CN101824444B - 一种制备13c标记葡萄糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备13C标记葡萄糖的方法，以毕赤酵母作为出发菌株，13C甲醇作为碳源，经发酵、离心获得菌体，经乙醇溶液提取、脱色、结晶，获得13C标记的海藻糖；将13C标记的海藻糖酸解，然后，中和、脱色、结晶，获得13C标记的葡萄糖。与现有技术相比，本发明采用13C甲醇作为同位素原料，经发酵，将获得的菌体用乙醇溶液提取、脱色、结晶获得13C海藻糖，再经酸解，脱色、结晶，得到丰度和纯度大于98％的13C葡萄糖产品，此工艺简单，原料来源容易，可获得高丰度和纯度的13C葡萄糖产品。

Description

一种制备13C标记葡萄糖的方法
技术领域
本发明涉及一种制备葡萄糖的方法，尤其是涉及一种制备13C标记葡萄糖的方法。
背景技术
葡萄糖(glucose)是己醛糖，化学式C6H12O6，分子量为180，白色晶体，易溶于水，味甜，熔点146℃，结构式如下：
CH2OH-CHOH-CHOH-CHOH-CHOH-CHO。
它是自然界分布最广泛的单糖，被广泛用于医疗输液、生物原料等。13C标记的葡萄糖是葡萄糖的标记化合物，不仅用于呼吸法临床诊断糖尿病、通过测知脑细胞新陈代谢，进行早期脑血管、障碍或痴呆病变(例：老年痴呆症、帕金森氏症、阿兹海默氏症)的早期诊断，还可用于原料生产标记葡萄糖的衍生物，以及在发酵中用做碳源，合成其他标记产品。葡萄糖虽然在水果和蜂蜜中含量较高，但大规模生产方法却不是从中提取的，因为这样做成本太高。工业生产主要采用玉米和马铃薯中所含的淀粉经淀粉酶转化制取葡萄糖。对于标记葡萄糖的合成，目前已经探索出有机合成法、微生物光合作用法、发酵法以及酶法等几种合成方法。
(1)有机合成法
Williams和Whaley以5-氧代-1，2-O-亚异丙基-D-木-五呋喃糖和Na13CN为原料，经反应得到葡(萄)糖醛酸和艾杜糠醛酸，在四氢呋喃溶液中经LiAlH4还原得到1，2-O-亚异丙基-D-呋喃型葡萄糖-6-13C和1，2-O-亚异丙基-L-艾杜呋喃糖-6-13C，最后在三氟乙酸溶液中水解，得到D-葡萄糖6-13C，产率48％(D.L.Williams，T.W.Whaley.Syntheses with stable isotopes：D-glucose-6-13C and1.6-anhydro-β-L-idopyranose--6-13C.Journal of Labelled Compounds andRadiophamaceuticals.1982，19(5)：669-679)。Sharon Stone-Elander等利用远程装置，以D-树胶醛醣和[11C]氰化物为原料，在蚁酸中，利用热催化活性镍催化[1-11C]-羟醛腈中间体，获得8-11％产率的[1-11C]-D-glucose，纯度达到99％(Sharon Stone-Elander，Christer Halldin，Bengt Langstrom，Gunnar Blomqvist，Lennart Widen.Remote-controlled production of[1-11C]-D-glucose and evaluationof the effect of labeling position on loss of[11C]CO2.Appl.Radiat.Isot.1992，43(6)：721-729)。
(2)微生物光合作用法
Ishiwata等通过菠菜的光合作用，将11CO2转变成11C-葡萄糖和果糖的混合物(比例1∶1)，同位素转化率30-50％(K.Ishiwata，M.Monma，R.Iwata，T.Ido.Automated photosynthesis of 11C-glucose.J.Lab.Cpds Radiopharm.1982，19：11-12)。Denutte等利用远程控制，通过海藻的光合作用，将11CO2转变成11C-葡萄糖和果糖的混合物(比例3∶1)，同位素转化率10-15％(H.Denutte，G.Slegers，P.Goethals，C.Vande Casteele，A.DE Leenheer.Remote-controlled，photosyntheticpreparation of HPLC-purified[11C]glucose.Int.J.Appl.Radiat.Isot.1985，36(1)：82-84)。
(3)发酵法
Robert L.Baxter等以酿酒酵母属菌株S41为出发菌株，培养基为酵母提取液10g、蛋白胨20g、醋酸钾10g、葡萄糖1g、腺嘌呤0.2g和尿嘧啶0.2g。30℃，200rpm培养12h，然后将菌体离心，洗涤，并悬浮在每100ml含有[1-13C]或[2-13C]醋酸盐1g、腺嘌呤20mg和尿嘧啶20mg、氯化钾0.75g和15mg苄青霉素中培养8h。菌体经高氯酸处理，树脂柱吸附，旋转蒸发浓缩等获得同位素海藻糖。海藻糖在硫酸溶液中100℃水解6h，树脂柱吸附洗脱，得到60％D-[3，4-13C2]葡萄糖，10％D-[3-13C]和[4-13C]葡萄糖以及30％未标记物质(Robert L.Baxter，Helen C.Baxter，Christopher J.Mcgregor.Microbiological preparation of D-[3，4-13C2]glucose.1992，31(12)：981-985)。Ehrin E以海藻为原料，H11CO3-为唯一碳源，发酵。得到的菌体经提取可获得U-11C葡萄糖、果糖等多种糖。U-11C葡萄糖产量75mg/L(Ehrin E，Westman E，Nilsson S.O，Nilsson J.G，Larsson C，M，Tillberg J.E.J.Lab.Cpds Radiopharm.1980，17：453)。Luthra等在Ehrin E的基础上加以改进，以丰度90％的13C碳酸盐为唯一碳源，获得了丰度为60％的U-13C-葡萄糖(S.K Luthra，V.W Pike，F.Brady，D.R.Turton，B.Wood，R.W Matthews，G.EHawkes.The utility of 13C/11C-CO-labelling and subsequent 13C-NMR in thecharacterization of 11C-labelled products.J.Lab.Cpds Radiopharm.1980，23：1070-1072)。
(4)酶法
Sturani以1，5二磷酸核酮糖与14CO2为原料，合成3-磷酸甘油酸-1-14C，再经二磷酸核酮糖羧化酶作用得到葡萄糖-3和4-14C。产率35-40％(E.Sturani.Synthesis of glucose-3 and 4-14C of high specific activity and radiochemical purity.Journal of Labelled Compounds.1969，5(1)：47-53)。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺简单、丰度较高、纯度较高的制备13C标记葡萄糖的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种制备13C标记葡萄糖的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)以毕赤酵母作为出发菌株，13C甲醇作为碳源，经发酵、离心获得菌体，经乙醇溶液提取、脱色、结晶，获得13C标记的海藻糖；
(2)将13C标记的海藻糖酸解，然后，中和、脱色、结晶，获得13C标记的葡萄糖。
该方法具体包括以下步骤：
(1)将毕赤酵母一环接入种子培养基中，115℃灭菌20min，再于28-37℃，控制转速为150-240rpm摇瓶培养16-24h，得到种子液，以10％V/V的接种量将种子液接入发酵培养基中，灭菌后用30％的浓氨水调节发酵培养基的pH至4.0-6.0，加入灭菌的甲醇和微量元素，控制温度为28-37℃，转速为150-240rpm摇瓶发酵24-48h，升温至40-50℃，维持0.5-4h得到菌体，再控制温度为-5～5℃，转速为4000rpm离心20min，将菌体用蒸馏水洗涤，继续离心20min，控制温度30-90℃，采用30-70wt％乙醇提取菌体0.5-5h，得到的提取液经10000分子量的纳滤膜过滤、市售D001树脂脱色及无水乙醇结晶步骤，得到13C海藻糖；
