WO2011036072A1 - Verfahren zur umwandlung von 3-halogen-1,2-propandiol und seinen mono- und diesterderivaten zu 1,2,3-propantriol oder monoacylglyceriden durch enzymatische umsetzung - Google Patents

Verfahren zur umwandlung von 3-halogen-1,2-propandiol und seinen mono- und diesterderivaten zu 1,2,3-propantriol oder monoacylglyceriden durch enzymatische umsetzung Download PDF

Info

Publication number
WO2011036072A1
WO2011036072A1 PCT/EP2010/063468 EP2010063468W WO2011036072A1 WO 2011036072 A1 WO2011036072 A1 WO 2011036072A1 EP 2010063468 W EP2010063468 W EP 2010063468W WO 2011036072 A1 WO2011036072 A1 WO 2011036072A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mono
conversion
propanediol
halo
mcpd
Prior art date
Application number
PCT/EP2010/063468
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Uwe Bornscheuer
Martin Hesseler
Original Assignee
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ernst-Moritz-Arndt-Universität filed Critical Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Publication of WO2011036072A1 publication Critical patent/WO2011036072A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C12P7/20—Glycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6454—Glycerides by esterification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Definitions

  • 3-Halogen-l, 2-propanediols and their mono- and diesters, in particular ⁇ 3-monochloro-l, 2-propanediol (3-MCPD) and its esters with carboxylic acids are compounds which occur in foods as undesirable contaminants. Particularly affected are fats and oils.
  • 3-MCPD is a toxic compound that is harmful to the kidney, for example, as it can lead to changes, including tumor formation.
  • these compounds are produced in the production and processing of vegetable oils, for example by heat treatment of oilseeds and in refining (refining or refining), in particular in deodorization.
  • the harmful substances are also found in other foods such as bread, smoked meat products and baby food such as baby milk powder.
  • Due to the toxicity of the 3-halo-1, 2-propanediols and their derivatives, in particular of 3-MCPD and its derivatives is a removal of these substances especially desirable from a food law perspective.
  • complete hydrolysis of the esters is currently anticipated due to lack of data. The esters must therefore be treated in terms of their toxicity as the free 3-MCPD.
  • the esters of 3-MCPD are compounds which it is necessary to remove from food.
  • a disadvantage of the approaches described therein, however, is that it can also lead to an increase in the 3-MCPD concentration. It is also disadvantageous that these methods are very energy-intensive. There may be undesirable changes in the quality of the fats / oils treated. For example, isomerization, degradation or chemical changes of the fatty acids contained, as well as changes in the spectrum of antioxidants occur.
  • the object of the present invention was to provide a process for the elimination of 3-halo-l, 2-propanediols and their derivatives, which overcomes the above-mentioned disadvantages.
  • radical R is hydrogen or the radical of a
  • esterified fatty acid means, the rest R 'as well
  • the hydrophobic lipid system to a water ⁇ proportion between 0.1 and 10% (v / v), more preferably between 0.1 and 5% (v / v).
  • both enzymes are also active in the presence of vegetable oils in a very hydrophobic environment. Water must be present only in very small quantities.
  • the process for the conversion of 3-halo-l, 2-propanediol and its mono- and diester derivatives is therefore in particular ⁇ sondere characterized in that the reactions in a hydrophobic lipid system having a water content between 0.1 and 40% (v / v), more preferably between 0.1 and 10% (v / v), most preferably between 0.1 and 5% (v / v).
  • a hydrophobic lipid system having a water content between 0.1 and 40% (v / v), more preferably between 0.1 and 10% (v / v), most preferably between 0.1 and 5% (v / v).
  • lipid system which has a log p-value of at least 2, preferably of at least 4.
  • the lipid system comprises fatty acids, triacylglycerides (fats and oils) and the corresponding mono- and diacylglycerides, waxes, phospholipids, sphingolipids, lipopolysaccharides and isoprenoids (steroids, carotenoids etc.), in particular those lipids, as they occur in vegetable oils.
  • the lipid system comprises triacyl, mono- and diacylglycerides. This includes individual substances as well as mixtures of several substances.
  • 3-halo-1,2-propanediols and their derivatives include 3-halogeno-1,2-propanediols and their mono- and diester derivatives, but also the enantiomeric Halogen-2, 3-propanediols and their mono- and diester derivatives or 3-MCPD and its mono and diester derivatives and the enantiomeric 1-MCPD and its mono- and diester derivatives to understand.
  • 3-halo-l 2-propanediols and their derivatives or 3-MCPD and its derivatives
  • glycerol 1, 2, 3-propanetriol
  • the method allows the transfer of toxic 3-halo-l, 2-propanediols and ih ⁇ ren derivatives, in particular the conversion of 3-MCPD and its derivatives via enzymatic hydrolysis in the food technology harmless compound, glycerol or derivatives thereof.
  • the fatty acids contained in the esters are selected from the group of saturated or monounsaturated or polyunsaturated fatty acids. Preference is given to unbranched monocarboxylic acids having at least four carbon atoms. In principle, all fatty acids can be used, in the final products of which 3-halo-l, 2-propanediols or their mono- or diesters, in particular 3-MCPD and its esters, can be found.
  • the oleic acid is a prominent representative, which can be found for example in high amounts in palm oil and olive oil. Other representatives are linoleic acid,
  • Linolenic acid gamma-linolenic acid, conjugated linolenic acid eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, stearic acid and palmitic acid.
  • the fatty acids are selected from the total group of oleic acid, linoleic acid, stearic ⁇ acid, palmitic acid, butyric acid, caproic acid, Laurinkla- acid, myristic acid and margaric.
  • vegetable oils in particular oils from the group of palm oil, palm kernel oil, olive oil, rapeseed oil, sunflower oil, soybean oil, peanut oil, cottonseed oil and coconut oil are relevant.
  • hydrolytic dehalogenases are a topic that is treated unevenly in the literature.
  • the BRENDA database contains only haloalkane dehalogenases (EC 3.8.1.5).
  • Halohydrin (or synonym haloalcohol) dehalogenases are not mentioned there.
  • halohydrin (or haloalcohol) dehalogenases are most commonly used when the enzyme converts a vicinal haloalcohol into an epoxide.
  • Haloalkane dehalogenases are referred to when the enzyme converts the substrate, which is usually a haloalkane, directly into the alcohol.
  • halohydrin dehalogenases means that both halohydrin dehalogenases and haloalkane dehalogenases are included.
  • halohydrin (or Haloalkohol-) dehalogenase is USAGE ⁇ det when the enzyme is a vicinal halo alcohol an epoxide (HHD).
  • haloalkane dehalogenase denotes that the enzyme converts the substrate directly to the alcohol (HAD).
  • the dehalogenase is selected from the group of HheA from Arthrobacter sp. AD2, HheA from Corynebacterium sp. N-1074, HheB from Mycobacterium sp. GP1, HheC off
  • HHD halohydrin dehalogenase
  • the dehalogenase converts the 3-halo-l, 2-propanediols into the corresponding glycidol derivative (epoxide).
  • a second enzyme epoxide hydrolase
  • Scheme 1 shows the respective reactions for 3-halo-1,2-propanediols and for their monoesters.
  • glycerides glycerol or monoacylglycerides
  • wel ⁇ che are natural constituents of vegetable oils.
  • the microbial epoxide hydrolase is preferably ⁇ be selected from the group of epoxide hydrolase from Aspergillus niger and epoxide hydrolase from Agrobacterium EchA
  • radiobacter AD1 More preferred is the epoxide hydrolase EchA from Agrobacterium radiobacter AD1, most preferably the mutant F108A of EchA from Agrobacterium radiobacter AD1.
  • the addition of the microbial epoxide hydrolase can in principle take place simultaneously with the addition of the dehalogenase, which often does not lead to the desired degradation of the glycidol.
  • Halohydrin dehalogenase and a microbial epoxide hydrolase (mEH) is converted via the intermediate glycidol to glycerol.
  • 3-MCPD and glycidol could be converted via the intermediate glycidol to glycerol.
  • Fig. 1 shows the course of the reaction.
