养物质不但丰富、优质、齐全，而且各种比例科学合理，1克螺旋藻的营养价值等于1000克蔬菜和水果的营养总和，被全世界公认为“人类最佳的营养保健品”。螺旋藻以其特有的组成日益引起藻类学家、营养学家和医学界的广泛重视，国际上已将其应用于食品、医药和保健品等诸多领域，是一种有巨大开发潜力和利用价值的多功能产品。
15N标记螺旋藻是采用生物合成的工艺路线，对螺旋藻的氮原子进行同位素15N的标记，形成一种具有示踪剂功能的营养品，供新陈代谢机理研究等领域应用。稳定性同位素15N标记螺旋藻作为一种独特的示踪剂在生命科学研究、药物代谢研究、病理代谢研究中等有着不可替代的作用。用15N标记螺旋藻作为蛋白质定量提供给糖尿病人，可以研究糖尿病人吸收丙氨酸和蛋白质后转化成尿素后体内氨基酸的变化情况，从而进一步研究病理，开发新药。用15N标记螺旋藻作为营养源喂养罹患脑肿瘤的小白鼠，可以研究脑肿瘤的形成原因，发明诊断和治疗脑肿瘤的新方法。
近年来，中国的螺旋藻产业迅速发展，生产规模居国际前列，有关螺旋藻的研究报道和专利较多，但都没有有关15N标记螺旋藻的专利及相关文献报道。专利申请号为98124744.X，专利名为“一种家养食用新鲜螺旋藻的方法”，及专利申请号为200510005016.2，专利名为“一种室内养殖螺旋藻及其控制其放氧与生态造景的方法”，公开了家庭养殖螺旋藻的品种、养殖环境条件和养殖用容器等，该两个方案简单实用，可以人工控制温度及光照条件，进行连续培养收获一段时间后直接更换营养液，而没有对营养液进行回收利用，所用藻种为普通的钝顶或极大螺旋藻，生产的螺旋藻为天然丰度，不适合15N标记螺旋藻的培养。专利申请号为200610048617.6，专利名为“螺旋藻废水处理工艺”，公开了螺旋藻培养后废水的物理化学处理方法，该方法要配备专门的设备管线，消耗水电、药剂等，不适合15N标记螺旋藻培养废液的处理。
因此，本领域迫切需要研究15N标记螺旋藻的培育工艺，以期得到成本低廉，产量高且15N丰度高的15N标记螺旋藻。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非常适合于培养5N标记螺旋藻的培养基。
本发明的目的还在于提供一种生物合成15N标记螺旋藻的方法，使用该方法获得的15N标记螺旋藻产量高，产品丰度＞98％，15N氮源利用率高，生产成本低，产品的同位素丰度与氮源原料的同位素丰度相比没有下降。更佳地还包括对15N标记螺旋藻培养基循环利用培养15N标记螺旋藻的方法。
在本发明的第一方面，提供一种15N标记螺旋藻的培养基，所述培养基中含有碳源、氮源、磷源、无机盐；并且所述培养基以15N尿素为氮源，以葡萄糖和碳酸氢钠为碳源，以磷酸氢二钾为磷源，且氮源、碳源和磷源含量如下：
15N尿素 0.05-1g/L；
葡萄糖 0.2-5g/L；
碳酸氢钠 5-20g/L；
磷酸氢二钾 0.1-1.5g/L。
较佳地，所述的培养基中还含有：微量元素。
在另一优选例中，所述的15N培养基中，还含有15N硝酸钠作为氮源，其含量为：0.1-5g/L。
在另一优选例中，所述的培养基中还含有培养有效量的以下成分：硫酸镁，氯化钠，EDTA-钠，硫酸钾，硫酸亚铁，氯化钙，A5溶液和B6溶液。较佳地，上述成分的含量如下：
硫酸镁 0.2g/L； 硫酸钾 1g/L；
氯化钠 1g/L； 硫酸亚铁 0.01g/L；
EDTA-钠 0.08g/L； 氯化钙 0.04g/L；
A5溶液 1ml/L； B6溶液 1ml/L。
在另一优选例中，所述的A5溶液含有：硼酸2.86g/L，氯化锰1.81g/L，硫酸锌0.22g/L，硫酸铜0.08g/L，钼酸钠0.021g/L。
在另一优选例中，所述的B6溶液含有：钒酸钠239.3mg/L，硫酸铬钾960mg/L，硫酸镍447.8mg/L，氯化钴437.3mg/L，钨酸钠179.4mg/L，硫酸钛40mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基的PH值是8-10；较佳的PH值是8.5-9.5。
在另一优选例中，所述的各成分配制于1000mL的水中。
在本发明的第二方面，提供一种生产15N标记螺旋藻的方法，所述方法包括：
(1)将螺旋藻藻种(优选15N标记螺旋藻藻种)接种于所述的15N培养基中培养，得到含有15N标记螺旋藻的培养产物；和
(2)从培养产物中分离15N标记螺旋藻。