(2)将13C海藻糖放入硫酸中于95-105℃酸解5-8h，加入碳酸钡中和到pH为6.8-7.0后，离心，上清液经市售D001树脂脱色，最后经过浓缩、结晶，得到13C标记的葡萄糖。
所述步骤(1)中的种子培养基以蒸馏水为溶液，包括以下组分及含量：13C甲醇，5-30mg/L，无氨基酸的酵母氮碱1-13.4g/L，生物素5-20mg/L，磷酸氢二钾0.10-3.24g/L。
所述步骤(1)中的发酵培养基包括以下组分及含量：CaSO4·2H2O0.05-0.93g/L，MgSO4·7H2O 1.5-14.9g/L，磷酸氢二钾1-53.4g/L。
所述步骤(1)中的微量元素包括以下组分及含量：FeSO4·7H2O 65g/L，MnSO4·H2O 3g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO30.2g/L，CoCl20.5g/L，ZnCl220g/L，生物素0.2g/L，CuSO4·5H2O 6g/L，KI 0.8g/L，肌醇0.3g/L，烟酰胺0.8g/L，对氨基苯甲酸0.06g/L，维生素B10.8mg/L，维生素B20.02mg/L。
所述步骤(1)中发酵培养基、甲醇和微量元素的重量比为1000∶(5-30)∶(1-10)。
与现有技术相比，本发明采用13C甲醇作为同位素原料，经发酵，将获得的菌体用乙醇溶液提取、脱色、结晶获得13C海藻糖，再经酸解，脱色、结晶，得到丰度和纯度大于98％的13C葡萄糖产品，此工艺简单，原料来源容易，可获得高丰度和纯度的13C葡萄糖产品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
将毕赤酵母一环接入装有50ml种子培养基的摇瓶中，培养基包括(1L)：13C甲醇5mg，酵母氮碱(无氨基酸)13.4g，生物素5mg，磷酸氢二钾1.32g，其余为蒸馏水，115℃灭菌20min。28℃，150rpm/min摇瓶培养16h，得到种子液。以10％V/V的接种量将种子液接入装有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，发酵培养基包括(1L)：0.05g CaSO4·2H2O，1.92g MgSO4·7H2O，13.4g磷酸氢二钾，115℃灭菌20min，然后用膜灭菌的30％浓氨水调节pH4.0，加入膜灭菌的10ml甲醇和4ml微量元素，微量元素包括(1L)：65g FeSO4·7H2O，3gMnSO4·H2O，0.2g Na2MoO4，·2H2O，0.2g H3BO3，0.5g CoCl2，20g ZnCl2，0.2g生物素，6g CuSO4·5H2O，0.8g KI，0.3g肌醇，0.8g烟酰胺，0.06g对氨基苯甲酸，0.8mg维生素B1，0.02mg维生素B2。28℃，150rpm/min发酵48h后，升温到40℃，维持0.5h。采用-5℃，4000rpm/min离心20min，将100g菌体用蒸馏水洗涤，继续离心。将菌体采用60wt％乙醇、90℃提取4h，提取液经10000分子量的纳滤膜过滤、D001树脂脱色，无水乙醇结晶，得到1.5g13C海藻糖。
将1.5g13C海藻糖放入硫酸中95℃酸解8h，加入碳酸钡中和到pH7.0后，离心，上清液经D001树脂脱色，浓缩、结晶，得到0.93g 13C葡萄糖产品。纯度不少于98％，丰度大于98％。
实施例2
将毕赤酵母一环接入装有50ml种子培养基的摇瓶中，培养基包括(1L)：13C甲醇30mg，酵母氮碱(无氨基酸)3.4g，生物素20mg，磷酸氢二钾0.10g，其余为蒸馏水，115℃灭菌20min。37℃，240rpm/min摇瓶培养24h，得到种子液。以10％V/V的接种量将种子液接入装有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，发酵培养基包括(1L)：0.93g CaSO4·2H2O，1.5g MgSO4·7H2O，1g磷酸氢二钾，115℃灭菌20min，然后用膜灭菌的30％浓氨水调节pH4.5，加入膜灭菌的10ml甲醇和1ml微量元素，微量元素包括(1L)：65g FeSO4·7H2O，3g MnSO4·H2O，0.2g Na2MoO4，·2H2O，0.2g H3BO3，0.5g CoCl2，20g ZnCl2，0.2g生物素，6gCuSO4·5H2O，0.8g KI，0.3g肌醇，0.8g烟酰胺，0.06g对氨基苯甲酸，0.8mg维生素B1，0.02mg维生素B2。37℃，240rpm/min发酵24h后，升温到40℃，维持3h。采用5℃，4000rpm/min离心20min，将80g菌体用蒸馏水洗涤，继续离心。将菌体采用40wt％乙醇、30℃提取1h，提取液经10000分子量的纳滤膜过滤、D001树脂脱色，无水乙醇结晶，得到1.42g13C海藻糖。
将1.42g13C海藻糖放入硫酸中105℃酸解5h，加入碳酸钡中和到pH7.0后，离心，上清液经D001树脂脱色，浓缩、结晶，得到0.78g 13C葡萄糖产品。纯度不少于98％，丰度大于98％。
实施例3
将毕赤酵母一环接入装有50ml种子培养基的摇瓶中，培养基包括(1L)：13C甲醇10mg，酵母氮碱(无氨基酸)6.8g，生物素15mg，磷酸氢二钾3.24g，其余为蒸馏水，115℃灭菌20min。37℃，200rpm/min摇瓶培养16h，得到种子液。以10％V/V的接种量将种子液接入装有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，发酵培养基包括(1L)：0.23g CaSO4·2H2O，14.9g MgSO4·7H2O，22.5g磷酸氢二钾，115℃灭菌20min，然后用膜灭菌的30％浓氨水调节pH6.0，加入膜灭菌的10ml甲醇和10ml微量元素，微量元素包括(1L)：65g FeSO4·7H2O，3gMnSO4·H2O，0.2g Na2MoO4，·2H2O，0.2g H3BO3，0.5g CoCl2，20g ZnCl2，0.2g生物素，6g CuSO4·5H2O，0.8g KI，0.3g肌醇，0.8g烟酰胺，0.06g对氨基苯甲酸，0.8mg维生素B1，0.02mg维生素B2。30℃，200rpm/min发酵24h后，升温到50℃，维持4h。采用0℃，4000rpm/min离心20min，将112g菌体用蒸馏水洗涤，继续离心。将菌体采用70wt％乙醇、50℃提取3h，提取液经10000分子量的纳滤膜过滤、D001树脂脱色，无水乙醇结晶，得到1.62g13C海藻糖。
将1.62g13C海藻糖放入硫酸中100℃酸解6h，加入碳酸钡中和到pH7.0后，离心，上清液经D001树脂脱色，浓缩、结晶，得到1.38g13C葡萄糖产品。纯度不少于98％，丰度大于98％。
实施例4
将毕赤酵母一环接入装有50ml种子培养基的摇瓶中，培养基包括(1L)：13C甲醇15mg，酵母氮碱(无氨基酸)10.2g，生物素10mg，磷酸氢二钾2.76g，其余为蒸馏水，115℃灭菌20min。再于30℃，180rpm/min摇瓶培养20h，得到种子液。以10％V/V的接种量将种子液接入装有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，发酵培养基包括(1L)：0.57g CaSO4·2H2O，8.3g MgSO4·7H2O，37.8g磷酸氢二钾，115℃灭菌20min，然后用膜灭菌的30％浓氨水调节pH5.0，加入膜灭菌的10ml甲醇和7ml微量元素，微量元素包括(1L)：65g FeSO4·7H2O，3g MnSO4·H2O，0.2g Na2MoO4，·2H2O，0.2g H3BO3，0.5g CoCl2，20g ZnCl2，0.2g生物素，6g CuSO4·5H2O，0.8g KI，0.3g肌醇，0.8g烟酰胺，0.06g对氨基苯甲酸，0.8mg维生素B1，0.02mg维生素B2。30℃，180rpm/min发酵48h后，升温到45℃，维持3h。采用0℃，4000rpm/min离心20min，将123g菌体用蒸馏水洗涤，继续离心。将菌体采用50wt％乙醇、75℃提取5h，提取液经10000分子量的纳滤膜过滤、D001树脂脱色，无水乙醇结晶，得到1.36g13C海藻糖。