  • the HAD HheA from Arthrobacter sp. AD2 converts 3-MCPD to glycidol in a hydrolytic reaction.
  • Glycidol is a substrate of the mEH EchA from Agrobacterium radiobacter AD1, which degrades it to glycerol.
  • the mutant F108A of the EchA has an improved activity over
  • the addition of the mEH is therefore preferably carried out when, after the addition of the dehalogenase, no significant changes in the concentrations of glycidol and 3-halogeno-1,2-diol or its derivatives can be observed.
  • concentration is measured with Standardmessme ⁇ methods.
  • ⁇ that then performs the mEH in glycerin over ⁇ means dehalogenase is glycidol.
  • the course of the reaction is shown in Fig. 2. Both reactions proceed sequentially, but without the reaction mixture being purified after the first step.
  • the measured data which were determined by gas chromatography, are shown in Table 2.
  • the 3-MCPD concentration initially decreased almost linearly. After about 2.5 h, however, a decrease in the 3-MCPD concentration was barely measurable and the reaction stagnated at about 25% of the starting concentration, so that after 3 h the mEH was added. Half an hour after the addition of En ⁇ zyms the glycidol could no longer be detected. After 24 h there was no change in the concentrations. 3- MCPD was determined to be 2.5 mM, glycidol was not nachzu ⁇ point (data not shown in Fig .2). Checks the stability of 3-MCPD and glycidol did not provide Ad ⁇ chen for their auto-hydrolysis within 24 hours: If
  • Diester derivatives is marked accordingly in that if the two radicals R and R 'radicals esterified fatty acids ⁇ , which are identical or different, is additionally performed a reaction with a lipase
  • the lipase is added simultaneously with or before the addition of the dehalogenase.
  • haloalkane dehalogenase as a dehalogenase diester can also be converted directly into the glyceride.
  • a preferred embodiment of the process for the conversion of 3-halo-1,2-propanediol and its mono- and diester derivatives is correspondingly characterized in that when the radical R and the radical R 'are both radicals of an esterified fatty acid which is the same or are different, the conversion by enzymatic reaction with a HAD, without the addition of a microbial epoxide hydrolase occurs. The addition ei ⁇ ner lipase is then only optional.
  • R ' fatty acid radical haloalkane-OR'
  • lipase depends on the composition of the product and must be adjusted accordingly, the general selection encompassing all lipases that convert glycerides.
  • the lipase is selected from the group of CAL-B (lipase B from Candida antarctica);
  • CAL-A lipase A from Candida antarctica
  • RML Rhizomucor miehei lipase
  • TLL Lipase B from Thermomyces lanuginosus
  • Amano PS lipase from Burkholderia cepacia
  • Amano G lipase from Penicillium camembertii, Lipase G Amano 50
  • Amano R lipase from Penicillium roquefortii
  • Newlase F Rhizopus niveus lipase
  • Amano AYS lipase from Candida rugosa, formerly C. cylindracea
  • Amano AS lipase from Aspergillus niger
  • Amano F-AP15 Rhizopus oryzae lipase
  • Amano AK lipase from Pseudomonas fluorescens
  • Lipase from Pseudomonas aeruginosa Preference is given to the use of a lipase from the group of CAL-A (lipase A from Candida antarctica) and lipase G Amano 50 (lipase from Penicillium camembertii).
  • 3-MCPD more precisely its fatty acid ester
  • triglycerides and partial glycerides are also present in the reaction mixture in the process for removing 3-MCPD from the reaction mixture.
  • the fatty acid ester is already fully hydrolyzed.
  • Reac ⁇ tion mixtures with different ratios of aqueous phase and oil phase were prepared and these analyzed for degradation of 3-MCPD.
  • 3-MCPD itself is very polar and so ⁇ to find with mainly in the aqueous phase.
  • the glycidol concentration was determined to be 6.3 mM (50% (v / v)), 7.2 mM (20% (v / v)) and 7.7 mM (5% (v / v), respectively) Dehalogenase active in an oil / water ⁇ mixture.
  • EchA was added to the three measured approaches. After more than one hour only a small amount (0.7 mM) of glycidol could be measured at 50% (v / v) water content. With a water content of 20 and 5% (v / v) no more glycidol could be detected. Consequently, the epoxide hydrolase is also active in an oil / water mixture.
  • 3-MCPD is primarily not free as a contamination of oils, but as a fatty acid monoester. For this reason, the (in the oil phase) 3-MCPD-l-monolanoic acid ester in the 2-phase system was first selectively cleaved by a lipase and then 3-MCPD (in the aqueous phase) converted to glycerol.
  • Oil phase of 1: 1 measured. Upon successful implementation was measured at 20% (v / v) aqueous phase and finally at 5% (v / v). With CAL-A it was possible to detect 3-MCPD in the aqueous phase at both 50, 20 and 5% (v / v) aqueous phase. However, it was also possible to measure 3-MCPD in the aqueous phase during the control of the autohydrolysis of the 3-MCPD ester. The control was carried out at a volume ratio of aqueous phase to oil phase of 1: 1.
  • Fig. 1 The figure shows the degradation of 3-MCPD with the
  • Fig. 2 Shown is the degradation of 3-MCPD with HheA and
  • EchA The reaction was initially started only with HheA. EchA was added after 3 hours. Examples
  • Glycidol and 3-MCPD were purchased as a racemate from Sigma Aldrich. HEPES was also bought by Sigma Aldrich. The HHD HheA from Arthrobacter sp. AD2 is available from Codexis. The enzyme is present in a 50% glycerol solution. The protein content was determined to be 10 mg / ml using the Bradford assay. The epoxide hydrolase EchA F108A off
  • Agrobacterium radiobacter AD1 is also available from Codexis.
  • the enzyme is available as lyophilisate and has a protein content of 790 ⁇ g / mg. Prior to their use in biocatalysis the enzymes EchA F108A and HheA three times in the centrifuge tube was added (Amicon Ultra, Millipore, Aus gleichli ⁇ with: 10 kDa) washed to remove glycerol and possibly interfering ions.
  • the wash buffer used was HEPES buffer (50 mM, pH 8, 4 ° C). For conversion into 2-phase systems, a commercially available edible oil was used.
  • reaction solution was centrifuged briefly with a benchtop centrifuge to remove any accessiblefal ⁇ lenes protein.
  • the centrifugate was injected into the gas chromatograph (GC) using a Hamilton pipette (0.4 ⁇ ).
  • the GC used was a Hewlett Packard 5890 Series II (column: nitroterephthalic acid derivatized PEG 30 mx 0.25 mm, temperature program: 5 min 180 ° C, 10 ° C / min to 220 ° C).
  • volume ratio aqueous phase: oil phase 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95: 5.
  • HEPES 50 mM, pH 8 again served as buffer for the aqueous phase.
  • the concentration of 3-MCPD was 10 mM in all cases, only the volume of the aqueous phase being taken into account for the calculation, since it can be assumed that 3-MCPD is present exclusively in the aqueous phase.
  • Reactions were incubated at 30 ° C in ei ⁇ nem Thermomixer. The sampling took place from the aqueous phase as already described.
  • volume ratio aqueous phase: oil phase 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95: 5.
  • HEPES 50 mM, pH 8 again served as buffer for the aqueous phase.
  • concentration of the 3-MCPD-oleic acid ester was 50 mM in all batches. In this case, this concentration refers to the volume of the oil phase since the 3-MCPD ester is virtually insoluble in the aqueous phase.
  • the reaction mixtures were incubated at 30 ° C in a Thermo ⁇ mixer. The sampling took place from the aqueous phase as already described.
  • the 3-MCPD ester in a concentration of 50 mM was added and incubated as the other approaches.
  • 3-MCPD (1.1 g) and oleic acid (3.02 g) are dissolved in 30 ml of MTBE, about 5 g of activated molecular sieve (for Wasserentfer ⁇ tion) was added and the reaction by adding 300 mg of lipase B from Candida antarctica ( CAL-B, Novozymes, Denmark ).
  • the reaction mixture is stirred at 37 ° C overnight under vacuum and nitrogen atmosphere and stopped after thin-layer control of the conversion by filtration through a suction filter.
  • the precipitate is washed with MTBE, the filtrate concentrated on a rotary evaporator and the clean product obtained in a quantitative yield (4.1 g).
  • the identity was confirmed by NMR spectroscopy and GC-MS.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono-und Diesterderivaten durch enzymatische Umsetzung mit einer Dehalogenase und anschließende enzymatische Umsetzung mit einer mikrobiellen Epoxid-Hydrolase, wobei die Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v) erfolgen.

