DE102009042760A1

DE102009042760A1 - Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten zu 1,2,3-Propantriol oder Monoacylglyceriden durch enzymatische Umsetzung

Info

Publication number: DE102009042760A1
Application number: DE102009042760A
Authority: DE
Inventors: Uwe Prof. Dr. Bornscheuer; Martin Hesseler
Original assignee: Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Current assignee: Universitaet Greifswald
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2011-04-28
Also published as: WO2011036072A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten durch enzymatische Umsetzung mit einer Dehalogenase und anschließende enzymatische Umsetzung mit einer Epoxid-Hydrolase, wobei die Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v) erfolgen.

Description

3-Halogen-1,2-propandiole und deren Mono- und Diester, insbesondere 3-Monochlor-1,2-propandiol (3-MCPD) und dessen Ester mit Carbonsäuren sind Verbindungen, welche in Lebensmitteln als unerwünschte Kontaminationen auftreten. Besonders betroffen sind davon Fette und Öle. Speziell 3-MCPD ist eine toxische Verbindung, die beispielsweise für die Niere schädlich ist, da es dort zu Veränderungen bis hin zur Tumorbildung führen kann.
Die Entfernung dieser Substanzen, vorrangig des 3-MCPD, aus Lebensmitteln ist somit zwingend notwendig, was aktuell Gegenstand analytischer und toxikologischer Untersuchungen ist.
Nach derzeitigem Stand entstehen diese Verbindungen bei der Herstellung und Prozessierung von Pflanzenölen, beispielsweise durch Hitzebehandlung von Ölsaaten und in der Raffination (Raffinieren oder Raffinierung), dort insbesondere bei der Desodorierung.
Neben dem Auftreten in Fetten und Ölen finden sich die schädlichen Substanzen auch in weiteren Lebensmitteln wie Brot, geräucherten Fleischwaren und in Säuglingsnahrung wie Säuglingsmilchpulver. Aufgrund der Toxizität der 3-Halogen-1,2-propandiole und deren Derivaten, insbesondere von 3-MCPD und seinen Derivaten ist eine Entfernung dieser Stoffe vor allem aus lebensmittelrechtlicher Sicht wünschenswert. Bei der Bewertung der Toxizität der 3-MCPD-Ester geht man zur Zeit aufgrund von fehlenden Daten von einer vollständigen Hydrolyse der Ester aus. Die Ester müssen also in Bezug auf ihre Toxizität wie das freie 3-MCPD behandelt werden. Somit sind auch die Ester des 3-MCPD Verbindungen, welche es aus Lebensmitteln zu entfernen gilt.
Verfahrenstechnische Ansätze zur Reduzierung des Gehalts an 3-MCPD finden sich in den Schriften von Zelinkova, S. et al., Food Addit. Contam. 2006, Vol. 23, 1290–1298; Hamlet G. et al., Food Addit. Contam. 2002, Vol. 19, 619–631; Seefelder W., Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo Risk Assess. 2008, Vol. 25, 391–400.
Nachteilig bei den dort beschriebenen Ansätzen ist allerdings, dass es auch zu einer Erhöhung der 3-MCPD-Konzentration kommen kann. Ebenso ist es von Nachteil, dass diese Verfahren sehr energieintensiv sind. Es kann zu unerwünschten Veränderungen in der Qualität der behandelten Fette/Öle kommen. Beispielsweise können Isomerisierungen, Abbau bzw. chemische Veränderungen der enthaltenen Fettsäuren, sowie Änderungen im Spektrum der Antioxidantien auftreten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Eliminierung von 3-Halogen-1,2-propandiolen und deren Derivaten bereitzustellen, welches die oben genannten Nachteile überwindet.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 gelöst. In anderen Worten ist die Lösung der Aufgabe ein Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten der allgemeinen Formel I,
Formel I worin der Rest R Wasserstoff oder den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, der Rest R' ebenfalls Wasserstoff oder den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, wobei die Reste R und R' gleich oder verschieden sind und X ein Halogenatom, vorzugsweise ein Chloratom, ist,
zu 1,2,3-Propantriol oder Monoacylglyceriden,
welches gekennzeichnet ist durch enzymatische Umsetzung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten der allgemeinen Formel I mit einer Dehalogenase und anschließende enzymatische Umsetzung mit einer Epoxid-Hydrolase, wobei die Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v) erfolgen.
