CN104328155B - 利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，它的步骤如下：（1）将氧化葡萄糖杆菌DSM 2003发酵，得到发酵液；（2）发酵液经高速离心，取上清液，经HP‑20型大孔树脂色谱柱进行富集，得到富含吡咯喹啉醌的洗脱流份；（3）将富含吡咯喹啉醌的洗脱流份减压浓缩，经聚酰胺柱色谱纯化，得到吡咯喹啉醌纯品。本发明提供的氧化葡萄糖杆菌菌株在常规培养基和培养条件下，PQQ产量可达125mg/L，而且利用上述生产制备方法，条件简单，过程快捷，便于大规模工业化生产，对促进PQQ的产业化有重要意义。

Description

利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种微生物菌株的应用，具体的说是利用氧化葡萄糖菌DSM 2003生产制备吡咯喹啉醌的工艺。
背景技术
吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinine，PQQ）是一种水溶性醌类化合物，是葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅酶，被认为是新的B族维生素（Nature 2003；422:832）。PQQ分子量为330，最早是在微生物中发现，随后研究表明其也存在于动植物体内。 PQQ作为多种重要酶类的辅基，参与呼吸链中的电子传递，并能调节体内自由基水平。具有重要的生理功能，已知PQQ与神经系统相关的功能有如下四种：(1)抗氧化，清除自由基；(2)影响呼吸链功能， 维护线粒体能量代谢；(3)刺激神经生长因子的分泌，修复和促进神经生长；(4)延缓α-synuclein蛋白的沉积，防止神经细胞纤维化。因此，有关研究人员认为 PQQ 对帕金森病和老年性痴呆等多种神经变性性疾病具有潜在的治疗价值。所以，寻找简单易行的获得PQQ的方法，进行产业化生产，对促进人类的身体健康具有重大的意义。
化学合成PQQ步骤多，产率低，异构体和副产品的去除需要多步纯化，并需用多种有毒试剂而污染环境（JACS，1981；103：5599-2600）。因此，一般认为生物学合成方法更具产业化意义。PQQ 广泛存在于革兰阴性菌中，但合成量却有所不同，有些菌只产生痕量 PQQ，供正常的生理代谢需求，如恶臭假单胞菌；还有些菌却能产生过量的 PQQ，并分泌到胞外。迄今发现的能产生过量 PQQ 的野生菌包括无色杆菌属（Achromobacter）、交替单胞菌属（Alteromonas）、弯杆菌属（Ancylobacter）、生丝微菌属（Hy-phomicrobium）、甲烷单胞菌属（Methanomonas）、甲基菌属（Methy-lobacillus）、甲基单胞菌属（Methylomonas）、嗜甲基菌属（Methy-lophilus）、 甲基杆菌属 （Methylobacterium）、 微环菌属（Microcy-clus）、枝动菌属（Mycoplana）、假单胞菌属（Pseudomonas）、精朊杆菌属 （Protaminobacter）、 原单胞菌属 （Protomonas）、 硫杆菌属（Thiobacillus）及黄色杆菌属（Xanthobacter）等。目前，也有采用微生物发酵的方法生产PQQ，使用的原始菌种PQQ产量在0.07-7mg/L，发酵时间为2-5天左右（US Pat49943）。根据文献调研，目前并没有发现简单易行的从微生物发酵液中获取PQQ的方法，而实现PQQ的工业规模生产。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种可能大规模工业化生产制备吡咯喹啉醌的方法。
本发明的技术方案是：利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，它的步骤如下：
（1）将氧化葡萄糖杆菌DSM 2003发酵，得到发酵液；
（2）发酵液经高速离心，取上清液，经HP-20型大孔树脂色谱柱进行富集，得到富含吡咯喹啉醌的洗脱流份；
（3）将富含吡咯喹啉醌的洗脱流份减压浓缩，经聚酰胺柱色谱纯化，得到吡咯喹啉醌纯品。
所述步骤（1）中将氧化葡萄糖杆菌发酵的操作如下：将氧化葡萄糖杆菌菌种按照5%的比例接入发酵培养基中，所述培养基每升含有45-55 g山梨醇、15-25 g酵母提取物、3-6 g (NH4)2SO4、3-5 g KH2PO4、4-6 g MgSO4·H2O，在28摄氏度下震荡培养3d。
所述步骤（2）中HP-20型大孔树脂色谱柱的条件是甲醇-水梯度洗脱，甲醇与水的体积比为0:1、1:9、7:34。
所述步骤（3）中聚酰胺柱色谱的条件是甲醇-水梯度洗脱，每100ml甲醇中含1ml氨水，甲醇与水的体积比为0:1、1:9。
氧化葡萄糖杆菌菌株在生产吡咯喹啉醌中的应用。
本发明提供的氧化葡萄糖杆菌菌株在常规培养基和培养条件下，PQQ产量可达125mg/L，而且利用上述生产制备方法，条件简单，过程快捷，便于大规模工业化生产，对促进PQQ的产业化有重要意义。
附图说明
图1 HP-20大孔树脂柱色谱富含PQQ流份HPLC检测，其中，A为对照品，B为样品；
图2 聚酰胺柱色谱各个流份TLC检测；
图3 产物的HPLC分析结果；
图4为PQQ产物的紫外光谱，其中，A为对照品，B为样品；
图5为PQQ产物的质谱。
具体实施方式
利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，它的步骤如下：
（1）氧化葡萄糖菌发酵培养
将菌种按照5%的比例接入发酵培养基（每升含有40 g山梨醇、20 g酵母提取物、5g (NH4)2SO4、2 g KH2PO4、5 g MgSO4·H2O）中，在28℃下震荡培养3d。发酵罐培养时按照10%接种，培养基浓度为正常2倍。将菌种接种至富集培养基，28℃下震荡培养5d，培养物5℃9000r/min离心15分钟，得到含有PQQ的上清液。
（2） PQQ的富集纯化
上清液上HP-20型大孔树脂色谱柱，用甲醇-水梯度洗脱（0%，10%，70%，v/v），每个梯度洗脱10个柱体积，经HPLC检测，发现70%洗脱部位富含PQQ，将其减压浓缩至无醇味。
（3） PQQ的富集纯化
得到上述富含PQQ浓缩液后，上聚酰胺色谱柱，甲醇-水梯度洗脱（95%， 0%，水含1%氢氧化钠），经TLC检测，得到目标产物PQQ。
（4）产物分析
①产物的HPLC检测，采用Waters Symmetry 300 C18反向色谱柱，以乙腈：水（乙腈和水均含2%甲酸）为流动相，流速1ml/min，梯度洗脱（30-90%，30min），检测波长254nm，可以得到较好的色谱分析结果。结果表明，产物为纯度达到99%以上的PQQ样品。
②产物氢谱数据，通过文献报道PQQ氢谱数据对比，结果表明，样品与其完全一致。

Claims (1)

1.利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，它的步骤如下：
（1）将氧化葡萄糖杆菌DSM 2003发酵，得到发酵液；
（2）发酵液经高速离心，取上清液，经HP-20型大孔树脂色谱柱进行富集，得到富含吡咯喹啉醌的洗脱流份；
（3）将富含吡咯喹啉醌的洗脱流份减压浓缩，经聚酰胺柱色谱纯化，得到吡咯喹啉醌纯品，
所述步骤（1）中将氧化葡萄糖杆菌发酵的操作如下：将氧化葡萄糖杆菌菌种按照5%的比例接入发酵培养基中，所述培养基每升含有45-55 g山梨醇、15-25 g酵母提取物、3-6 g(NH4)2SO4、3-5 g KH2PO4、4-6 g MgSO4·H2O，在28摄氏度下震荡培养3d，所述步骤（2）中HP-20型大孔树脂色谱柱的条件是甲醇-水梯度洗脱，甲醇与水的体积比为0:1、1:9、7:34，所述步骤（3）中聚酰胺柱色谱的条件是甲醇-水梯度洗脱，每100ml甲醇中含1ml氨水，甲醇与水的体积比为0:1、1:9，
上述步骤具体操作如下：
（1）氧化葡萄糖菌发酵培养
将菌种按照5%的比例接入发酵培养基中，每升发酵培养基含有40 g山梨醇、20 g酵母提取物、5 g (NH4)2SO4、2 g KH2PO4、5 g MgSO4·H2O，在28℃下震荡培养3d，发酵罐培养时按照10%接种，培养基浓度为正常2倍，将菌种接种至富集培养基，28℃下震荡培养5d，培养物5℃9000r/min离心15分钟，得到含有PQQ的上清液；
（2）PQQ的富集纯化
上清液上HP-20型大孔树脂色谱柱，用甲醇-水梯度洗脱，0%，10%，70%，v/v，每个梯度洗脱10个柱体积，经HPLC检测，发现70%洗脱部位富含PQQ，将其减压浓缩至无醇味；
（3）PQQ的富集纯化
得到上述富含PQQ浓缩液后，上聚酰胺色谱柱，甲醇-水梯度洗脱，95%，0%，水含1%氢氧化钠，经TLC检测，得到目标产物PQQ；
（4）产物分析
①产物的HPLC检测，采用Waters Symmetry 300 C18反向色谱柱，以乙腈：水为流动相，乙腈和水均含2%甲酸，流速1ml/min，梯度洗脱，30-90%，30min，检测波长254nm，可以得到较好的色谱分析结果，结果表明，产物为纯度达到99%以上的PQQ样品；
② 产物氢谱数据，通过文献报道PQQ氢谱数据对比，结果表明，样品与其完全一致。
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