Description

Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten zu 1 , 2 , 3-Propantriol oder Monoacylglyceriden durch enzymatische Umsetzung
3-Halogen-l , 2-propandiole und deren Mono- und Diester, ins¬ besondere 3-Monochlor-l , 2-propandiol (3-MCPD) und dessen Ester mit Carbonsäuren sind Verbindungen, welche in Lebensmitteln als unerwünschte Kontaminationen auftreten. Besonders betroffen sind davon Fette und Öle. Speziell 3-MCPD ist eine toxische Verbindung, die beispielsweise für die Niere schädlich ist, da es dort zu Veränderungen bis hin zur Tumorbildung führen kann.
Die Entfernung dieser Substanzen, vorrangig des 3-MCPD, aus Lebensmitteln ist somit zwingend notwendig, was aktuell Ge¬ genstand analytischer und toxikologischer Untersuchungen ist .
Nach derzeitigem Stand entstehen diese Verbindungen bei der Herstellung und Prozessierung von Pflanzenölen, beispielsweise durch Hitzebehandlung von Ölsaaten und in der Raffination (Raffinieren oder Raffinierung) , dort insbesondere bei der Desodorierung .
Neben dem Auftreten in Fetten und Ölen finden sich die schädlichen Substanzen auch in weiteren Lebensmitteln wie Brot, geräucherten Fleischwaren und in Säuglingsnahrung wie Säuglingsmilchpulver. Aufgrund der Toxizität der 3-Halogen- 1 , 2-propandiole und deren Derivaten, insbesondere von 3- MCPD und seinen Derivaten ist eine Entfernung dieser Stoffe vor allem aus lebensmittelrechtlicher Sicht wünschenswert. Bei der Bewertung der Toxizität der 3-MCPD-Ester geht man zur Zeit aufgrund von fehlenden Daten von einer vollständigen Hydrolyse der Ester aus. Die Ester müssen also in Bezug auf ihre Toxizität wie das freie 3-MCPD behandelt werden. Somit sind auch die Ester des 3-MCPD Verbindungen, welche es aus Lebensmitteln zu entfernen gilt.
Verfahrenstechnische Ansätze zur Reduzierung des Gehalts an 3-MCPD finden sich in den Schriften von Zelinkova, S. et al., Food Addit. Contam. 2006, Vol. 23, 1290-1298; Hamlet G. et al., Food Addit. Contam. 2002, Vol. 19, 619-631; See¬ felder W., Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo Risk Assess. 2008, Vol. 25, 391-400.
Nachteilig bei den dort beschriebenen Ansätzen ist allerdings, dass es auch zu einer Erhöhung der 3-MCPD-Konzentra- tion kommen kann. Ebenso ist es von Nachteil, dass diese Verfahren sehr energieintensiv sind. Es kann zu unerwünschten Veränderungen in der Qualität der behandelten Fette/Öle kommen. Beispielsweise können Isomerisierungen, Abbau bzw. chemische Veränderungen der enthaltenen Fettsäuren, sowie Änderungen im Spektrum der Antioxidantien auftreten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Eliminierung von 3-Halogen-l , 2-propandiolen und deren Derivaten bereitzustellen, welches die oben genannten Nachteile überwindet.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 gelöst. In anderen Worten ist die Lösung der Aufgabe ein Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2- propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten der allge¬ meinen Formel I,
Figure imgf000004_0001
Formel I worin der Rest R Wasserstoff oder den Rest einer
veresterten Fettsäure bedeutet, der Rest R' ebenfalls
Wasserstoff oder den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, wobei die Reste R und R' gleich oder verschieden sind und X ein Halogenatom, vorzugsweise ein Chloratom, ist,
zu 1 , 2 , 3-Propantriol oder Monoacylglyceriden,
welches gekennzeichnet ist durch enzymatische Umsetzung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diester¬ derivaten der allgemeinen Formel I mit einer Dehalogenase und anschließende enzymatische Umsetzung mit einer
mikrobiellen Epoxid-Hydrolase, wobei die Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v) erfolgen.
Beide Umsetzungen finden in demselben hydrophoben Lipidsystem statt, ohne dass eine Aufreinigung oder eine Veränderung des hydrophoben Lipidsystems erforderlich ist. Dies heißt auch, dass das Verhältnis Lipid/Wasser unver¬ ändert bleibt. Es handelt sich quasi um eine Eintopfreak- tion . Vorzugsweise weist das hydrophobe Lipidsystem einen Wasser¬ anteil zwischen 0.1 und 10% (v/v), besonders bevorzugt zwischen 0.1 und 5% (v/v) auf.
Im Gegensatz zu einigen anderen Enzymen wie Lipasen, welche in Ölen meist sehr aktiv und stabil sind, entfalten Dehalo- genasen und mikrobielle Epoxid-Hydrolasen ihre Wirkung so gut wie ausschließlich nur in wässrigen Systemen.
Überraschenderweise konnte aber gezeigt werden, dass bei der enzymatischen Umwandlung von 3-Halogen-l , 2 , -propan- diolen und ihren Derivaten, insbesondere bei der Umwandlung von 3-Monochlor-l , 2-propandiol und seinen Derivaten, sowohl die Dehalogenase als auch die mikrobielle Epoxid-Hydrolase ihre Wirkung auch in einem Lipidsystem entfaltet, d.h.
beide Enzyme auch in Gegenwart von Pflanzenölen in einer sehr hydrophoben Umgebung aktiv sind. Wasser muss dabei nur in sehr geringen Mengen zugegen sein.
Das Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten, ist also insbe¬ sondere dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v), mehr bevorzugt zwischen 0.1 und 10% (v/v), höchst bevorzugt zwischen 0.1 und 5% (v/v) erfolgen. Unter einem hydrophoben Lipidsystem ist ein
Lipidsystem zu verstehen, welches einen log p-Wert von mindestens 2, vorzugsweise von mindestens 4 aufweist.
Das Lipidsystem umfasst Fettsäuren, Triacylglyceride (Fette und Öle) sowie die entsprechenden Mono- und Diacyl- glyceride, Wachse, Phospholipide, Sphingolipide, Lipo- polysaccharide und Isoprenoide (Steroide, Carotinoide etc.), insbesondere solche Lipide, wie sie in Pflanzenölen vorkommen. Vorzugsweise umfasst das Lipidsystem Triacyl-, Mono- und Diacylglyceride . Umfasst sind dabei einzelne Substanzen sowie Mischungen aus mehreren Substanzen.
Unter „3-Halogen-l , 2-propandiolen und ihren Derivaten" bzw. „3-MCPD und seinen Derivaten" sind im nachfolgenden 3- Halogen-1 , 2-propandiole und ihre Mono- und Diesterderivate, aber auch die enantiomeren l-Halogen-2 , 3-propandiole und ihre Mono- und Diesterderivate bzw. 3-MCPD und seine Mono- und Diesterderivate sowie das enantiomere 1-MCPD und seine Mono- und Diesterderivate zu verstehen.