Vorzugsweise weist das hydrophobe Lipidsystem einen Wasseranteil zwischen 0.1 und 10% (v/v), besonders bevorzugt zwischen 0.1 und 5% (v/v) auf.
Im Gegensatz zu einigen anderen Enzymen wie Lipasen, welche in Ölen meist sehr aktiv und stabil sind, entfalten Dehalogenasen und Epoxid-Hydrolasen ihre Wirkung so gut wie ausschließlich nur in wässrigen Systemen.
Überraschenderweise konnte aber gezeigt werden, dass bei der enzymatischen Umwandlung von 3-Halogen-1,2,-propandiolen und ihren Derivaten, insbesondere bei der Umwandlung von 3-Monochlor-1,2-propandiol und seinen Derivaten, sowohl die Dehalogenase als auch die Epoxid-Hydrolase ihre Wirkung auch in einem Lipidsystem entfaltet, d. h. beide Enzyme auch in Gegenwart von Pflanzenölen in einer sehr hydrophoben Umgebung aktiv sind. Wasser muss dabei nur in sehr geringen Mengen zugegen sein.
Das Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten, ist also insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v), mehr bevorzugt zwischen 0.1 und 10% (v/v), höchst bevorzugt zwischen 0.1 und 5% (v/v) erfolgen. Unter einem hydrophoben Lipidsystem ist ein Lipidsystem zu verstehen, welches einen log p-Wert von mindestens 2, vorzugsweise von mindestens 4 aufweist.
Das Lipidsystem umfasst Fettsäuren, Triacylglyceride (Fette und Öle) sowie die entsprechenden Mono- und Diacylglyceride, Wachse, Phospholipide, Sphingolipide, Lipopolysaccharide und Isoprenoide (Steroide, Carotinoide etc.), insbesondere solche Lipide, wie sie in Pflanzenölen vorkommen. Vorzugsweise umfasst das Lipidsystem Triacyl-, Mono- und Diacylglyceride. Umfasst sind dabei einzelne Substanzen sowie Mischungen aus mehreren Substanzen.
Unter „3-Halogen-1,2-propandiolen und ihren Derivaten” bzw. „3-MCPD und seinen Derivaten” sind im nachfolgenden 3-Halogen-1,2-propandiole und ihre Mono- und Diesterderivate, aber auch die enantiomeren 1-Halogen-2,3-propandiole und ihre Mono- und Diesterderivate bzw. 3-MCPD und seine Mono- und Diesterderivate sowie das enantiomere 1-MCPD und seine Mono- und Diesterderivate zu verstehen.
Im Gegensatz zu 3-Halogen-1,2-propandiolen und ihren Derivaten bzw. 3-MCPD und seinen Derivaten ist 1,2,3-Propantriol (Glycerin), welches das Endprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt, eine nicht toxische, in Lebensmittel zugelassene Substanz. Das Verfahren ermöglicht also die Überführung toxischer 3-Halogen-1,2-propandiole und ihren Derivaten, insbesondere die Überführung von 3-MCPD und seinen Derivaten mittels enzymatischer Hydrolyse in die lebensmitteltechnisch unbedenkliche Verbindung Glycerin bzw. deren Derivate.
Die in den Estern enthaltenen Fettsäuren sind ausgewählt aus der Gruppe der gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Bevorzugt sind unverzweigte Monocarbonsäuren mit mindestens vier Kohlenstoffatomen. Einsetzbar sind grundsätzlich alle Fettsäuren, in deren finalen Produkten 3-Halogen-1,2-propandiole bzw. deren Mono- oder Diester, insbesondere 3-MCPD und dessen Ester, zu finden sind. Die Ölsäure ist ein prominenter Vertreter, der beispielsweise in hohen Mengen im Palmöl und Olivenöl zu finden ist. Weitere Vertreter sind die Linolsäure, Linolensäure, gamma-Linolensäure, konjugierte Linolensäure Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure, Stearinsäure und Palmitinsäure. Vorzugsweise werden die Fettsäuren insgesamt ausgewählt aus der Gruppe von Ölsäure, Linolsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure, Buttersäure, Capronsäure, Laurinsäure, Myristinsäure und Margarinsäure. Als Pflanzenöle sind insbesondere Öle aus der Gruppe von Palmöl, Palmkernöl, Olivenöl, Rapsöl, Sonnenblumenöl, Sojabohnenöl, Erdnußöl, Baumwollsaatenöl und Kokosnußöl relevant.