在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括步骤：将普通螺旋藻(即天然丰度螺旋藻)藻种进行逐步富集培养，驯化成15N螺旋藻藻种。
在另一优选例中，逐步富集培养的方法包括：将0.2-1体积的普通螺旋藻藻种接种到5-15体积的15N种子培养基中，在光照强度2000-4000Lux，温度22-30℃条件下培养，至藻液呈绿色后添加2-12体积的15N种子培养基；之后每隔20-30小时添加2-12体积的15N种子培养基，8-12天后得到15N螺旋藻藻种；其中，所述的15N种子培养基为Zarrouk培养基，且其中的硝酸钠为15N硝酸钠。较佳地，所述的15N种子培养基成分含量如下：
碳酸氢钠 16.8g/L； 硫酸钾 1g/L；
15N-硝酸钠 2.5g/L； EDTA-钠 0.08g/L；
氯化钠 1g/L； 硫酸亚铁 0.01g/L；
磷酸氢二钾 0.5g/L； 氯化钙 0.04g/L；
硫酸镁 0.2g/L； A5溶液 1ml/L；
B6溶液 1ml/L； 水 1000ml。
在另一优选例中，步骤(1)包括：将1体积的螺旋藻藻种接种到8-20体积(较佳地10-17体积)的所述的15N培养基中，在光照强度2000-6000Lux、温度22-30℃条件下培养，8-15天结束培养，得到含有15N标记螺旋藻的培养产物。
在另一优选例中，步骤(2)包括：用绢筛或滤布过滤培养产物，收获截留的15N螺旋藻，洗涤，干燥，研磨获得15N螺旋藻成品。
在另一优选例中，所述的15N螺旋藻成品中15N的丰度大于98％。
在另一优选例中，在步骤(2)之后，还包括步骤：
(3)回收分离掉15N标记螺旋藻后的培养基，测定其中各成分的剩余量，根据所述的15N培养基所限定的含量补加各成分，获得所述的15N培养基；
(4)重复步骤(1)-(3)1-100次(如2次、5次、10次、20次、50次)。
在另一优选例中，步骤(3)中，包括：回收分离掉15N标记螺旋藻后的培养基，测定其中碳酸氢钠、葡萄糖、15N尿素(或15N尿素和15N硝酸钠)、氯化钠、硫酸钾和磷酸氢二钾的剩余量，其它成分视为全部用完；根据前面所述的15N培养基所限定的含量补加各成分，获得所述的15N培养基。
在另一优选例中，所述的螺旋藻选自：钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)或极大螺旋藻(Spirulina maxima)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究和反复的试验，在现有螺旋藻培养基的基础上进行优化研究，从而获得一种特别适合于制备15N标记螺旋藻的培养基，利用所述培养基可高产量地获得15N标记螺旋藻，且15N丰度非常高，通常大于98％。本发明还提供了培养15N标记螺旋藻的方法，所述方法包括富集驯化15N螺旋藻藻种，将15N螺旋藻藻种接种于所述的15N培养基中培养，得到15N标记螺旋藻。所述方法更佳地还包括将所述培养基回收再利用，从而有效降低了生产成本。
如本发明所用，所述的“螺旋藻藻种”通常选自：钝顶螺旋藻藻种或极大螺旋藻藻种。
如本发明所用，所述的“普通螺旋藻”又称为“天然丰度螺旋藻”，其体内存在的或被其利用的氮元素为天然丰度，即15N丰度通常约为0.365％，区别于本发明所合成的15N标记螺旋藻。
所述的“15N标记螺旋藻”通常是指15N丰度高于天然丰度螺旋藻(15N丰度约0.365％)的螺旋藻。在本发明中，除非另外说明，所述的“15N标记螺旋藻”是指“高丰度的15N标记螺旋藻”，也即15N丰度大于90％，更佳地大于95％，最佳地大于98％的螺旋藻。15N标记具有示踪的功能。15N被螺旋藻细胞利用后，构成螺旋藻细胞化合物的重要元素，因此当15N标记螺旋藻被动物或人摄取或代谢后，可通过放射自显影技术等，观察到放射性物质在细胞或组织中的分布，实现示踪的目的。
如本发明所用，除非另外说明，所述的“15N尿素”是指15N丰度大于90％，较佳地大于95％，更佳地大于99％尿素。除非另外说明，所述的“15N硝酸钠”是指15N丰度大于90％，较佳地大于95％，更佳地大于99％的硝酸钠。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
培养基
(a)生物合成培养基
基于已知的螺旋藻生物合成培养基配方即Zarrouk配方，本发明人优化了15N标记螺旋藻生物合成培养基的配方，对碳源、氮源、磷源进行优化选择，找到最适合于生物合成15N标记螺旋藻，且有利于保持或提高15N丰度的培养基。结果发现以15N尿素作为氮源，以葡萄糖和碳酸氢钠作为碳源可以为15N标记螺旋藻提供良好的培养和繁殖条件。本发明人通过研究发现，采用高丰度15N尿素作为氮源，在用量少且成本低的基础上，可获得非常高的产量，且产品的15N丰度在98％以上；采用葡萄糖和碳酸氢钠的组合作为碳源，更易于被螺旋藻迅速、有效地利用，对螺旋藻的生长繁殖特别有利。
进一步地，本发明人采用正交优化组合法，获得碳源、氮源、磷源的适合含量以及较佳含量，如表1所示。
表1
| 成分 | 含量 | 较佳含量 |
| 碳酸氢钠 | 5-20g/L | 6-15g/L |
| 葡萄糖 | 0.2-5g/L | 0.5-3g/L |
| 15N尿素 | 0.05-1g/L | 0.1-0.6g/L |
| 磷酸氢二钾 | 0.1-1.5g/L | 0.2-1g/L |
作为本发明的优选方式，所述的15N培养基中，还含有15N硝酸钠作为氮源，其含量为：0.1-5g/L；较佳的是1-3g/L。
所述的15N培养基中还含有培养有效量的以下成分：作为无机盐的硫酸镁，氯化钠，EDTA-钠，硫酸钾，硫酸亚铁，氯化钙；和提供微量元素的A5溶液，B6溶液。所述的“培养有效量”是指足以满足15N标记螺旋藻生长、繁殖所需的营养成分的量。上述成分可以根据本领域人员常规用于生产螺旋藻时的常用量而定，例如，它们的用量基本上可以与Zarrouk培养基(包括Zarrouk基本培养基或Zarrouk改良培养基)配方相同。对于Zarrouk培养基的描述还可以参考《生物饵料培养》(中国农业出版社)中所记载的。作为本发明的优选方式，所述各成分的适合含量和较佳含量如表2所示。
表2
| 成分 | 含量 | 较佳含量 |
| 硫酸镁 | 0.2±0.05g/L | 0.2g/L |
| 氯化钠 | 1±0.2g/L | 1g/L |
| EDTA-钠 | 0.08±0.02g/L | 0.08g/L |
| 硫酸钾 | 1±0.2g/L | 1g/L |
| 硫酸亚铁 | 0.01±0.005g/L | 0.01g/L |
| 氯化钙 | 0.04±0.01g/L | 0.04g/L |
| A5溶液 | 1±0.2ml/L | 1ml/L |
| B6溶液 | 1±0.2ml/L | 1ml/L |
A5溶液和B6溶液的配方也是本领域人员已知的。较佳的，所述的A5溶液含有：硼酸2.86g/L，氯化锰1.81g/L，硫酸锌0.22g/L，硫酸铜0.08g/L，钼酸钠0.021g/L。较佳的，所述的B6溶液含有：钒酸钠239.3mg/L，硫酸铬钾960mg/L，硫酸镍447.8mg/L，氯化钴437.3mg/L，钨酸钠179.4mg/L，硫酸钛40mg/L。
作为本发明的较优选方式，所述的15N标记螺旋藻生物合成培养基含有：15N尿素(或15N尿素和15N硝酸钠的组合)，碳酸氢钠，葡萄糖，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠，EDTA-钠，硫酸钾，硫酸亚铁，氯化钙，A5溶液和B6溶液；更特别的，所述培养基由上述成分以及水组成。
作为本发明的优选方式，所述的15N标记螺旋藻生物合成培养基的PH值是8-10；较佳的PH值是8.5-9.5。
(b)种子培养基
在生物合成15N标记螺旋藻时，较佳的需要将天然丰度螺旋藻藻种驯化培养使之成为15N标记的螺旋藻藻种。因此，本发明还涉及一种用于驯化培养15N标记的螺旋藻藻种的培养基(又称为15N种子培养基)。所述的15N种子培养基优选的是Zarrouk培养基，且其中的硝酸钠为15N硝酸钠。
作为本发明的优选方式，所述的15N种子培养基中含有如表3所示的成分。
表3
| 成分 | 含量 | 较佳含量 |
| 碳酸氢钠 | 16.8±5g/L | 16.8g/L |
| 15N-硝酸钠 | 2.5±1g/L | 2.5g/L |
| 氯化钠 | 1±0.3g/L | 1g/L |
| 磷酸氢二钾 | 0.5±0.2g/L | 0.5g/L |
| 硫酸镁 | 0.2±0.1g/L | 0.2g/L |
| 硫酸钾 | 1±0.4g/L | 1g/L |
| EDTA-钠 | 0.08±0.03g/L | 0.083g/L |
| 硫酸亚铁 | 0.01±0.004g/L | 0.01g/L |
| 氯化钙 | 0.04±0.01g/L | 0.04g/L |
| A5溶液 | 1±0.4ml/L | 1ml/L |
| B6溶液 | 1±0.4ml/L | 1ml/L |
| 水 | 1000ml | 1000ml |
在配置上述的15N标记螺旋藻生物合成培养基和种子培养基时，各培养基成分可配制于水中，优选的是蒸馏水。
培养方法
本发明还涉及一种生产15N标记螺旋藻的方法，所述方法包括：(1)将螺旋藻藻种(优选15N标记螺旋藻藻种)接种于本发明所述的15N标记螺旋藻生物合成培养基中培养，得到含有15N标记螺旋藻的培养基；和(2)从培养基中分离15N标记螺旋藻。
作为本发明的特别优选的方式，在步骤(1)之前，还包括步骤：将普通螺旋藻(即天然丰度螺旋藻)藻种进行逐步富集培养，驯化成15N螺旋藻藻种。本发明人发现，直接将普通螺旋藻接种于15N标记螺旋藻生物合成培养基中培养，尽管也能够获得15N标记螺旋藻产品，但是该产品的15N丰度较低，通常会低于80％，这种丰度无法满足特殊需求，特别是用于研究领域。因此为了提高培养产物的15N丰度，本发明人经过了反复的研究，最终发现在生物合成前，先将普通螺旋藻接种在少量的含有15N氮源的培养基上培养，之后每隔一段时间少量多次地补充含有15N氮源的培养基，可以获得15N丰度高的15N标记螺旋藻藻种。利用这种藻种接种于所述的15N标记螺旋藻生物合成培养基中，可极大地提高15N标记螺旋藻产物的15N丰度，使丰度达到98％以上。
作为本发明的优选方式，所述的逐步富集培养的方法包括：将0.2-1体积(较佳地0.3-0.8体积)的天然丰度螺旋藻藻种接种到5-15体积(较佳地8-12体积)的15N种子培养基中，在光照强度2000-4000Lux，温度22-30℃(较佳地25℃左右)条件下培养，至藻液呈绿色后添加2-12体积(较佳地3-9体积)的15N种子培养基；之后每隔20-30小时添加2-12体积(较佳地3-9体积)的15N种子培养基，8-12天后，螺旋藻OD值达到1-1.5(较佳的1.2左右)，获得15N螺旋藻藻种。
逐步富集培养过程中，所述的15N种子培养基可以采用Zarrouk培养基，其中的硝酸钠以15N硝酸钠替代一般的天然丰度硝酸钠。较佳地，所述的15N种子培养基配方如表3所示。
作为本发明的优选方式，步骤(1)包括：将经过前述逐步富集培养获得的15N螺旋藻藻种接种到所述的15N标记螺旋藻生物合成培养基中，在光照强度2000-6000Lux(较佳地2500-5000Lux)、温度22-30℃(较佳地24-30℃)条件下培养，8-15天(较佳地10-14天)结束培养，得到含有15N标记螺旋藻的培养基。在接种时，较佳地是将1体积的螺旋藻藻种接种到8-20体积的所述的15N培养基中。采用上述的生物合成方法，在原料成本低且用量少的前提下，可获得高丰度的15N标记螺旋藻产品，且15N丰度大于98％。
从培养产物中分离或纯化15N标记螺旋藻可采用本领域技术人员熟知的分离纯化技术。较佳地，可以通过过滤的方法从培养产物中分离出15N标记螺旋藻，较为简单的方法是采用常规的的确良布过滤培养产物，收获截留15N螺旋藻。较佳的，可对15N螺旋藻进一步进行洗涤，干燥，获得较纯的15N螺旋藻成品。当然，其它的分离方式也可包含在本发明中。
在一次培养结束并分离掉15N螺旋藻后，本发明还涉及回收所述的合成培养基，测定其中各成分的剩余量，根据表1所限定的含量补加各成分，获得的培养基用于后续15N螺旋藻的生物合成。为了简化检测步骤，优选地可以只测定回收的培养基中碳酸氢钠、15N尿素(或15N尿素和15N硝酸钠)、氯化钠、硫酸钾和磷酸氢二钾的剩余量，其它成分视为全部用完；然后根据前述表1或表2提供的培养基配方向回收的培养基中补足各成分。
作为本发明的优选方式，一种完整的生物合成15N螺旋藻工艺路线主要如图1所示。
本发明的主要优点在于：
由于15N原料十分昂贵，15N螺旋藻产品仅适合在室内小规模培养获得，采用本发明生物合成的15N标记螺旋藻产量高、质量好、工艺简单、设备投入少、管理方便，15N同位素氮源可以100％利用，产品的同位素丰度与氮源原料的同位素丰度相比没有显著降低，从而克服了现有技术中培育15N螺旋藻同位素丰度易于降低的技术缺陷。培养液循环利用的工艺不但节约了生产成本，还避免了对环境的污染。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1.15N标记螺旋藻制备例1
1、配制15N种子培养基
配制1L15N种子培养基，向烧杯中加入1L蒸馏水，其中加入的各种营养成分如表4。
表4
其中，A5溶液和B6溶液的配方(参见《生物饵料培养》(中国农业出版社)中第68-69页)如下：
其中A5溶液(g/L)：硼酸2.86，氯化锰1.81，硫酸锌0.22，硫酸铜0.08，钼酸钠0.021。
B6溶液(mg/L)：钒酸钠239.3，硫酸铬钾960，硫酸镍447.8，氯化钴437.3，钨酸钠179.4，硫酸钛40mg/L。
调节培养基pH8.5。
2、配制15N螺旋藻生物合成培养基
以蒸馏水配制5L15N螺旋藻生物合成培养基，各营养成分浓度如表5。
表5
调节培养基pH为9.5，分装500ml三角瓶，每瓶装液量200ml。
3、15N螺旋藻藻种培养
取1ml普通的钝顶螺旋藻液(FACHB-439，中科院水生生物研究所购得)接种到10ml15N种子培养基中，置日光灯下光照强度2500～3000Lux、温度25℃条件下培养，等藻液呈明显的绿色后，每隔24小时左右添加4ml15N种子培养基，大约7～10天左右，OD值达到1.2。获得15N螺旋藻藻种。可根据接种量的需求添加15N种子培养基继续培养以获得更多的15N螺旋藻藻种。
4、15N螺旋藻的培养
将15mL上述15N螺旋藻藻种接种到200mL上述2配制的15N螺旋藻生物合成培养基中，置日光灯下光照强度2500～3000Lux、温度25℃条件下培养，每天摇动3～4次，10天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品8.58克，产品丰度98.58％。
5、培养液的再利用
将上述培养液收集，测得其中碳酸氢钠的残余量为6.46g/L，补加至10g/L，15N尿素为0.006g/L，视为全部用完，补加0.1g/L，葡萄糖为0g/L，全部用完，补加0.50g/L，氯化钠为0.51g/L，补加至1.0g/L，硫酸钾0.75g/L，补加至1.0g/L，磷酸氢二钾0.42g/L，补加至0.80g/L，其他营养元素视为全部用完，全部补加，按2中所述配方配制好5L培养基，接入3中所述15N螺旋藻液如4中所述培养，12天后收获，得到15N螺旋藻产品8.20克，产品丰度98.50％。
实施例2.15N标记螺旋藻制备例2
1、配制15N种子培养基
配制1L15N种子培养基，如实施例1中配制。
2、15N螺旋藻藻种培养
取0.8ml普通的钝顶螺旋藻液接种到10ml15N种子培养基中，置日光灯下光照强度2500～3000Lux、温度25℃条件下培养，等藻液呈明显的绿色后每隔24小时左右添加4ml15N种子培养基，大约10天左右，OD值达到1.2，获得15N螺旋藻藻种。可根据接种量的需求添加15N种子培养基继续培养以获得更多的15N螺旋藻藻种。
3、配制15N螺旋藻生物合成培养基
配制3L15N螺旋藻生物合成培养基，向直径30cm的玻璃水槽中加入蒸馏水3L，向其中加入营养成分如表6。
表6
调节培养基pH为8.5。
4、15N螺旋藻的培养
将300mL上述15N螺旋藻藻种接入3000mL上述3配制的培养基中，置日光灯下光照强度4000～5000Lux、温度28℃，用养鱼用小气泵持续通气条件下培养，12天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品5.37克，产品丰度98.48％。
5、培养液的再利用
收集上述培养液，测得其中碳酸氢钠的残余量为8.72g/L，补加6.28g/L，15N尿素为0.003g/L，视为全部用完，补加0.6g/L，葡萄糖为0.005g/L，视为全部用完，补加1.0g/L，氯化钠为0.36g/L，补加0.64g/L，硫酸钾0.65g/L，补加0.35g/L，磷酸氢二钾0.26g/L，补加0.14g/L，其他营养元素视为全部用完，全部补加，按3中所述配方配制好3L培养基，接入15N螺旋藻液300ml，置日光灯下光照强度4000～5000Lux、温度28℃，用养鱼用小气泵持续通气条件下培养，13天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品5.17克，产品丰度98.42％。
实施例3.15N标记螺旋藻制备例3
1、配制15N种子培养基
配制1L15N种子培养基，如实施例1中配制。
2、15N螺旋藻藻种培养
取0.6ml普通的钝顶螺旋藻液接种到10ml15N种子培养基中，置日光灯下光照强度2500～3000Lux温度25℃条件下培养，等藻液呈明显的绿色后每隔24小时左右添加3ml15N种子培养基，大约10天左右，OD值达到1.2，获得15N螺旋藻藻种。可根据接种量的需求添加15N种子培养基继续培养以获得更多的15N螺旋藻藻种。
3、配制15N螺旋藻生物合成培养基
以蒸馏水配制5L15N螺旋藻生物合成培养基，各营养成分浓度如表7。
表7
调节pH为9.0，分装500ml三角瓶，每瓶装液量约200ml。
4、15N螺旋藻的培养
将15mL上述15N螺旋藻藻种接入200mL上述3配制的培养基中，置日光灯下光照强度3000～4000Lux、温度30℃条件下培养，每天摇动3～4次，12天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品8.82克，产品丰度98.60％。
5、培养液的再利用
收集上述培养液，测得其中碳酸氢钠的残余量为4.52g/L，补加至7.0g/L，15N尿素为0.05g/L，补加至0.4g/L，硝酸钠1.2g/L，补加至2.0g/L，葡萄糖为0.005g/L，视为全部用完，补加1.5g/L，氯化钠为0.39g/L，补加至1.0g/L，硫酸钾0.35g/L，补加至1.0g/L，磷酸氢二钾0.16g/L，补加至0.3g/L，其他营养元素视为全部用完，全部补加，按3中所述配方配制好5L培养基，接入15N螺旋藻液，置日光灯下光照强度3000～4000Lux、温度30℃条件下培养，13天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品8.73克，产品丰度98.42％。
实施例4.15N标记螺旋藻制备例4
1、配制15N种子培养基
配制1L15N种子培养基，如实施例1中配制。
2、15N螺旋藻藻种培养
取0.4ml普通的钝顶螺旋藻液接种到10ml15N种子培养基中，置日光灯下光照强度2500～3000Lux、温度25℃条件下培养，等藻液呈明显的绿色后每隔24小时左右添加6ml15N种子培养基，大约10天左右，OD值达到1.2，获得15N螺旋藻藻种。可根据接种量的需求添加15N种子培养基继续培养以获得更多的15N螺旋藻藻种。
3、配制15N螺旋藻生物合成培养基
以蒸馏水配制5L15N螺旋藻生物合成培养基，各营养成分浓度如表8。
表8
调节培养基的pH为8.8，分装500ml三角瓶，每瓶装液量200ml。
4、15N螺旋藻的培养
将15mL上述15N螺旋藻藻种接入200mL上述3配制的培养基中，置日光灯下光照强度3000～3500Lux、温度29℃条件下培养，每天摇动3～4次，13天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品8.75克，产品丰度98.39％。
5、培养液的再利用
收集上述培养液，测得其中碳酸氢钠的残余量为4.32g/L，补加至9.0g/L，15N尿素为0.06g/L，补加至0.3g/L，硝酸钠1.0g/L，补加至1.5g/L，葡萄糖为0.005g/L，视为全部用完，补加2.0g/L，氯化钠为0.42g/L，补加至1.0g/L，硫酸钾0.39g/L，补加至1.0g/L，磷酸氢二钾0.25g/L，补加至0.6g/L，其他营养元素视为全部用完，全部补加，按3中所述配方配制好5L培养基，接入15N螺旋藻液置日光灯下光照强度3000～3500Lux、温度29℃条件下培养，13天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品8.43克，产品丰度98.38％。
实施例5.15N标记螺旋藻制备例5
1、配制15N种子培养基
配制1L15N种子培养基，如实施例1中配制。
2、15N螺旋藻藻种培养
取0.3ml普通的钝顶螺旋藻液接种到10ml15N种子培养基中，置日光灯下光照强度2500～3000Lux、温度25℃条件下培养，等藻液呈明显的绿色后每隔24小时左右添加10ml15N种子培养基，大约10天左右，OD值达到1.2，获得15N螺旋藻藻种。可根据接种量的需求添加15N种子培养基继续培养以获得更多的15N螺旋藻藻种。