Im Gegensatz zu 3-Halogen-l , 2-propandiolen und ihren Derivaten bzw. 3-MCPD und seinen Derivaten ist 1 , 2 , 3-Propan- triol (Glycerin) , welches das Endprodukt des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens darstellt, eine nicht toxische, in Lebens¬ mittel zugelassene Substanz. Das Verfahren ermöglicht also die Überführung toxischer 3-Halogen-l , 2-propandiole und ih¬ ren Derivaten, insbesondere die Überführung von 3-MCPD und seinen Derivaten mittels enzymatischer Hydrolyse in die lebensmitteltechnisch unbedenkliche Verbindung Glycerin bzw. deren Derivate.
Hinsichtlich der Mono- und Diesterderivate der 1-Halogen- 2 , 3-propandiole war es besonders überraschend, dass diese mit diesem Verfahren umgesetzt werden können. Hierbei wurde festgestellt, dass die Umsetzung an der Grenzfläche zwi¬ schen Öl und Wasser stattfindet/stattfinden muss. Eine derartige Grenzflächenaktivität wurde bisher nur für Lipasen beschrieben. Bei diesen beruht die Grenzflächenaktivität strukturell auf einem „Deckel", der sich in Gegenwart einer Grenzfläche öffnet und so die hohe Aktivität der Lipase be- wirkt. Ein solches strukturelles Merkmal existiert weder bei Dehalogenasen noch bei mikrobiellen Epoxid-Hydrolasen, weshalb deren Grenzflächenaktivität überraschend war. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist entsprechend dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Reste R oder R' den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, d.h. dass Mono- und Diesterderivate bevorzugte Edukte für das vorliegende Verfahren sind.
Die in den Estern enthaltenen Fettsäuren sind ausgewählt aus der Gruppe der gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Bevorzugt sind unverzweigte Mono- carbonsäuren mit mindestens vier Kohlenstoffatomen . Einsetzbar sind grundsätzlich alle Fettsäuren, in deren finalen Produkten 3-Halogen-l , 2-propandiole bzw. deren Mono- oder Diester, insbesondere 3-MCPD und dessen Ester, zu finden sind. Die Ölsäure ist ein prominenter Vertreter, der beispielsweise in hohen Mengen im Palmöl und Olivenöl zu finden ist. Weitere Vertreter sind die Linolsäure,
Linolensäure, gamma-Linolensäure, konjugierte Linolensäure Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure, Stearinsäure und Palmitinsäure. Vorzugsweise werden die Fettsäuren insgesamt ausgewählt aus der Gruppe von Ölsäure, Linolsäure, Stearin¬ säure, Palmitinsäure, Buttersäure, Capronsäure, Laurinsäu- re, Myristinsäure und Margarinsäure. Als Pflanzenöle sind insbesondere Öle aus der Gruppe von Palmöl, Palmkernöl, Olivenöl, Rapsöl, Sonnenblumenöl, Soj abohnenöl , Erdnußöl, Baumwollsaatenöl und Kokosnußöl relevant.
Die Nomenklatur der hydrolytischen Dehalogenasen ist ein Thema, welches in der Literatur uneinheitlich behandelt wird. In der BRENDA-Datenbank findet man beispielsweise ausschließlich Haloalkan-Dehalogenasen (E.C. 3.8.1.5). Halohydrin- (oder synonym Haloalkohol- ) Dehalogenasen werden dort nicht genannt. In Publikationen wird meist von Halohydrin- (bzw. Haloalkohol- ) Dehalogenasen gesprochen, wenn das Enzym einen vicinalen Haloalkohol zu einem Epoxid umsetzt. Von Haloalkan-Dehalogenasen ist die Rede, wenn das Enzym das Substrat, welches für gewöhnlich ein Haloalkan ist, direkt zum Alkohol umsetzt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „Dehalogenasen", dass sowohl Halohydrin-Dehalogenasen als auch Haloalkan-Dehalogenasen umfasst sind. Der Begriff „Halohydrin- (bzw. Haloalkohol-) Dehalogenase" wird verwen¬ det, wenn das Enzym einen vicinalen Haloalkohol zu einem Epoxid umsetzt (HHD) . Der Begriff „Haloalkan-Dehalogenase" bezeichnet, dass das Enzym das Substrat direkt zum Alkohol umsetzt (HAD) .
Vorzugsweise ist die Dehalogenase ausgewählt aus der Gruppe von HheA aus Arthrobacter sp . AD2, HheA aus Corynebacterium sp . N-1074, HheB aus Mycobacterium sp . GP1, HheC aus
Agrobacterium radiobacter AD1 und Dehalogenase B aus
Agrobacterium tumefaciens HK7. Besonders bevorzugt ist die Halohydrin-Dehalogenase (HHD) HheA aus Arthrobacter sp . AD2.
Die Dehalogenase überführt die 3-Halogen-l , 2-propandiole in das entsprechende Glycidolderivat (Epoxid) . Anschließend wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein zweites Enzym (Epoxid-Hydrolase) zugesetzt, welches hydrolytisch das Glycidolderivat in ein Glycerinderivat überführt. In Schema 1 sind die jeweiligen Reaktionen für 3-Halogen-l , 2-propandiole und für deren Monoester dargestellt. mikrobielle
Figure imgf000009_0001
Formel I
R= Fettsäurerest
R'= H
Figure imgf000009_0002
Schema 1
Beide Reaktionen (Umsetzung mit Dehalogenase und mit mikro- bieller Epoxid-Hydrolase) laufen ab, ohne dass das Reakti¬ onsgemisch nach dem ersten Schritt aufgereinigt werden muss .
Insbesondere freies 3-MCPD wird so schnell und einfach in Glycerin überführt. Monoesterderivate können mittels Zusatz einer Lipase optional gespalten werden, d.h., dass wenn einer der Reste R oder Rest R' ein Rest einer veresterten Fettsäure ist, in einer bevorzugten Ausführungsform
zusätzlich eine Umsetzung mit einer Lipase erfolgt. Die Zugabe der Lipase erfolgt zeitgleich mit oder vor dem
Zusatz der Dehalogenase.
Insgesamt werden 3-Halogen-l , 2-propandiolderivate mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens in die korrespondierenden Glyceride (Glycerin bzw. Monoacylglyceride) überführt, wel¬ che natürliche Bestandteile von Pflanzenölen sind. Die mikrobielle Epoxid-Hydrolase ist vorzugsweise ausge¬ wählt aus der Gruppe von Epoxid-Hydrolase aus Aspergillus niger und Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium
radiobacter AD1. Stärker bevorzugt ist die Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1, besonders bevorzugt die Mutante F108A der EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1.
Die Zugabe der mikrobiellen Epoxid-Hydrolase kann prinzipiell gleichzeitig mit der Zugabe der Dehalogenase erfolgen, wobei dies oft nicht zum gewünschten Abbau des Glycidols führt .
Im wässrigen System konnte zunächst gezeigt werden, dass 3- MCPD in Anwesenheit einer Dehalogenase (hier eine
Halohydrin-Dehalogenase) und einer mikrobiellen Epoxid- Hydrolase (mEH) über die Zwischenstufe Glycidol zu Glycerin umgesetzt wird. 3-MCPD und Glycidol konnten
gaschromatographisch nachgewiesen werden. Über einen inneren Standard, Dimethylsulfoxid (DMSO) , wurde die Reaktion quantifiziert. Die Abb. 1 zeigt den Verlauf der Reaktion. Die HAD HheA aus Arthrobacter sp . AD2 setzt in einer hydrolytischen Reaktion 3-MCPD zu Glycidol um. Glycidol wiederum ist ein Substrat der mEH EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1, welche dieses zu Glycerin abbaut. Die Mutante F108A der EchA besitzt eine verbesserte Aktivität gegenüber
Glycidol und wurde bei den hier beschriebenen Experimenten verwendet. Beide Enzyme wurden zu Beginn der Reaktion zuge¬ geben .
Trotz Zugabe von mEH war keine Verminderung der Konzentration an Glycidol zu verzeichnen (vgl. Abb. 1) . Auch nach 24 h war kaum eine Veränderung zu erkennen. Nach 450 min be- trug die Konzentration von 3-MCPD 2,5 mM und die von
Glycidol 7,8 mM. Die Messdaten, welche mittels Gaschroma¬ tographie ermittelt wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Figure imgf000011_0001
Aus diesem Grund wurde der Abbau von 3-MCPD zu Glycerin in zwei Schritte aufgeteilt.
Vorzugsweise erfolgt die Beigabe der mEH daher dann, wenn nach Zusatz der Dehalogenase keine signifikanten Änderungen in den Konzentrationen von Glydidol und 3-Halogen-l , 2- prodandiol, bzw. dessen Derivaten mehr beobachtet werden kann. Die Konzentrationsmessung erfolgt mit Standardmessme¬ thoden. Zunächst wird mittels Dehalogenase Glycidol er¬ zeugt, dass anschließend durch die mEH in Glycerin über¬ führt wird. Der Reaktionsverlauf ist in Abb. 2 abgebildet. Beide Reaktionen laufen sequentiell ab, ohne dass jedoch das Reaktionsgemisch nach dem ersten Schritt aufgereinigt wird . Die Messdaten, welche mittels Gaschromatographie ermittelt wurden, sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Figure imgf000012_0001
Die 3-MCPD-Konzentration nahm zunächst annähernd linear ab. Nach ca. 2,5 h ließ sich jedoch kaum noch eine Abnahme der 3-MCPD-Konzentration messen und die Reaktion stagnierte bei etwa 25 % der Ausgangskonzentration, sodass nach 3 h die mEH zugesetzt wurde. Eine halbe Stunde nach Zugabe des En¬ zyms ließ sich das Glycidol nicht mehr nachweisen. Nach 24 h zeigte sich keine Veränderung in den Konzentrationen. 3- MCPD wurde zu 2,5 mM bestimmt, Glycidol war nicht nachzu¬ weisen (Daten in Abb .2 nicht aufgeführt) . Kontrollen zur Stabilität von 3-MCPD und Glycidol lieferten keine Anzei¬ chen für deren Autohydrolyse innerhalb von 24 h: Bei
Glycidol wurde eine Abweichung von weniger als 1% gemessen, bei 3-MCPD θΠ 6"6 · Da die Standardabweichung jedoch in beiden Fällen höher bestimmt wurde (Glycidol 3,5% bzw. 3-MCPD 7,4 %) , kann man davon ausgehen, dass die Substanzen unter den Reaktionsbedingungen stabil sind. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden 3- Halogen-1 , 2-propandiolderivate über das entsprechende
Glycidolderivat in die korrespondierenden Glyceride über¬ führt, welche natürliche Bestandteile von Pflanzenölen sind. Ergänzend für die Umsetzung der Diester bei Verwendung einer Halohydrin-Dehalogenase ist allerdings der Zu¬ satz einer Lipase erforderlich, welche die Ester in die entsprechende (n) Fettsäure (n) und die 3-Halogen-l , 2- propandiol-Verbindung spaltet. Der Reaktionsverlauf für Diesterderivate ist in Schema 2 dargestellt. Eine bevorzug¬ te Ausführungsform des Verfahrens zur Umwandlung von 3- Halogen-1 , 2-propandiol und seinen Mono- und
Diesterderivaten ist entsprechend dadurch gekennzeichnet, dass wenn beide Reste R und Rest R' Reste veresterter Fett¬ säuren sind, wobei diese gleich oder verschieden sind, zusätzlich eine Umsetzung mit einer Lipase erfolgt
(Esterspaltung) . Die Zugabe der Lipase erfolgt zeitgleich mit oder vor dem Zusatz der Dehalogenase .
Zu bemerken ist dabei, dass bei Verwendung einer Haloalkan- Dehalogenase (HAD) als Dehalogenase Diester auch direkt in das Glycerid überführt werden können. Eine bevorzugte Aus¬ führungsform des Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen- 1 , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten ist entsprechend dadurch gekennzeichnet, dass wenn der Rest R und der Rest R' beide Reste einer veresterten Fettsäure sind, welche gleich oder verschieden sind, die Umwandlung durch enzymatische Umsetzung mit einer HAD, ohne Zusatz einer mikrobiellen Epoxid-Hydrolase, erfolgt. Der Zusatz ei¬ ner Lipase ist dann nur optional. mikrobielle
Figure imgf000014_0001
s ureres
R'= Fettsäurerest Haloalkan- OR'
Dehalogenase
RO.
Schema 2
Die Wahl der Lipase hängt von der Zusammensetzung des Produktes ab und muss dementsprechend angepasst werden, wobei die generelle Auswahl alle Lipasen umfasst, die Glyceride umsetzen. Vorzugsweise wird die Lipase ausgewählt aus der Gruppe von CAL-B (Lipase B aus Candida antarctica) ;
CAL-A (Lipase A aus Candida antarctica) ;
RML (Lipase aus Rhizomucor miehei) ;
TLL (Lipase B aus Thermomyces lanuginosus) ;
Amano PS (Lipase aus Burkholderia cepacia) ;
Amano G (Lipase aus Penicillium camembertii, Lipase G Amano 50) ;
Lipase aus Geotrichum candidum;
Amano R (Lipase aus Penicillium roquefortii) ;
Newlase F (Lipase aus Rhizopus niveus) ;
Amano AYS (Lipase aus Candida rugosa, ehemals C. cylindra- cea) ;
Amano AS (Lipase aus Aspergillus niger) ;
Amano F-AP15 (Lipase aus Rhizopus oryzae) ;
Amano AK (Lipase aus Pseudomonas fluorescens) und
Lipase aus Pseudomonas aeruginosa. Bevorzugt ist die Verwendung einer Lipase aus der Gruppe von CAL-A (Lipase A aus Candida antarctica) und Lipase G Amano 50 (Lipase aus Penicillium camembertii) .
Nachfolgend wird exemplarisch die Umsetzung von 3-MCPD in einem hydrophoben Lipidsystem beschrieben (2-Phasensystem aus wässriger Phase und Ölphase) .
Da 3-MCPD, genauer gesagt dessen Fettsäureester, bei der Produktion von u.a. Ölen entstehen, wurde davon ausgegangen, dass auch im Prozess zur Entfernung von 3-MCPD aus dem Reaktionsgemisch nicht unerhebliche Mengen an Triglyceriden und partiellen Glyceriden im Reaktionsgemisch enthalten sind. Es wurde weiterhin davon ausgegangen, dass der Fettsäureester bereits vollständig hydrolysiert vorliegt. Reak¬ tionsmischungen mit verschiedenen Verhältnissen von wässriger Phase und Ölphase wurden erstellt und diese auf Abbau des 3-MCPD untersucht. 3-MCPD selbst ist sehr polar und so¬ mit hauptsächlich in der wässrigen Phase zu finden.
Es wurden Reaktionen mit folgenden Anteilen (Volumenprozent) der wässrigen Phase erstellt: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 95% (v/v) . Nach 20 h wurde zunächst der Ansatz mit 50% (v/v) gemessen. Die Konzentration lag bei 26 % (2,6 mM) der Ausgangskonzentration des 3-MCPD. Bei einem Wasseranteil von 20 % (v/v) setzte die HheA ebenfalls 3- MCPD um, und zwar bis auf einen Rest von 14 % (1,4 mM) . Bei einem Wasseranteil von 5 % (v/v) ließ sich gar kein 3-MCPD mehr nachweisen. Die Glycidolkonzentration wurde zu 6,3 mM (50 % (v/v)), 7,2 mM (20 % (v/v)) bzw. 7,7 mM (5 % (v/v) bestimmt. Folglich ist die Dehalogenase in einem Öl/Wasser¬ gemisch aktiv. Um zu überprüfen, ob auch die EH unter diesen Bedingungen aktiv war, wurde EchA zu den drei gemessenen Ansätzen hinzugegeben. Nach mehr als einer Stunde ließ sich nur bei 50 % (v/v) Wasseranteil noch eine geringe Menge (0,7 mM) an Glycidol messen. Bei einem Wasseranteil von 20 und 5 % (v/v) konnte kein Glycidol mehr nachgewiesen werden. Folglich ist auch die Epoxidhydrolase in einem Öl/Wassergemisch aktiv .
Ergänzend wurde ebenfalls ein 3-MCPD-l-Monoölsäureester in einem hydrophoben Lipidsystem untersucht (2-Phasensystem aus wässriger Phase und Ölphase) .
3-MCPD liegt als Kontamination von Ölen in erster Linie nicht frei, sondern als Fettsäuremonoester vor. Aus diesem Grund wurde der (in der Ölphase befindliche) 3-MCPD-l- Monoölsäureester im 2-Phasensystem zunächst durch eine Li- pase selektiv gespalten und anschließend 3-MCPD (in der wässrigen Phase) zu Glycerin umgesetzt.
Dafür wurden wie bei der Umsetzung von 3-MCPD im 2-Phasensystem verschiedene Volumenverhältnisse von wässriger Phase und Ölphase erstellt und in diesem Fall der 3-MCPD-Ester und eine Lipase (Candida Antarctica Lipase A (CAL-A ) bzw. Lipase G Amano 50) zugegeben. Die Konzentration des 3-MCPD- Esters in der Ölphase betrug jeweils 50 mM. Nach 20 h wurde die wässrige Phase auf 3-MCPD untersucht.
Die Vorgehensweise bei der Messung entsprach der bei der Umsetzung von 3-MCPD im 2-Phasensystem. Zunächst wurde der Ansatz mit einem Volumenverhältnis wässrige Phase zu
Ölphase von 1:1 gemessen. Bei erfolgreicher Umsetzung wurde bei 20 % (v/v) wässrige Phase und schließlich bei 5 % (v/v) gemessen. Mit CAL-A konnte sowohl bei 50, 20 als auch bei 5 % (v/v) wässrige Phase 3-MCPD in der wässrigen Phase nachgewiesen werden. Allerdings konnte auch bei der Kontrolle zur Autohydrolyse des 3-MCPD-Esters 3-MCPD in der wässrigen Phase gemessen werden. Die Kontrolle wurde bei einem Volumenverhältnis von wässriger Phase zu Ölphase von 1:1 durchgeführt. Die Peakflächen von Kontrolle und ent¬ sprechender Biokatalyse (50 % (v/v) wässrige Phase) waren vergleichbar, sodass das davon ausgegangen werden kann, dass nach 20 h die Autohydrolyse so weit fortgeschritten ist wie die Umsetzung mit CAL-A , wenn nicht sogar vollständig ist. Der Einsatz einer Lipase ist also, zumindest bei längerer Reaktionszeit, nicht erforderlich.
Die enzymatische Umwandlung des hierdurch gebildeten 3 MCPDs erfolgte anschließend durch Kombination von
Dehalogenase und mikrobiell r Epoxidhydrolase wie oben schrieben .
Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1 Die Abbildung zeigt den Abbau von 3-MCPD mit der
HHD HheA aus Arthrobacter sp . AD2 und mikrobieller Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1. Beide Enzyme wurden zu Beginn der Reaktion zugegeben.
Abb. 2 Abgebildet ist der Abbau von 3-MCPD mit HheA und
EchA. Die Reaktion wurde zunächst nur mit HheA gestartet. EchA wurde nach 3 Stunden zugegeben. Beispiele
Chemikalien und Enzyme
Glycidol und 3-MCPD wurden als Racemat von Sigma Aldrich gekauft. HEPES wurde ebenfalls von Sigma Aldrich gekauft. Die HHD HheA aus Arthrobacter sp . AD2 ist bei Codexis erhältlich. Das Enzym liegt in einer 50%igen Glycerinlösung vor. Der Proteingehalt wurde mit dem Bradford Assay zu 10 mg/ml bestimmt. Die Epoxidhydrolase EchA F108A aus
Agrobacterium radiobacter AD1 ist ebenfalls bei Codexis erhältlich. Das Enzym liegt als Lyophilisat vor und hat einen Proteingehalt von 790 yg/mg. Vor ihrem Einsatz in Biokatalysen wurden die Enzyme EchA F108A und HheA dreimal in Zentrifugenröhrchen (Amicon Ultra, Millipore, Ausschlussli¬ mit: 10 kDa) gewaschen, um Glycerin und eventuell störende Ionen zu entfernen. Als Waschpuffer wurde HEPES-Puffer (50 mM, pH 8, 4°C) verwendet. Für die Umsetzung in 2- Phasensystemen wurde ein im Handel erhältliches Speiseöl verwendet .
Umsetzung von 3-Monochlorpropandiol (3-MCPD) zu Glycerin Alle Reaktionen wurden im wässrigen Puffersystem in einem Volumen von 200 μΐ in GC-Glasröhrchen durchgeführt. Als Puffer diente HEPES (50 mM, pH 8) . Die Ausgangskonzentrati¬ on des Substrates 3-MCPD lag stets bei 10 mM. Für die Um¬ setzung mit HheA wurden in dem Falle, dass EchA und HheA beide von Beginn an zugesetzt wurden, 10 μΐ der Enzymlösung eingesetzt. In dem Falle, dass die EchA erst nach der Um¬ setzung des 3-MCPD zugesetzt wurde, 25 μΐ der Enzymlösung. Vom Lyophilisat der EchA wurden 5 mg eingesetzt. Die Reak- tionsansätze wurden bei 30°C in einem Thermomixer
inkubiert .
Für die Probennahme wurden 10 μΐ Reaktionslösung mit einer Tischzentrifuge kurz zentrifugiert , um eventuell ausgefal¬ lenes Protein abzutrennen. Das Zentrifugat wurde mit Hilfe einer Hamiltonpipette in den Gaschromatographen (GC) eingespritzt (0,4 μΐ) . Als GC diente ein Hewlett Packard 5890 Series II (Säule: Nitroterephthalsäure derivatisiertes PEG 30 m x 0,25 mm; Temperaturprogramm: 5 min 180°C, 10°C/min bis 220°C) .
Zur Quantifizierung der Chromatogramme wurde ein innerer Standard (DMSO) genutzt, welcher bei allen Reaktionen in einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt wurde. Zur Bestimmung der Responsefaktorverhältnisse wurden Glycidol, DMSO und 3-MCPD jeweils in einer Konzentration von 10 mM in der beschriebenen Pufferlösung gelöst und diese Lösung gemessen. Das Flächenverhältnis von 3-MCPD zu DMSO fucPD be¬ trug 0,417, das von Glycidol zu DMSO fciycidoi 0, 583.
Zur Kontrolle der Stabilität von 3-MCPD und Glycidol wurde eine Lösung zur Bestimmung der Responsefaktorverhältnisse nach 24 h erneut wie beschrieben gemessen.
Umsetzung von 3-MCPD im 2-Phasensystem
Die Reaktionen wurden in GC-Glasröhrchen durchgeführt und das Reaktionsvolumen betrug in allen Fällen 1 ml. Insgesamt wurden elf Ansätze mit unterschiedlichen Volumenverhältnis¬ sen von wässriger Phase und Ölphase erstellt:
Volumenverhältnis wässrige Phase : Ölphase 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5. Als Puffer für die wässrige Phase diente wiederum HEPES (50 mM, pH 8) . Die Konzentration von 3-MCPD lag in allen Fällen bei 10 mM, wobei für die Berechnung nur das Volumen der wässrigen Phase berücksichtigt wurde, da davon ausgegangen werden kann, dass 3-MCPD ausschließlich in der wässrigen Phase vorliegt. Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C in ei¬ nem Thermomixer inkubiert. Die Probennahme erfolgte aus der wässrigen Phase wie bereits beschrieben.
Umsetzung des 3-MCPD-l-Monoölsäureesters im 2-Phasensystem Die Reaktionen wurden in GC-Glasröhrchen durchgeführt und das Reaktionsvolumen betrug in allen Fällen 1 ml. Insgesamt wurden elf Ansätze mit unterschiedlichen Volumenverhältnis¬ sen von wässriger Phase und Ölphase erstellt:
Volumenverhältnis wässrige Phase : Ölphase 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5.
Als Puffer für die wässrige Phase diente wiederum HEPES (50 mM, pH 8) . Die Konzentration des 3-MCPD-Ölsäureesters lag in allen Ansätzen bei 50 mM. In diesem Fall bezieht sich diese Konzentration auf das Volumen der Ölphase, da der 3- MCPD-Ester in der wässrigen Phase praktisch nicht löslich ist. Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C in einem Thermo¬ mixer inkubiert. Die Probennahme erfolgte aus der wässrigen Phase wie bereits beschrieben.
Für die Kontrolle zur Autohydrolyse des 3-MCPD- Ölsäureesters wurde in einem Ansatz mit einem Volumenverhältnis von wässriger Phase zu Ölphase von 1:1 der 3-MCPD- Ester in einer Konzentration von 50 mM (bezogen auf das Vo- lumen der Ölphase) zugegeben und wie die übrigen Ansätze inkubiert .
Synthese des 3-MCPD-l-Monoölsäureesters
3-MCPD (1,1 g) und Ölsäure (3,02 g) werden in 30 ml MTBE gelöst, ca 5 g aktiviertes Molekularsieb (zur Wasserentfer¬ nung) hinzugegeben und die Reaktion durch Zugabe von 300 mg Lipase B aus Candida antarctica (CAL-B, Novozymes, Däne¬ mark) gestartet. Das Reaktionsgemisch wird bei 37°C über Nacht unter Vakuum und Stickstoffatmosphäre gerührt und nach Dünnschicht-Kontrolle des Umsatzes durch Filtration über eine Nutsche gestoppt. Der Niederschlag wird mit MTBE gewaschen, das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt und das saubere Produkt in einer quantitativen Ausbeute (4,1 g) erhalten. Die Identität wurde durch NMR-Spektroskopie und GC-MS bestätigt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten der allgemeinen Formel I,
Figure imgf000022_0001
Formel I
worin der Rest R Wasserstoff oder den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, der Rest R' ebenfalls Wasserstoff oder den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, wobei die Reste R und R' gleich oder
verschieden sind und X ein Halogenatom ist,
zu 1 , 2 , 3-Propantriol oder Monoacylglyceriden,
gekennzeichnet durch enzymatische Umsetzung von 3- Halogen-1 , 2-propandiol und seinen Mono- und Diester¬ derivaten der allgemeinen Formel I mit einer Dehalo- genase und anschließende enzymatische Umsetzung mit einer mikrobiellen Epoxid-Hydrolase, wobei die
Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v) erfolgen.
2. Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Lipidsystem einen Wasseranteil zwischen zwischen 0.1 und 10% (v/v), vorzugsweise zwischen 0.1 und 5% (v/v) aufweist.
3. Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dehalogenase ausgewählt ist aus der Gruppe von HheA aus Arthrobacter sp . AD2, HheA aus Corynebacterium sp . N-1074, HheB aus Mycobacterium sp . GP1, HheC aus Agrobacterium
radiobacter ADl und Dehalogenase B aus Agrobacterium tumefaciens HK7, und vorzugsweise die Halohydrin- Dehalogenase HheA aus Arthrobacter sp . AD2 ist.
4. Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrobielle Epoxid-Hydrolase ausgewählt ist aus der Gruppe von Epoxid-Hydrolase aus Aspergillus niger und Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter ADl, und vorzugsweise die Epoxid-Hydrolase EchA aus
Agrobacterium radiobacter ADl, besonders bevorzugt die Mutante F108A der EchA aus Agrobacterium radiobacter ADl ist .
5. Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass
mindestens einer der Reste R oder R' den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet.
6. Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure (n) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe der gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren .
7. Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Chloratom ist.
8. Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass wenn der Rest R und der Rest R' beide Reste einer veresterten Fettsäure sind, welche gleich oder verschieden sind, die Umwandlung in 1 , 2 , 3-Propantriol oder Monoacylglyceride durch enzymatische Umsetzung mit einer Haloalkan-Dehalo- genase, ohne Zusatz einer mikrobiellen Epoxid-Hydrolase, erfolgt .
9. Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass wenn beide Reste R und Rest R' Reste veresterter Fettsäuren sind, wobei diese gleich oder verschieden sind,
zusätzlich eine Umsetzung mit einer Lipase erfolgt.
PCT/EP2010/063468 2009-09-25 2010-09-14 Verfahren zur umwandlung von 3-halogen-1,2-propandiol und seinen mono- und diesterderivaten zu 1,2,3-propantriol oder monoacylglyceriden durch enzymatische umsetzung WO2011036072A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102009042760.0 2009-09-25
DE102009042760A DE102009042760A1 (de) 2009-09-25 2009-09-25 Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten zu 1,2,3-Propantriol oder Monoacylglyceriden durch enzymatische Umsetzung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011036072A1 true WO2011036072A1 (de) 2011-03-31