Die Nomenklatur der hydrolytischen Dehalogenasen ist ein Thema, welches in der Literatur uneinheitlich behandelt wird. In der BRENDA-Datenbank findet man beispielsweise ausschließlich Haloalkan-Dehalogenasen (E. C. 3.8.1.5). Halohydrin-(oder synonym Haloalkohol-)Dehalogenasen werden dort nicht genannt. In Publikationen wird meist von Halohydrin-(bzw. Haloalkohol-)Dehalogenasen gesprochen, wenn das Enzym einen vicinalen Haloalkohol zu einem Epoxid umsetzt. Von Haloalkan-Dehalogenasen ist die Rede, wenn das Enzym das Substrat, welches für gewöhnlich ein Haloalkan ist, direkt zum Alkohol umsetzt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „Dehalogenasen”, dass sowohl Halohydrin-Dehalogenasen als auch Haloalkan-Dehalogenasen umfasst sind. Der Begriff „Halohydrin-(bzw. Haloalkohol-)Dehalogenase” wird verwendet, wenn das Enzym einen vicinalen Haloalkohol zu einem Epoxid umsetzt (HHD). Der Begriff „Haloalkan-Dehalogenase” bezeichnet, dass das Enzym das Substrat direkt zum Alkohol umsetzt (HAD).
Vorzugsweise ist die Dehalogenase ausgewählt aus der Gruppe von HheA aus Arthrobacter sp. AD2, HheA aus Corynebacterium sp. N-1074, HheB aus Mycobacterium sp. GP1, HheC aus Agrobacterium radiobacter AD1 und Dehalogenase B aus Agrobacterium tumefaciens HK7. Besonders bevorzugt ist die Halohydrin-Dehalogenase (HHD) HheA aus Arthrobacter sp. AD2.
Die Dehalogenase überführt die 3-Halogen-1,2-propandiole in das entsprechende Glycidolderivat (Epoxid). Anschließend wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein zweites Enzym (Epoxid-Hydrolase) zugesetzt, welches hydrolytisch das Glycidolderivat in ein Glycerinderivat überführt. In Schema 1 sind die jeweiligen Reaktionen für 3-Halogen-1,2-propandiole und für deren Monoester dargestellt.
Schema 1
Beide Reaktionen (Umsetzung mit Dehalogenase und mit Epoxid-Hydrolase) laufen ab, ohne dass das Reaktionsgemisch nach dem ersten Schritt aufgereinigt werden muss.
Insbesondere freies 3-MCPD wird so schnell und einfach in Glycerin überführt. Monoesterderivate können mittels Zusatz einer Lipase optional gespalten werden, d. h., dass wenn einer der Reste R oder Rest R' ein Rest einer veresterten Fettsäure ist, in einer bevorzugten Ausführungsform zusätzlich eine Umsetzung mit einer Lipase erfolgt. Die Zugabe der Lipase erfolgt zeitgleich mit oder vor dem Zusatz der Dehalogenase.
Insgesamt werden 3-Halogen-1,2-propandiolderivate mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens in die korrespondierenden Glyceride (Glycerin bzw. Monoacylglyceride) überführt, welche natürliche Bestandteile von Pflanzenölen sind.
Die Epoxid-Hydrolase ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe von Epoxid-Hydrolase aus Aspergillus niger und Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1. Stärker bevorzugt ist die Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1, besonders bevorzugt die Mutante F108A der EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1.
Die Zugabe der Epoxid-Hydrolase kann prinzipiell gleichzeitig mit der Zugabe der Dehalogenase erfolgen, wobei dies oft nicht zum gewünschten Abbau des Glycidols führt.
