DE69936757T2 - Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms Download PDF

Info

Publication number
DE69936757T2
DE69936757T2 DE69936757T DE69936757T DE69936757T2 DE 69936757 T2 DE69936757 T2 DE 69936757T2 DE 69936757 T DE69936757 T DE 69936757T DE 69936757 T DE69936757 T DE 69936757T DE 69936757 T2 DE69936757 T2 DE 69936757T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
immobilized enzyme
reaction
fats
oils
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69936757T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69936757D1 (de
Inventor
Masami Kashima-gun Shimizu
Toshiteru Kashima-gun Komatsu
Masao Kashima-gun Shimizu
Minoru Kashima-gun Kase
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP34682298A external-priority patent/JP3720205B2/ja
Priority claimed from JP35092098A external-priority patent/JP3734972B2/ja
Application filed by Kao Corp filed Critical Kao Corp
Application granted granted Critical
Publication of DE69936757D1 publication Critical patent/DE69936757D1/de
Publication of DE69936757T2 publication Critical patent/DE69936757T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/091—Phenol resins; Amino resins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6454—Glycerides by esterification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Technisches Gebiet
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms, das eine hohe Aktivität mit einem geringen Verlust der Enzymaktivität aufweist, für Hydrolyse von Fetten und Ölen, den Esteraustausch von Fetten und Ölen und Veresterung von aliphatischen Säuren und Alkoholen verwendet wird. Der Ausdruck "Fette und Öle" bedeutet Fett, Öl, Schmalz, Fett usw.
  • Stand der Technik
  • Bei der Hydrolyse von Fetten und Ölen durch ein lipolytisches (oder fett- oder ölzersetzendes) Enzym wird ein immobilisiertes Enzym, hergestellt durch Immobilisieren eines lipolytischen Enzyms auf einem anorganischen oder organischen Träger zur effizienten Verwendung des Enzyms verwendet. Zur Erhöhung des Absorptionsvermögens des Enzyms an einen Träger und zur Verbesserung der Enzymaktivität wurden verschiedene Untersuchungen durchgeführt, und beispielsweise offenbart JP-A-9-257 ein Verfahren zur Erzeugung eines immobilisierten Enzymträgers, hergestellt durch Immobilisieren einer Lipase auf einem anorganischen Träger, der mit einem Silan-Kupplungsmittel mit einer speziellen funktionellen Gruppe behandelt ist, Waschen und Trocknen und durch Imprägnieren mit einer aliphatischen Säure. Selbst durch dieses Verfahren bleibt jedoch die Menge des adsorbierten Enzyms und die Enzymaktivität noch unzureichend.
  • Ein immobilisiertes Enzym, hergestellt durch Immobilisieren eines lipolytischen Enzyms, Lipase genannt, auf einem Träger wird als Enzym hauptsächlich zur Verwendung in Reaktionen für einen Esteraustausch (Esteraustausch oder Umesterung) von Fetten und Ölen und zur Veresterung von aliphatischen Säuren und Alkoholen verwendet. Diese Reaktionen werden vorteilhaft bei möglichst niedrigen Wasserkonzentrationen (1000 ppm oder weniger) durchgeführt, um die Hydrolyse zu inhibieren, und somit wird das immobilisierte Enzym stark getrocknet, so daß nur mehrere Prozent Wassergehalt im Träger vorhanden sind, weil das immobilisierte Enzym hergestellt wird.
  • Das adsorbierte Enzym neigt beim Trocknen des immobilisierten Enzyms zur Inaktivierung, und es gibt viele Fälle, bei denen das Enzym nicht die maximale Aktivität bei der Adsorption entfaltet, wenn das Enzym tatsächlich die Aktivität davon entfaltet.
  • JP-A-62-134090 beschreibt, daß nach der Immobilisierung das immobilisierte Enzym durch Kontakt mit aliphatischen Säurederivaten getrocknet wird, um hierdurch die Aktivität zu erhöhen, aber dieses Verfahren ist weder praktisch noch effizient, weil teure Anlagen zum Trocknen des immobilisierten Enzyms erforderlich sind und es weiterhin kompliziert ist, die Bedingungen für das langsame Trocknen, etc. einzustellen.
  • Unter diesen Umständen ist es gewünscht, daß ein lipolytisches Enzym hergestellt wird, so daß es seine Aktivität ausreichend entfaltet, und zu verhindern, daß das Enzym zurückbleibt (oder entfernt wird) oder inaktiviert wird, wodurch die Menge des für die Lipolyse verwendeten Enzyms reduziert und die Veresterungsreaktion gefördert wird.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Zur Lösung dieses Problems ist es gewünscht, daß eine größere Menge eines lipolytischen Enzyms bei einem Adsorptionsschritt adsorbiert wird, um so seine hohe Aktivität zu entfalten und daß die Atmosphäre zur Förderung der Reaktion um das immobilisierte Enzym herum kreiert wird. Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms für eine Lipolyse (oder Zersetzung von Fetten und ölen), umfassend die Adsorption und Immobilisierung des Enzyms auf einem porösen Anionenaustauschharz als immobilisierender Träger, das mit Fetten und ölen behandelt wird, und das oben beschriebene Problem wurde hierdurch gelöst.
  • Als Ergebnis von intensiven Untersuchungen durch diese Erfinder zur Lösung dieses Problems wurde festgestellt, daß es notwendig ist, einen stabilen Zustand des Enzyms zu halten, das auf dem Träger adsorbiert ist, wofür es effektiv ist, ein Reaktionssubstrat (oder Reaktionsmittel) mit dem Enzym schnell nach der Immobilisierung in Kontakt zu bringen.
  • Das heißt, diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Immobilisieren eines lipolytischen Enzyms auf einem Träger zur Immobilisierung durch Adsorption und, ohne Trocknen, direktes Kontaktieren des immobilisierten Enzyms mit seinem Substrat.
  • Das heißt erfindungsgemäß wird das lipolytische Enzym in einem nicht-getrockneten Zustand nach der Immobilisierung mit seinem Substrat kontaktiert unter Erhalt des immobilisierten Enzyms mit einem höheren Adsorptionsgrad und höherer Aktivität.
  • Diese Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzym an, umfassend folgende Schritte:
    Immobilisieren eines lipolytischen Enzyms auf ein poröses Anionenaustauschharz für einen Träger durch Adsorption und, ohne Trocknen, direktes Kontaktieren des immobilisierten Enzyms mit Fetten und Ölen oder einem Derivat von Fetten und Ölen, worin der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms 20 Gew.% oder mehr ist.
  • Das Verfahren kann weiterhin bevorzugt die Behandlung des Trägerharzes mit einer lipophilen (oder fett- und/oder öllösenden) aliphatischen Säure oder einem Derivat einer lipophilen aliphatischen Säure vor dem Immobilisierungsschritt umfassen.
  • Das immobilisierte Enzym kann mit Fetten und Ölen behandelt werden, und das erhaltene immobilisierte Enzym ist zur Hydrolyse verwendbar.
  • Alternativ kann das immobilisierte Enzym mit dem Derivat von Fetten und Ölen behandelt werden, und das erhaltene immobilisierte Enzym ist zur Veresterung verwendbar.
  • Das verwendete Enzym ist bevorzugt Lipase. Dieses immobilisierte Enzym, wie oben definiert, kann zur Hydrolyse oder Veresterung von Fetten und Ölen oder einem Derivat von Fetten und Ölen, zum Beispiel Hydrolyse von Fetten und Ölen, Veresterung von Derivaten von Fetten und Ölen wie Teilglyceriden, Glycerin und einer aliphatischen Säure verwendet werden.
  • Bei der Veresterung und Hydrolyse können die Reaktionssubstrate Fette und Öle wie Triglyceride oder ein Derivat von Fetten und Ölen sein. Das Derivat von Fetten und Ölen kann eine aliphatische Säure, Glycerin oder Teilglycerid wie Monoglycerid und Diglycerid sein.
  • Gemäß dieser Erfindung kann das immobilisierte Enzym mit dem Reaktionssubstrat für die Hydrolyse oder Veresterung behandelt werden, mit dem unmittelbar die Reaktion durchgeführt wird. Alternativ kann das immobilisierte Enzym nach der Behandlung mit Fetten und ölen oder einem Derivat von Fetten und ölen gelagert werden.
  • Beste Art zur Durchführung der Erfindung
  • Der erfindungsgemäß verwendete Träger ist ein poröser Anionenaustauschträger. Der Teilchendurchmesser des Harzes ist wünschenswert 400 bis 1000 μm, und der Porendurchmesser ist wünschenswert 100 bis 1500 Å.
  • Die Harzmaterialien umfassen solche auf Phenolformaldehyd-, Polystyrol-, Acrylamid- und Divinylbenzol-Basis. Insbesondere ist ein Harz auf Phenolformaldehyd-Basis gewünscht (z.B. Warenname: Duolite A-568). Seine Poren geben eine große Oberfläche für die Adsorption des Enzyms, unter Erhalt einer größeren Adsorptionsmenge.
  • Erfindungsgemäß wird der Träger bevorzugt mit einer lipophilen aliphatischen Säure oder einem lipophilen aliphatischen Säurederivat für die Vorbehandlung vor der Immobilisierung behandelt, wodurch ein Zustand der Adsorption kreiert wird, unter Entfaltung einer hohen Aktivität. