CN104372040A

CN104372040A - 一种连续制备他汀药物中间体(r)-3-羟基戊二酸乙酯的方法

Info

Publication number: CN104372040A
Application number: CN201310348620.XA
Authority: CN
Inventors: 陈令伟
Original assignee: NANJING LANG'EN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING NUOYUN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2013-08-12
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2033-08-12
Also published as: CN104372040B

Abstract

本发明公开了一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，包括以下工艺步骤：第一步(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯（(S)-CHBE）在含有重组卤醇脱卤酶（HHDH）的催化下生成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，第二步(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯在重组腈水解酶（NIT）的催化下生成(R)-3-羟基戊二酸乙酯，所述的两个反应步骤均在反应罐中的水溶液中催化反应；本发明通过两步耦联生物催化反应，采用特定的卤醇脱卤酶和腈水解酶，连续催化制备他汀类药物的关键中间体，两步串联的连续绿色催化反应，无需提出中间体即可进行下一步反应，可连续操作、设备利用率高、成本低、简便易操作。

Description

一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法

技术领域

本发明涉及有机药物合成领域，具体涉及一种两步生物催化耦联制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法。

背景技术

他汀类药物已是世界上销量最大，疗效稳定的降脂类药物。其中最有代表性的是阿托伐他汀（Atorvastatin）和瑞舒伐他汀（Rosuvastatin），前者是世界上首款销售额突破百亿美金的药物，而后者则是迄今为止降脂效果最好的他汀类药物，又被成为“超级他汀”。瑞舒伐他汀由阿斯利康公司开发(英文商品名Crestor) ，于2002年11月首次在荷兰获批， 2003年8月通过美国FDA上市审批，2011年在全球销售额66.2亿美元。(R)-3-羟基戊二酸乙酯是合成瑞舒伐他汀的重要手性前体。

(R)-3-羟基-戊二酸乙酯主要是由潜手性底物3-羟基戊二酸二乙酯通过不同的酶的不对称水解得到，但是路径非常单一，而其他的化学合成路径则基本没有。而且，从已报道的结果来看，运用的基本上都是些代价较高的商品酶，如：α-胰凝乳蛋白酶和脂肪酶CALB等，目前反应的选择性最高的是脂肪酶CALB，催化所得的产物的ee值仅为91%，产率为80%(J Mol Catal B-Enzym，21:55-58；Tetrahedron lett.25：5235-5238)，不适合应用于(R)-3- 羟基戊二酸乙酯的产业化生产。中国专利101805756A报道了一种利用消旋的4-氰基-3羟基丁酸乙酯生产(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法。消旋体拆分后得到的目标产品只有50%的理论得率，意味着一半的底物被浪费，并不符合绿色化学的原则。

通过微生物腈水解酶细胞选择性催化水解4-氰基-3-羟基丁酸乙酯可以一步制备得到高光学纯度的(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物，该水解反应体系简单，条件温和，而且腈水解酶的立体选择性也非常高。然而，由于底物4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物都含有一个酯基，而一般含水解酶微生物细胞中都会含有水解酯基的酯酶或脂肪酶，所以该生物催化剂的筛选也是一大难题，至今也未见用在此反应中腈水解酶的相关报道。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明提供一种反应步骤简单、可连续操作、成本较低、减少了有机溶剂和剧毒品的使用量的他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的生产方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，包括以下工艺步骤：第一步(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯（(S)-CHBE）在含有重组卤醇脱卤酶（HHDH）的催化下生成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，第二步(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯在重组腈水解酶（NIT）的催化下生成(R)-3-羟基戊二酸乙酯，所述的两个反应步骤均在反应罐中的水溶液中催化反应；

在两个串联的反应体系中，利用卤醇脱卤酶和腈水解酶，分别在两个串联的反应体系中，通过两步催化反应，在水相反应中制备(R)-3-羟基戊二酸乙酯，过程中不需对中间产物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯提取纯化，减少反应提纯和分离的步骤，大大提高了反应的效率，节省了使用成本。

本发明所述的含有含有重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT基因的重组大肠杆菌单菌落和培养基均为市售购得，本发明所述的化学试剂均为市售购得。

本发明优选的制备装置包括反应罐1和反应罐2，反应罐中设有搅拌装置，反应罐1和反应罐2通过带有流量调节阀的管路相连接，反应罐1上设有底物添加管路，pH控制管路和重组卤醇脱卤酶添加管路，反应罐2上设有重组腈水解酶添加管路和产物出口管。

本发明优选的制备方法为：1）以(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯为底物加入含氰化钠水溶液的的反应罐1中，接着加入重组卤醇脱卤酶进行催化反应；重组卤醇脱卤酶的用量为底物质量的2％～15％(w/w)，氰化钠的用量为底物质量的5％～20％(w/w)；所述反应在pH为6.0～8.0 的水相中进行，反应体系的温度为40～55℃；当通过气相色谱法测得混合液体中的底物转化率大于95%时，开始通过添加管路流加底物(S)-CHBE和卤醇脱卤酶液，同时打开两个反应罐间的流量调节阀，保持反应罐1中的反应体积不变；

2）在反应罐2中起始加入腈水解酶缓冲液到最低搅拌叶处，调节反应温度至25～30℃，当从反应罐1中开始流出含中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的反应液时，同时以反应罐2中加入腈水解酶粗酶液；腈水解酶粗酶液的用量为底物质量的20% ～60%收集反应罐2产物出口管流出的反应液，调节反应液pH至2.0，硅藻土过滤除酶，等体积乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，无水硫酸钠除水，旋蒸，即得产品(R)-3-羟基戊二酸已酯。

本发明优选的从反应罐1流向反应罐2的速率为反应体系流加速率，所述反应罐1中底物流加速率、卤醇脱卤酶液、氰化钠溶液流加速率三者之和等于反应体系流加速率。

本发明优选的反应罐1中的氰化钠溶液通过磷酸调节反应体系的pH值；反应罐1中优选的pH为6.8～7.2，反应温度为48～50℃。

本发明优选的反应罐1中底物的流加速率为反应体系流加速率的1%～5%，卤醇脱卤酶液的流加速率为反应体系流加速率的5%～25%；反应罐2中腈水解酶粗酶液的流加速率为反应体系流加速率的0.5％～2％。

根据权利要求3所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述的卤醇脱卤酶液按粗酶液：去离子水=1：60的比例配制。

本发明优选的含有重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT的制备方法为：将的含有重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT基因的重组大肠杆菌单菌落分别接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用2～8倍体积的三乙醇胺缓冲液（2mM，pH7.0）悬浮细胞；细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟；℃下15000g离心30min，取上清液，得重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT的粗酶液。

本发明通过两步耦联生物催化反应，采用特定的卤醇脱卤酶和腈水解酶，连续催化制备他汀类药物的关键中间体，两步串联的连续绿色催化反应，无需提出中间体即可进行下一步反应，可连续操作、设备利用率高、成本低、简便易操作；解决了传统生物法中催化效率低以及成本高的问题。由于此反应体系通过流加补料技术，解决了第二步反应中存在的底物抑制和转化率低等问题。该反应体系无需添加有机溶剂、条件温和、反应效率高、特别是两步反应为串联的可连续操作的反应体系，提高了设备的利用率，节省物料提取溶剂和动力能源的消耗，有效地节省了成本，具有十分广阔的工业化生产前景。

附图说明

图1为本发明装置简图；

其中，1 底物添加管路，2 pH控制管路，3 重组卤醇脱卤酶添加管路，4 重组腈水解酶酶液添加管路，5 产物出口管，6 流量控制阀。

具体实施方式

下面结合附图说明具体实施方式对本发明作进一步详细的描述。

实施例1：如图1所示的，本发明的制备装置包括反应罐1和反应罐2，反应罐1和2中设有搅拌装置，反应罐1和反应罐2通过带有流量调节阀6的管路相连接，反应罐1上设有底物添加管路1，pH控制管路2和重组卤醇脱卤酶添加管路3，反应罐2上设有重组腈水解酶添加管4路和产物出口管。

实施例2：本发明重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT的制备方法的实际实施过程如下：

将市面上购得的含有重组卤醇脱卤酶和腈水解酶基因的重组大肠杆菌单菌落分别接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床200rpm振荡培养7小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床200rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到1.0时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，于28℃下继续培养20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用3倍体积的三乙醇胺缓冲液（2mM，pH7.0）悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟。4℃下15000g离心30min，上清液即得重组卤醇脱卤酶液。

实施例3：本发明连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法制备方法的实际实施过程如下：

在容积500ml的反应罐1中加入45g底物(S)-CHBE和5g pH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液，加去离子水230ml，开启搅拌，温度调整至50℃；在500ml反应罐2中，溢流口以下的体积为400ml，起始加入去离子水50ml和腈水解酶粗酶液5g到最低搅拌叶处，开启搅拌，调节反应温度至25℃。在反应罐1中加入5g卤醇脱卤酶粗酶液开始反应，反应过程中用30%的NaCN溶液控制体系的pH至7.0。6h后利用气相色谱方法（GC）检测底物转化率为97.3%，开始以8 g/h的速率流加底物(S)-CHBE，以41ml/h的速率流加卤醇脱卤酶液（按卤醇脱卤酶粗酶液：去离子水=1：60配制），同时，打开两个反应罐间的流量调节阀，使反应罐1中的反应液以50ml/h的速率流向反应罐2，7h后反应罐2中的反应液从溢流口流出，此时以4g/h的速率往反应罐2中补加腈水解酶粗酶液。36h后，反应罐1停止流加底物(S)-CHBE和卤醇脱卤酶液，待1中的反应液全部流加进2中后，2停止补加腈水解粗酶液，再过8h后，合并收集反应罐2中和流出的反应液约2L，用盐酸调节反应液pH至2.0，硅藻土过滤除酶，加2L乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，无水硫酸钠除水，旋蒸浓缩后得淡黄色油状物252.6g，即为(R)-3-羟基戊二酸乙酯，收率83.6%，GC纯度90.3%。

实施例4：本发明连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法制备方法的实际实施过程如下：

在容积1000ml的反应罐1中加入100g底物(S)-CHBE和10 g pH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液，加去离子水480ml，开启搅拌，温度调整至50℃；在1000ml反应罐2中，溢流口以下的体积为800ml，起始加入去离子水100ml和腈水解酶粗酶液10g到最低搅拌叶处，开启搅拌，调节反应温度至25℃。在反应罐1中加入10 g卤醇脱卤酶粗酶液开始反应，反应过程中用30%的NaCN溶液控制体系的pH至7.0。6h后利用气相色谱方法（GC）检测底物转化率为96.8%，开始以16 g/h的速率流加底物(S)-CHBE，以82ml/h的速率流加卤醇脱卤酶液（按卤醇脱卤酶粗酶液：去离子水=1：60配制），同时，打开两个反应罐间的流量调节阀，使反应罐1中的反应液以100ml/h的速率流向反应罐2，7h后反应罐2中的反应液从溢流口流出，此时以7g/h的速率往反应罐2中补加腈水解酶粗酶液。48h后，反应罐1停止流加底物(S)-CHBE和卤醇脱卤酶液，待1中的反应液全部流加进2中后，2停止补加腈水解粗酶液，再过8h后，合并收集反应罐2中和流出的反应液约5L，用盐酸调节反应液pH至2.0，硅藻土过滤除酶，加5L乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，无水硫酸钠除水，旋蒸浓缩后得淡黄色油状物648.2g，即为(R)-3-羟基戊二酸乙酯，收率79.3%，GC纯度88.7%。

需要说明的是，上述仅仅是本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的保护范围，在上述实施例的基础上所作出的等同变换均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：第一步(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯（(S)-CHBE）在含有重组卤醇脱卤酶（HHDH）的催化下生成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，第二步(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯在重组腈水解酶（NIT）的催化下生成(R)-3-羟基戊二酸乙酯，所述的两个反应步骤均在反应罐中的水溶液中催化反应。

2.根据权利要求1所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述的制备装置包括反应罐1和反应罐2，反应罐中设有搅拌装置，反应罐1和反应罐2通过带有流量调节阀的管路相连接，反应罐1上设有底物添加管路，pH控制管路和重组卤醇脱卤酶添加管路，反应罐2上设有重组腈水解酶添加管路和产物出口管。

3.根据权利要求1和2所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述的制备方法为：

1）以(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯为底物加入含氰化钠水溶液的的反应罐1中，接着加入重组卤醇脱卤酶进行催化反应；重组卤醇脱卤酶的用量为底物质量的2％～15％(w/w)，氰化钠的用量为底物质量的5％～20％(w/w)；所述反应在pH为6.0～8.0 的水相中进行，反应体系的温度为40～55℃；当通过气相色谱法测得混合液体中的底物转化率大于95%时，开始通过添加管路流加底物(S)-CHBE和卤醇脱卤酶液，同时打开两个反应罐间的流量调节阀，保持反应罐1中的反应体积不变；

2）在反应罐2中起始加入腈水解酶缓冲液到最低搅拌叶处，调节反应温度至25～30℃，当从反应罐1中开始流出含中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的反应液时，同时以反应罐2中加入腈水解酶粗酶液；腈水解酶粗酶液的用量为底物质量的20% ～60%；液收集反应罐2产物出口管流出的反应液，调节反应液pH至2.0，硅藻土过滤除酶，等体积乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，无水硫酸钠除水，旋蒸，即得产品(R)-3-羟基戊二酸已酯。

4.根据权利要求2和3所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述从反应罐1流向反应罐2的速率为反应体系流加速率，所述反应罐1中底物流加速率、卤醇脱卤酶液、氰化钠溶液流加速率三者之和等于反应体系流加速率。

5.根据权利要求3所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述反应罐1中的氰化钠溶液通过磷酸调节反应体系的pH值；反应罐1中优选的pH为6.8～7.2，反应温度为48～50℃。

6.根据权利要求3和4所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，反应罐1中底物的流加速率为反应体系流加速率的1%～5%，卤醇脱卤酶液的流加速率为反应体系流加速率的5%～25%；反应罐2中腈水解酶粗酶液的流加速率为反应体系流加速率的0.5％～2％。

7.根据权利要求3所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述的卤醇脱卤酶液按粗酶液：去离子水=1：60的比例配制。

8.根据权利要求3和所述的一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，所述的含有重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT的制备方法为：将含有重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT基因的重组大肠杆菌单菌落分别接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用2～8倍体积的三乙醇胺缓冲液（2mM，pH7.0）悬浮细胞；细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟；℃下15000g离心30min，取上清液，得重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT的粗酶液。