将1.36g 13C海藻糖放入硫酸中95℃酸解8h，加入碳酸钡中和到pH7.0后，离心，上清液经D001树脂脱色，浓缩、结晶，得到0.88g 13C葡萄糖产品。纯度不少于98％，丰度大于98％。
实施例5
将毕赤酵母一环接入装有50ml种子培养基的摇瓶中，培养基包括(1L)：13C甲醇20mg，酵母氮碱(无氨基酸)5.1g，生物素12.5mg，磷酸氢二钾0.76g，其余为蒸馏水，115℃灭菌20min。37℃200rpm/min摇瓶培养16h，得到种子液。以10％V/V的接种量将种子液接入装有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，发酵培养基包括(1L)：0.74g CaSO4·2H2O，6.7g MgSO4·7H2O，53.4g磷酸氢二钾，115℃灭菌20min，然后用膜灭菌的30％浓氨水调节pH5.8，加入膜灭菌的10ml甲醇和5ml微量元素，微量元素包括(1L)：65g FeSO4·7H2O，3g MnSO4·H2O，0.2g Na2MoO4，·2H2O，0.2g H3BO3，0.5g CoCl2，20g ZnCl2，0.2g生物素，6gCuSO4·5H2O，0.8g KI，0.3g肌醇，0.8g烟酰胺，0.06g对氨基苯甲酸，0.8mg维生素B1，0.02mg维生素B2。30℃，200rpm/min发酵24h后，升温到43℃，维持2h。采用0℃，4000rpm/min离心20min，将147g菌体用蒸馏水洗涤，继续离心。将菌体采用30wt％乙醇、40℃提取0.5h，提取液经10000分子量的纳滤膜过滤、D001树脂脱色，无水乙醇结晶，得到1.45g13C海藻糖。
将1.45g 13C海藻糖放入硫酸中100℃酸解6h，加入碳酸钡中和到pH7.0后，离心，上清液经D001树脂脱色，浓缩、结晶，得到1.13g 13C葡萄糖产品。纯度不少于98％，丰度大于98％。
实施例6
一种制备13C标记葡萄糖的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将毕赤酵母一环接入种子培养基中，种子培养基以蒸馏水为溶液，包括以下组分及含量：13C甲醇10mg/L，无氨基酸的酵母氮碱1g/L，生物素10mg/L，磷酸氢二钾2g/L，115℃灭菌20min，再于37℃，控制转速为200rpm摇瓶培养16h，得到种子液。以10％V/V的接种量将种子液接入发酵培养基中，发酵培养基包括以下组分及含量：CaSO4·2H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 10.9g/L，磷酸氢二钾53.4g/L，灭菌后用30％的浓氨水调节发酵培养基的pH至4.0-6.0，加入灭菌的甲醇和微量元素，发酵培养基、甲醇和微量元素的重量比为1000∶5∶1，微量元素包括以下组分及含量：FeSO4·7H2O 65g/L，MnSO4·H2O 3g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO30.2g/L，CoCl20.5g/L，ZnCl220g/L，生物素0.2g/L，CuSO4·5H2O 6g/L，KI 0.8g/L，肌醇0.3g/L，烟酰胺0.8g/L，对氨基苯甲酸0.06g/L，维生素B10.8mg/L，维生素B20.02mg/L，控制温度为30℃，转速为200rpm摇瓶发酵24h，升温至40℃，维持3h得到菌体，再控制温度为0℃，转速为4000rpm离心20min，将菌体用蒸馏水洗涤，继续离心20min，控制温度70℃，采用50wt％乙醇提取菌体5h，得到的提取液经10000分子量的纳滤膜过滤、市售D001树脂脱色及无水乙醇结晶步骤，即得到13C海藻糖；
(2)将13C海藻糖放入硫酸中于100℃酸解6h，加入碳酸钡中和到pH为6.8后，离心，上清液经市售D001树脂脱色，最后经过浓缩、结晶，得到13C标记的葡萄糖。
实施例7