3、配制15N螺旋藻生物合成培养基
以蒸馏水配制5L15N螺旋藻生物合成培养基，各营养成分浓度如表9。
表9
调节培养基pH为9.2，分装500ml三角瓶，每瓶装液量200ml。
4、15N螺旋藻的培养
将15mL上述15N螺旋藻藻种接入200mL上述培养基中，置日光灯下光照强度3000～4000Lux、温度28℃条件下培养，每天摇动3～4次，11天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品8.85克，产品丰度98.65％。
5、培养液的再利用
收集上述培养液，测得其中碳酸氢钠的残余量为7.48g/L，补加至12.0g/L，15N尿素为0.03g/L，补加至0.2g/L，硝酸钠1.8g/L，补加至2.5g/L，葡萄糖为0.005g/L，视为全部用完，补加2.5g/L，氯化钠为0.52g/L，补加至1.0g/L，硫酸钾0.64g/L，补加至1.0g/L，磷酸氢二钾0.32g/L，补加至0.5g/L，其他营养元素视为全部用完，全部补加，按3中所述配方配制好5L培养基，接入15N螺旋藻液置日光灯下光照强度3000～4000Lux、温度28℃条件下培养，13天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品8.79克，产品丰度98.63％。
实施例6.15N标记螺旋藻制备例6
1、配制15N种子培养基
配制1L15N种子培养基，如实施例1中配制。
2、15N螺旋藻藻种培养
取0.5ml普通的钝顶螺旋藻液接种到10ml15N种子培养基中，置日光灯下光照强度2500～3000Lux、温度25℃条件下培养，等藻液呈明显的绿色后每隔24小时左右添加8ml15N种子培养基，大约10天左右OD值达到1.2，获得15N螺旋藻藻种。可根据接种量的需求添加15N种子培养基继续培养以获得更多的15N螺旋藻藻种。
3、配制15N螺旋藻生物合成培养基
配制4.0L15N螺旋藻生物合成培养基，向直径30cm的玻璃水槽中加入蒸馏水4.0L，向其中加入营养成分如表10。
表10
调节培养基的pH为9.5。
4、15N螺旋藻的培养
将400mL上述15N螺旋藻藻种接入4000mL上述培养基中，置日光灯下光照强度4500～5000Lux、温度26℃，用养鱼用小气泵持续通气条件下培养，14天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品6.62克，产品丰度98.46％。
5、培养液的再利用
收集上述培养液，测得其中碳酸氢钠的残余量为7.21g/L，补加5.79g/L，15N尿素为0.001g/L，视为全部用完，补加0.5g/L，葡萄糖为0.003g/L，视为全部用完，补加3.0g/L，氯化钠为0.41g/L，补加0.59g/L，硫酸钾0.68g/L，补加0.32g/L，磷酸氢二钾0.08g/L，补加0.12g/L，其他营养元素视为全部用完，全部补加，按3中所述配方配制好4L培养基，接入15N螺旋藻液400ml，置日光灯下光照强度4500～5000Lux、温度26℃，用养鱼用小气泵持续通气条件下培养，14天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品6.15克，产品丰度98.42％。
实施例7.15N标记螺旋藻制备例7
1、配制15N种子培养基
配制1L15N种子培养基，如实施例1中配制。
2、15N螺旋藻藻种培养
取0.7ml普通的钝顶螺旋藻液接种到10ml15N种子培养基中，置日光灯下光照强度2500～3000Lux、温度25℃条件下培养，等藻液呈明显的绿色后每隔24小时左右添加9ml15N种子培养基，7-10天后，OD值达到1.2，获得15N螺旋藻藻种。可根据接种量的需求添加15N种子培养基继续培养以获得更多的15N螺旋藻藻种。
3、配制15N螺旋藻生物合成培养基
以蒸馏水配制5L15N螺旋藻生物合成培养基，各营养成分浓度如表11。
表11
调节培养液pH为9.2，分装500ml三角瓶，每瓶装液量200ml。
4、15N螺旋藻的培养