Im wässrigen System konnte zunächst gezeigt werden, dass 3-MCPD in Anwesenheit einer Dehalogenase (hier eine Halohydrin-Dehalogenase) und einer Epoxid-Hydrolase (EH) über die Zwischenstufe Glycidol zu Glycerin umgesetzt wird. 3-MCPD und Glycidol konnten gaschromatographisch nachgewiesen werden. Über einen inneren Standard, Dimethylsulfoxid (DMSO), wurde die Reaktion quantifiziert. Die zeigt den Verlauf der Reaktion. Die HAD HheA aus Arthrobacter sp. AD2 setzt in einer hydrolytischen Reaktion 3-MCPD zu Glycidol um. Glycidol wiederum ist ein Substrat der EH EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1, welche dieses zu Glycerin abbaut. Die Mutante F108A der EchA besitzt eine verbesserte Aktivität gegenüber Glycidol und wurde bei den hier beschriebenen Experimenten verwendet. Beide Enzyme wurden zu Beginn der Reaktion zugegeben.

Trotz Zugabe von EH war keine Verminderung der Konzentration an Glycidol zu verzeichnen (vgl. ). Auch nach 24 h war kaum eine Veränderung zu erkennen. Nach 450 min betrug die Konzentration von 3-MCPD 2,5 mM und die von Glycidol 7,8 mM. Die Messdaten, welche mittels Gaschromatographie ermittelt wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

Zeit [min]	Glycidol Peakfläche	DMSO Peakfläche	MCPD Peakfläche
3	154	2399	985
18	174	2560	1033
30	243	2652	1034
54	294	2454	887
68	336	2458	857
95	490	2828	885
118	491	2604	725
130	568	2604	681
176	639	2468	596
190	760	2759	678
266	869	2828	593
297	799	2448	505
344	853	2562	414
450	1160	3059	340
1485	1242	2746	285

Aus diesem Grund wurde der Abbau von 3-MCPD zu Glycerin in zwei Schritte aufgeteilt.
Vorzugsweise erfolgt die Beigabe der EH daher dann, wenn nach Zusatz der Dehalogenase keine signifikanten Änderungen in den Konzentrationen von Glydidol und 3-Halogen-1,2-prodandiol, bzw. dessen Derivaten mehr beobachtet werden kann. Die Konzentrationsmessung erfolgt mit Standardmessmethoden. Zunächst wird mittels Dehalogenase Glycidol erzeugt, dass anschließend durch die EH in Glycerin überführt wird. Der Reaktionsverlauf ist in abgebildet. Beide Reaktionen laufen sequentiell ab, ohne dass jedoch das Reaktionsgemisch nach dem ersten Schritt aufgereinigt wird.

Die Messdaten, welche mittels Gaschromatographie ermittelt wurden, sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

Zeit [min]	Glycidol Peakfläche	DMSO Peakfläche	MCPD Peakfläche
0	0	3271	1402
28	260	2033	758
38	442	2449	796
50	443	2324	708
76	667	2168	549
89	928	2977	711
125	979	2392	503
138	921	2225	387
151	1199	2704	378
168	1316	2926	376
183	1243	2696	333
195	199	2549	288
210	0	2544	294

Die 3-MCPD-Konzentration nahm zunächst annähernd linear ab. Nach ca. 2,5 h ließ sich jedoch kaum noch eine Abnahme der 3-MCPD-Konzentration messen und die Reaktion stagnierte bei etwa 25% der Ausgangskonzentration, sodass nach 3 h die EH zugesetzt wurde. Eine halbe Stunde nach Zugabe des Enzyms ließ sich das Glycidol nicht mehr nachweisen. Nach 24 h zeigte sich keine Veränderung in den Konzentrationen. 3-MCPD wurde zu 2,5 mM bestimmt, Glycidol war nicht nachzuweisen (Daten in nicht aufgeführt). Kontrollen zur Stabilität von 3-MCPD und Glycidol lieferten keine Anzeichen für deren Autohydrolyse innerhalb von 24 h: Bei Glycidol wurde eine Abweichung von weniger als 1% gemessen, bei 3-MCPD von 6%. Da die Standardabweichung jedoch in beiden Fällen höher bestimmt wurde (Glycidol 3,5% bzw. 3-MCPD 7,4%), kann man davon ausgehen, dass die Substanzen unter den Reaktionsbedingungen stabil sind.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden 3-Halogen-1,2-propandiolderivate über das entsprechende Glycidolderivat in die korrespondierenden Glyceride überführt, welche natürliche Bestandteile von Pflanzenölen sind. Ergänzend für die Umsetzung der Diester bei Verwendung einer Halohydrin-Dehalogenase ist allerdings der Zusatz einer Lipase erforderlich, welche die Ester in die entsprechende(n) Fettsäure(n) und die 3-Halogen-1,2-propandiol-Verbindung spaltet. Der Reaktionsverlauf für Diesterderivate ist in Schema 2 dargestellt. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten ist entsprechend dadurch gekennzeichnet, dass wenn beide Reste R und Rest R' Reste veresterter Fettsäuren sind, wobei diese gleich oder verschieden sind, zusätzlich eine Umsetzung mit einer Lipase erfolgt (Esterspaltung). Die Zugabe der Lipase erfolgt zeitgleich mit oder vor dem Zusatz der Dehalogenase.