一种制备13C标记葡萄糖的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将毕赤酵母一环接入种子培养基中，种子培养基以蒸馏水为溶液，包括以下组分及含量：13C甲醇10mg/L，无氨基酸的酵母氮碱1g/L，生物素10mg/L，磷酸氢二钾2g/L，115℃灭菌20min，再于37℃，控制转速为200rpm摇瓶培养16h，得到种子液。以10％V/V的接种量将种子液接入发酵培养基中，发酵培养基包括以下组分及含量：CaSO4·2H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 10.9g/L，磷酸氢二钾53.4g/L，灭菌后用30％的浓氨水调节发酵培养基的pH至4.0-6.0，加入灭菌的甲醇和微量元素，发酵培养基、甲醇和微量元素的重量比为100∶30∶1，微量元素包括以下组分及含量：FeSO4·7H2O 65g/L，MnSO4·H2O 3g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO30.2g/L，CoCl20.5g/L，ZnCl220g/L，生物素0.2g/L，CuSO4·5H2O 6g/L，KI 0.8g/L，肌醇0.3g/L，烟酰胺0.8g/L，对氨基苯甲酸0.06g/L，维生素B10.8mg/L，维生素B20.02mg/L，控制温度为30℃，转速为200rpm摇瓶发酵24h，升温至40℃，维持3h得到菌体，再控制温度为0℃，转速为4000rpm离心20min，将菌体用蒸馏水洗涤，继续离心20min，控制温度70℃，采用50wt％乙醇提取菌体5h，得到的提取液经10000分子量的纳滤膜过滤、市售D001树脂脱色及无水乙醇结晶步骤，即得到13C海藻糖；
(2)将13C海藻糖放入硫酸中于100℃酸解6h，加入碳酸钡中和到pH为6.8后，离心，上清液经市售D001树脂脱色，最后经过浓缩、结晶，得到13C标记的葡萄糖。

Claims (1)

1.一种制备13C标记葡萄糖的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)以毕赤酵母作为出发菌株，13C甲醇作为碳源，经发酵、离心获得菌体，经乙醇溶液提取、脱色、结晶，获得13C标记的海藻糖；
(2)将13C标记的海藻糖酸解，然后，中和、脱色、结晶，获得13C标记的葡萄糖；
具体包括以下步骤：
(a)将毕赤酵母一环接入种子培养基中，115℃灭菌20min，再于28-37℃，控制转速为150-240rpm摇瓶培养16-24h，得到种子液，以10％V/V的接种量将种子液接入发酵培养基中，灭菌后用30％的浓氨水调节发酵培养基的pH至4.0-6.0，加入灭菌的甲醇和微量元素，控制温度为28-37℃，转速为150-240rpm摇瓶发酵24-48h，升温至40-50℃，维持0.5-4h得到菌体，再控制温度为-5～5℃，转速为4000rpm离心20min，将菌体用蒸馏水洗涤，继续离心20min，控制温度30-90℃，采用30-70wt％乙醇提取菌体0.5-5h，得到的提取液经10000分子量的纳滤膜过滤、市售D001树脂脱色及无水乙醇结晶步骤，即得到13C海藻糖；
(b)将13C海藻糖放入硫酸中于95-105℃酸解5-8h，加入碳酸钡中和到pH为6.8-7.0后，离心，上清液经市售D001树脂脱色，最后经过浓缩、结晶，得到13C标记的葡萄糖；
步骤(a)中的种子培养基以蒸馏水为溶液，包括以下组分及含量：13C甲醇，5-30mg/L，无氨基酸的酵母氮碱1-13.4g/L，生物素5-20mg/L，磷酸氢二钾0.10-3.24g/L；发酵培养基包括以下组分及含量：CaSO4·2H2O 0.05-0.93g/L，MgSO4·7H2O 1.5-14.9g/L，磷酸氢二钾1-53.4g/L；微量元素包括以下组分及含量：FeSO4·7H2O 65g/L，MnSO4·H2O 3g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO3 0.2g/L，CoCl2 0.5g/L，ZnCl220g/L，生物素0.2g/L，CuSO4·5H2O 6g/L，KI 0.8g/L，肌醇0.3g/L，烟酰胺0.8g/L，对氨基苯甲酸0.06g/L，维生素B10.8mg/L，维生素B20.02mg/L；发酵培养基、甲醇和微量元素的重量比为1000∶(5-30)∶(1-10)。
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