Family

ID=43466999

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2010/063468 WO2011036072A1 (de) 2009-09-25 2010-09-14 Verfahren zur umwandlung von 3-halogen-1,2-propandiol und seinen mono- und diesterderivaten zu 1,2,3-propantriol oder monoacylglyceriden durch enzymatische umsetzung

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102009042760A1 (de)
WO (1) WO2011036072A1 (de)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103245752A (zh) * 2013-04-15 2013-08-14 福建省疾病预防控制中心 一种检测食品中脂肪酸氯丙醇酯单双酯含量的方法
WO2014081279A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Universiti Putra Malaysia An improved palm oil refining process
CN104372040A (zh) * 2013-08-12 2015-02-25 南京朗恩生物科技有限公司 一种连续制备他汀药物中间体(r)-3-羟基戊二酸乙酯的方法
CN104673733A (zh) * 2015-02-10 2015-06-03 浙江大学 工程菌及其在制备(r)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用
CN108048438A (zh) * 2018-02-09 2018-05-18 浙江宏元药业股份有限公司 一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用
WO2019217223A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Arisdyne Systems, Inc. Methods for refined palm oil production with reduced 3-mcpd formation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001046476A1 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 Maxygen, Inc. Alteration of hydrolase genes and screening of the resulting libraries for the ability to catalyze specific reactions
WO2007022059A2 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 The Regents Of The University Of California Inhibition of phosphatase activity of soluble epoxide hydrolase amino terminus and uses thereof
JP2009507629A (ja) * 2005-09-15 2009-02-26 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 遠心式接触分離器における連続化学法
WO2007128469A1 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for the preparation of enantiomerically enriched nitriles

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. VAN DEN WIJNGAARD ET AL.: "Purification and Characterization of Haloalcohol Dehalogenase from Arthrobacter sp. Strain AD2", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 173, no. 1, 1991, pages 124 - 129, XP002618370 *
HAMLET G. ET AL., FOOD ADDIT. CONTAM., vol. 19, 2002, pages 619 - 631
JONG DE R M ET AL: "Structure and mechanism of a bacterial haloalcohol dehalogenase: A new variation of the short-chain dehydrogenase/reductase fold without an NAD(P)H binding site", EMBO JOURNAL, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, vol. 22, no. 19, 1 October 2003 (2003-10-01), pages 4933 - 4944, XP002305279, ISSN: 0261-4189, DOI: DOI:10.1093/EMBOJ/CDG479 *
NAKAMURA T ET AL: "CHARACTERIZATION OF A NOVEL ENANTIOSELECTIVE HALOHYDRIN HYDROGEN-HALIDE-LYASE", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 60, no. 4, 1 April 1994 (1994-04-01), pages 1297 - 1301, XP009039698, ISSN: 0099-2240 *
R. DE JONG ET AL.: "The X-Ray Structure of the Haloalcohol Dehalogenase HheA from Arthrobacter sp. Strain AD2: Insight into Enantioselectivity and Halide Binding in the Haloalcohol Dehalogenase Family", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 188, no. 11, 2006, pages 4051 - 4056, XP002618369 *
SEEFELDER W., FOOD ADDIT. CONTAM. PART A CHEM. ANAL. CONTROL EXPO RISK ASSESS, vol. 25, 2008, pages 391 - 400
SLATER J H ET AL: "MICROBIAL DEHALOGENATION", BIODEGRADATION, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, NL, vol. 6, no. 3, 1 September 1995 (1995-09-01), pages 181 - 189, XP001052953, ISSN: 0923-9820, DOI: DOI:10.1007/BF00700456 *
T. NAKAMURA ET AL.: "Resolution and Some Properties of Enzymes Involved in Enantioselective Transformation of 1,3-Dichloro-2-Propanol to (R)-3-Chloro-1,2-Propanediol by Corynebactreium sp. Strain N-1074", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 174, no. 23, 1992, pages 7613 - 7619, XP002618371 *
ZELINKOVA, S. ET AL., FOOD ADDIT. CONTAM., vol. 23, 2006, pages 1290 - 1298

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014081279A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Universiti Putra Malaysia An improved palm oil refining process
CN103245752A (zh) * 2013-04-15 2013-08-14 福建省疾病预防控制中心 一种检测食品中脂肪酸氯丙醇酯单双酯含量的方法
CN104372040A (zh) * 2013-08-12 2015-02-25 南京朗恩生物科技有限公司 一种连续制备他汀药物中间体(r)-3-羟基戊二酸乙酯的方法
CN104372040B (zh) * 2013-08-12 2018-07-03 南京朗恩生物科技有限公司 一种连续制备他汀药物中间体(r)-3-羟基戊二酸乙酯的方法
CN104673733A (zh) * 2015-02-10 2015-06-03 浙江大学 工程菌及其在制备(r)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用
CN104673733B (zh) * 2015-02-10 2018-02-13 浙江大学 工程菌及其在制备（r）‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯中的应用
CN108048438A (zh) * 2018-02-09 2018-05-18 浙江宏元药业股份有限公司 一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用
CN108048438B (zh) * 2018-02-09 2020-08-18 浙江宏元药业股份有限公司 一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用
WO2019217223A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Arisdyne Systems, Inc. Methods for refined palm oil production with reduced 3-mcpd formation
US11634657B2 (en) 2018-05-07 2023-04-25 Arisdyne Systems, Inc. Method for refined palm oil production with reduced 3-MCPD formation

Also Published As

Publication number Publication date
DE102009042760A1 (de) 2011-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2921155B1 (de) Verfahren zur herstellung hochwertige lipide durch enzymatische freisetzung aus biomasse
WO2011036072A1 (de) Verfahren zur umwandlung von 3-halogen-1,2-propandiol und seinen mono- und diesterderivaten zu 1,2,3-propantriol oder monoacylglyceriden durch enzymatische umsetzung
JP5700503B2 (ja) グリセリド組成物及び該グリセリド組成物の製造方法
EP3152283B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur schrittweisen aufarbeitung eines organischen öls
DE69332217T3 (de) Phospholipase A1, Verfahren zu seiner Herstellung und Anwendung
EP1582594B1 (de) Verfahren zur beschleunigten enzymatischen Synthese von Triglyzeriden ungesättigter Fettsäuren
EP1978102B1 (de) Ein Gemisch enthaltend Fettsäureglyceride
EP2682453B1 (de) Verfahren zur herstellung von öl/fett mit in hohem masse ungesättigten fettsäuren mittels lipase
WO2014034154A1 (ja) 精製油脂の製造方法
DE69936757T2 (de) Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms
Vafaei et al. Interesterification of soybean oil with propylene glycol in supercritical carbon dioxide and analysis by NMR spectroscopy
EP1792999B1 (de) Verfahren zur enzymatischen Synthese von Triglyceriden
EP2272954A1 (de) Verfahren zur herstellung immobilisierter enzyme
EP1660668B1 (de) Verfahren zur enzymatischen herstellung von mono- und diacylglycerid-haltigen emulgatoren
EP1336659A2 (de) Verfahren zur Gewinnung von Hydroperoxiden
EP2298727A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Estern kurzkettiger Alkohole aus triglyceridreichen Ölen
EP1330534A1 (de) Verfahren zur gewinnung von 12-hydroxystearinsäure
EP3880651A1 (de) Verfahren zur herstellung von polyolbasierten estern von gegebenenfalls acylierten hydroxycarbonsäuren
EP1978101A1 (de) Verfahren zur Anreicherung mehrfach ungesättigter Fettsäuren
WO2013018859A1 (ja) エステル交換油の製造方法
WO2023106224A1 (ja) 風味改良用酵素剤及びその応用
JP2004222595A (ja) ジグリセリドの製造方法
JP6294007B2 (ja) 脂肪酸含有物中の脂肪酸除去に使用される微生物製剤、及びその利用
JP6069722B2 (ja) エステル交換油脂の製造方法
AT408988B (de) Verfahren zur erhöhung der aktivität von pankreatischen lipasen

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10751972

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10751972

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1