Zu bemerken ist dabei, dass bei Verwendung einer Haloalkan-Dehalogenase (HAD) als Dehalogenase Diester auch direkt in das Glycerid überführt werden können. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten ist entsprechend dadurch gekennzeichnet, dass wenn der Rest R und der Rest R' beide Reste einer veresterten Fettsäure sind, welche gleich oder verschieden sind, die Umwandlung durch enzymatische Umsetzung mit einer HAD, ohne Zusatz einer Epoxid-Hydrolase, erfolgt. Der Zusatz einer Lipase ist dann nur optional.
Schema 2
Die Wahl der Lipase hängt von der Zusammensetzung des Produktes ab und muss dementsprechend angepasst werden, wobei die generelle Auswahl alle Lipasen umfasst, die Glyceride umsetzen. Vorzugsweise wird die Lipase ausgewählt aus der Gruppe von CAL-B (Lipase B aus Candida antarctica);
CAL-A (Lipase A aus Candida antarctica);
RML (Lipase aus Rhizomucor miehei);
TLL (Lipase B aus Thermomyces lanuginosus);
Amano PS (Lipase aus Burkholderia cepacia);
Amano G (Lipase aus Penicillium camembertii, Lipase G Amano 50);
Lipase aus Geotrichum candidum;
Amano R (Lipase aus Penicillium roquefortii);
Newlase F (Lipase aus Rhizopus niveus);
Amano AYS (Lipase aus Candida rugosa, ehemals C. cylindracea);
Amano AS (Lipase aus Aspergillus niger);
Amano F-AP15 (Lipase aus Rhizopus oryzae);
Amano AK (Lipase aus Pseudomonas fluorescens) und
Lipase aus Pseudomonas aeruginosa.
Bevorzugt ist die Verwendung einer Lipase aus der Gruppe von CAL-A (Lipase A aus Candida antarctica) und Lipase G Amano 50 (Lipase aus Penicillium camembertii).
Nachfolgend wird exemplarisch die Umsetzung von 3-MCPD in einem hydrophoben Lipidsystem beschrieben (2-Phasensystem aus wässriger Phase und Ölphase).
Da 3-MCPD, genauer gesagt dessen Fettsäureester, bei der Produktion von u. a. Ölen entstehen, wurde davon ausgegangen, dass auch im Prozess zur Entfernung von 3-MCPD aus dem Reaktionsgemisch nicht unerhebliche Mengen an Triglyceriden und partiellen Glyceriden im Reaktionsgemisch enthalten sind. Es wurde weiterhin davon ausgegangen, dass der Fettsäureester bereits vollständig hydrolysiert vorliegt. Reaktionsmischungen mit verschiedenen Verhältnissen von wässriger Phase und Ölphase wurden erstellt und diese auf Abbau des 3-MCPD untersucht. 3-MCPD selbst ist sehr polar und somit hauptsächlich in der wässrigen Phase zu finden.
Es wurden Reaktionen mit folgenden Anteilen (Volumenprozent) der wässrigen Phase erstellt: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 95% (v/v). Nach 20 h wurde zunächst der Ansatz mit 50% (v/v) gemessen. Die Konzentration lag bei 26% (2,6 mM) der Ausgangskonzentration des 3-MCPD. Bei einem Wasseranteil von 20% (v/v) setzte die HheA ebenfalls 3-MCPD um, und zwar bis auf einen Rest von 14% (1,4 mM). Bei einem Wasseranteil von 5% (v/v) ließ sich gar kein 3-MCPD mehr nachweisen. Die Glycidolkonzentration wurde zu 6,3 mM (50% (v/v)), 7,2 mM (20% (v/v)) bzw. 7,7 mM (5% (v/v) bestimmt. Folglich ist die Dehalogenase in einem Öl/Wassergemisch aktiv.
Um zu überprüfen, ob auch die EH unter diesen Bedingungen aktiv war, wurde EchA zu den drei gemessenen Ansätzen hinzugegeben. Nach mehr als einer Stunde ließ sich nur bei 50 (v/v) Wasseranteil noch eine geringe Menge (0,7 mM) an Glycidol messen. Bei einem Wasseranteil von 20 und 5 (v/v) konnte kein Glycidol mehr nachgewiesen werden. Folglich ist auch die Epoxidhydrolase in einem Öl/Wassergemisch aktiv.
Ergänzend wurde ebenfalls ein 3-MCPD-1-Monoölsäureester in einem hydrophoben Lipidsystem untersucht (2-Phasensystem aus wässriger Phase und Ölphase).
3-MCPD liegt als Kontamination von Ölen in erster Linie nicht frei, sondern als Fettsäuremonoester vor. Aus diesem Grund wurde der (in der Ölphase befindliche) 3-MCPD-1-Monoölsäureester im 2-Phasensystem zunächst durch eine Lipase selektiv gespalten und anschließend 3-MCPD (in der wässrigen Phase) zu Glycerin umgesetzt.
Dafür wurden wie bei der Umsetzung von 3-MCPD im 2-Phasensystem verschiedene Volumenverhältnisse von wässriger Phase und Ölphase erstellt und in diesem Fall der 3-MCPD-Ester und eine Lipase (Candida Antarctica Lipase A (CAL-A) bzw. Lipase G Amano 50) zugegeben. Die Konzentration des 3-MCPD-Esters in der Ölphase betrug jeweils 50 mM. Nach 20 h wurde die wässrige Phase auf 3-MCPD untersucht.
Die Vorgehensweise bei der Messung entsprach der bei der Umsetzung von 3-MCPD im 2-Phasensystem. Zunächst wurde der Ansatz mit einem Volumenverhältnis wässrige Phase zu Ölphase von 1:1 gemessen. Bei erfolgreicher Umsetzung wurde bei 20% (v/v) wässrige Phase und schließlich bei 5% (v/v) gemessen. Mit CAL-A konnte sowohl bei 50, 20 als auch bei 5% (v/v) wässrige Phase 3-MCPD in der wässrigen Phase nachgewiesen werden. Allerdings konnte auch bei der Kontrolle zur Autohydrolyse des 3-MCPD-Esters 3-MCPD in der wässrigen Phase gemessen werden. Die Kontrolle wurde bei einem Volumenverhältnis von wässriger Phase zu Ölphase von 1:1 durchgeführt. Die Peakflächen von Kontrolle und entsprechender Biokatalyse (50% (v/v) wässrige Phase) waren vergleichbar, sodass das davon ausgegangen werden kann, dass nach 20 h die Autohydrolyse so weit fortgeschritten ist wie die Umsetzung mit CAL-A, wenn nicht sogar vollständig ist. Der Einsatz einer Lipase ist also, zumindest bei längerer Reaktionszeit, nicht erforderlich.
Die enzymatische Umwandlung des hierdurch gebildeten 3-MCPDs erfolgte anschließend durch Kombination von Dehalogenase und Epoxidhydrolase wie oben beschrieben.
Beschreibung der Abbildungen
Die Abbildung zeigt den Abbau von 3-MCPD mit der HHD HheA aus Arthrobacter sp. AD2 und Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1. Beide Enzyme wurden zu Beginn der Reaktion zugegeben.
Abgebildet ist der Abbau von 3-MCPD mit HheA und EchA. Die Reaktion wurde zunächst nur mit HheA gestartet. EchA wurde nach 3 Stunden zugegeben.
Beispiele
Chemikalien und Enzyme
Glycidol und 3-MCPD wurden als Racemat von Sigma Aldrich gekauft. HEPES wurde ebenfalls von Sigma Aldrich gekauft. Die HHD HheA aus Arthrobacter sp. AD2 ist bei Codexis erhältlich. Das Enzym liegt in einer 50%igen Glycerinlösung vor. Der Proteingehalt wurde mit dem Bradford Assay zu 10 mg/ml bestimmt. Die Epoxidhydrolase EchA F108A aus Agrobacterium radiobacter AD1 ist ebenfalls bei Codexis erhältlich. Das Enzym liegt als Lyophilisat vor und hat einen Proteingehalt von 790 μg/mg. Vor ihrem Einsatz in Biokatalysen wurden die Enzyme EchA F108A und HheA dreimal in Zentrifugenröhrchen (Amicon Ultra, Millipore, Ausschlusslimit: 10 kDa) gewaschen, um Glycerin und eventuell störende Ionen zu entfernen. Als Waschpuffer wurde HEPES-Puffer (50 mM, pH 8, 4°C) verwendet. Für die Umsetzung in 2-Phasensystemen wurde ein im Handel erhältliches Speiseöl verwendet.
Umsetzung von 3-Monochlorpropandiol (3-MCPD) zu Glycerin
Alle Reaktionen wurden im wässrigen Puffersystem in einem Volumen von 200 μl in GC-Glasröhrchen durchgeführt. Als Puffer diente HEPES (50 mM, pH 8). Die Ausgangskonzentration des Substrates 3-MCPD lag stets bei 10 mM. Für die Umsetzung mit HheA wurden in dem Falle, dass EchA und HheA beide von Beginn an zugesetzt wurden, 10 μl der Enzymlösung eingesetzt. In dem Falle, dass die EchA erst nach der Umsetzung des 3-MCPD zugesetzt wurde, 25 μl der Enzymlösung. Vom Lyophilisat der EchA wurden 5 mg eingesetzt. Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C in einem Thermomixer inkubiert.
Für die Probennahme wurden 10 μl Reaktionslösung mit einer Tischzentrifuge kurz zentrifugiert, um eventuell ausgefallenes Protein abzutrennen. Das Zentrifugat wurde mit Hilfe einer Hamiltonpipette in den Gaschromatographen (GC) eingespritzt (0,4 μl). Als GC diente ein Hewlett Packard 5890 Series II (Säule: Nitroterephthalsäure derivatisiertes PEG 30 m × 0,25 mm; Temperaturprogramm: 5 min 180°C, 10°C/min bis 220°C)
Zur Quantifizierung der Chromatogramme wurde ein innerer Standard (DMSO) genutzt, welcher bei allen Reaktionen in einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt wurde. Zur Bestimmung der Responsefaktorverhältnisse wurden Glycidol, DMSO und 3-MCPD jeweils in einer Konzentration von 10 mM in der beschriebenen Pufferlösung gelöst und diese Lösung gemessen. Das Flächenverhältnis von 3-MCPD zu DMSO f_MCPD betrug 0,417, das von Glycidol zu DMSO f_Glycidol 0,583.
Zur Kontrolle der Stabilität von 3-MCPD und Glycidol wurde eine Lösung zur Bestimmung der Responsefaktorverhältnisse nach 24 h erneut wie beschrieben gemessen.
Umsetzung von 3-MCPD im 2-Phasensystem
Die Reaktionen wurden in GC-Glasröhrchen durchgeführt und das Reaktionsvolumen betrug in allen Fällen 1 ml. Insgesamt wurden elf Ansätze mit unterschiedlichen Volumenverhältnissen von wässriger Phase und Ölphase erstellt:
Volumenverhältnis wässrige Phase:Ölphase 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5.
Als Puffer für die wässrige Phase diente wiederum HEPES (50 mM, pH 8). Die Konzentration von 3-MCPD lag in allen Fällen bei 10 mM, wobei für die Berechnung nur das Volumen der wässrigen Phase berücksichtigt wurde, da davon ausgegangen werden kann, dass 3-MCPD ausschließlich in der wässrigen Phase vorliegt. Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C in einem Thermomixer inkubiert. Die Probennahme erfolgte aus der wässrigen Phase wie bereits beschrieben.
Umsetzung des 3-MCPD-1-Monoölsäureesters im 2-Phasensystem
Die Reaktionen wurden in GC-Glasröhrchen durchgeführt und das Reaktionsvolumen betrug in allen Fällen 1 ml. Insgesamt wurden elf Ansätze mit unterschiedlichen Volumenverhältnissen von wässriger Phase und Ölphase erstellt:
Volumenverhältnis wässrige Phase:Ölphase 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5.
Als Puffer für die wässrige Phase diente wiederum HEPES (50 mM, pH 8). Die Konzentration des 3-MCPD-Ölsäureesters lag in allen Ansätzen bei 50 mM. In diesem Fall bezieht sich diese Konzentration auf das Volumen der Ölphase, da der 3-MCPD-Ester in der wässrigen Phase praktisch nicht löslich ist. Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C in einem Thermomixer inkubiert. Die Probennahme erfolgte aus der wässrigen Phase wie bereits beschrieben.
Für die Kontrolle zur Autohydrolyse des 3-MCPD-Ölsäureesters wurde in einem Ansatz mit einem Volumenverhältnis von wässriger Phase zu Ölphase von 1:1 der 3-MCPD-Ester in einer Konzentration von 50 mM (bezogen auf das Volumen der Ölphase) zugegeben und wie die übrigen Ansätze inkubiert.
Synthese des 3-MCPD-1-Monoölsäureesters
3-MCPD (1,1 g) und Ölsäure (3,02 g) werden in 30 ml MTBE gelöst, ca 5 g aktiviertes Molekularsieb (zur Wasserentfernung) hinzugegeben und die Reaktion durch Zugabe von 300 mg Lipase B aus Candida antarctica (CAL-B, Novozymes, Dänemark) gestartet. Das Reaktionsgemisch wird bei 37°C über Nacht unter Vakuum und Stickstoffatmosphäre gerührt und nach Dünnschicht-Kontrolle des Umsatzes durch Filtration über eine Nutsche gestoppt. Der Niederschlag wird mit MTBE gewaschen, das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt und das saubere Produkt in einer quantitativen Ausbeute (4,1 g) erhalten. Die Identität wurde durch NMR-Spektroskopie und GC-MS bestätigt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Zelinkova, S. et al., Food Addit. Contam. 2006, Vol. 23, 1290–1298 [0005]
Hamlet G. et al., Food Addit. Contam. 2002, Vol. 19, 619–631 [0005]
Seefelder W., Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo Risk Assess. 2008, Vol. 25, 391–400 [0005]

Claims

Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten der allgemeinen Formel I,
Formel I worin der Rest R Wasserstoff oder den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, der Rest R' ebenfalls Wasserstoff oder den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, wobei die Reste R und R' gleich oder verschieden sind und X ein Halogenatom ist, zu 1,2,3-Propantriol oder Monoacylglyceriden, gekennzeichnet durch enzymatische Umsetzung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten der allgemeinen Formel I mit einer Dehalogenase und anschließende enzymatische Umsetzung mit einer Epoxid-Hydrolase, wobei die Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v) erfolgen.
Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Lipidsystem einen Wasseranteil zwischen zwischen 0.1 und 10% (v/v), vorzugsweise zwischen 0.1 und 5% (v/v) aufweist.
Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dehalogenase ausgewählt ist aus der Gruppe von HheA aus Arthrobacter sp. AD2, HheA aus Corynebacterium sp. N-1074, HheB aus Mycobacterium sp. GP1, HheC aus Agrobacterium radiobacter AD1 und Dehalogenase B aus Agrobacterium tumefaciens HK7, und vorzugsweise die Halohydrin-Dehalogenase HheA aus Arthrobacter sp. AD2 ist.
Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Epoxid-Hydrolase ausgewählt ist aus der Gruppe von Epoxid-Hydrolase aus Aspergillus niger und Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1, und vorzugsweise die Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1, besonders bevorzugt die Mutante F108A der EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1 ist.
Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure(n) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe der gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Chloratom ist.
Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass wenn der Rest R und der Rest R' beide Reste einer veresterten Fettsäure sind, welche gleich oder verschieden sind, die Umwandlung in 1,2,3-Propantriol oder Monoacylglyceride durch enzymatische Umsetzung mit einer Haloalkan-Dehalogenase, ohne Zusatz einer Epoxid-Hydrolase, erfolgt.
Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-1,2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass wenn beide Reste R und Rest R' Reste veresterter Fettsäuren sind, wobei diese gleich oder verschieden sind, zusätzlich eine Umsetzung mit einer Lipase erfolgt.