将15mL上述15N螺旋藻藻种接入200mL上述培养基中，置日光灯下光照强度3000～4000Lux、温度28℃条件下培养，每天摇动3～4次，11天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品5.23克，产品丰度98.32％。
实施例8.15N标记螺旋藻制备例8
1、配制15N螺旋藻生物合成培养基
以蒸馏水配制5L15N螺旋藻生物合成培养基，各营养成分浓度如表12。
表12
调节pH为9.2，分装500ml三角瓶，每瓶装液量200ml。
2、15N螺旋藻的培养
将15mL普通钝顶螺旋藻藻种接入200mL上述培养基中，置日光灯下光照强度3000～4000Lux、温度28℃条件下培养，每天摇动3～4次，11天后收获，用白的确良布过滤，蒸馏水冲洗，60℃真空干燥得墨绿色15N螺旋藻产品8.83克，产品丰度78.19％。
附图说明
图1为本发明的优选方式，示出了一种完整的生物合成15N螺旋藻工艺路线。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种15N标记螺旋藻的培养基，其特征在于，所述培养基中含有碳源、氮源、磷源、无机盐；并且所述培养基以15N尿素为氮源，以葡萄糖和碳酸氢钠为碳源，以磷酸氢二钾为磷源，且氮源、碳源和磷源含量如下：
15N尿素 0.05-1g/L；
葡萄糖 0.2-5g/L；
碳酸氢钠 5-20g/L；
磷酸氢二钾 0.1-1.5g/L。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的15N培养基中，还含有15N硝酸钠作为氮源，其含量为：0.1-5g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基中还含有培养有效量的以下成分：硫酸镁，氯化钠，EDTA-钠，硫酸钾，硫酸亚铁，氯化钙，A5溶液和B6溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述成分的含量如下：
硫酸镁 0.2g/L； 硫酸钾 1g/L；
氯化钠 1g/L； 硫酸亚铁 0.01g/L；
EDTA-钠 0.08g/L； 氯化钙 0.04g/L；
A5溶液 1ml/L； B6溶液 1ml/L。
5.一种生产15N标记螺旋藻的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将螺旋藻藻种接种于权利要求1-4任一所述的15N培养基中培养，得到含有15N标记螺旋藻的培养产物；和
(2)从培养产物中分离15N标记螺旋藻。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前，还包括步骤：
将普通螺旋藻藻种进行逐步富集培养，驯化成15N螺旋藻藻种。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，逐步富集培养的方法包括：
将0.2-1体积的普通螺旋藻藻种接种到5-15体积的15N种子培养基中，在光照强度2000-4000Lux，温度22-30℃条件下培养，至藻液呈绿色后添加2-12体积的15N种子培养基；之后每隔20-30小时添加2-12体积的15N种子培养基，8-12天后得到15N螺旋藻藻种；
其中，所述的15N种子培养基为Zarrouk培养基，且其中的硝酸钠为15N硝酸钠。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：
将1体积的螺旋藻藻种接种到8-20体积的权利要求1-4任一所述的15N培养基中，在光照强度2000-6000Lux、温度22-30℃条件下培养，8-15天结束培养，得到含有15N标记螺旋藻的培养产物。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之后，还包括步骤：
(3)回收分离掉15N标记螺旋藻后的培养基，测定其中各成分的剩余量，根据权利要求1-4任一所述的15N培养基所限定的含量补加各成分，获得权利要求1-4任一所述的15N培养基；
(4)重复步骤(1)-(3)1-100次。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的螺旋藻选自：钝顶螺旋藻或极大螺旋藻。
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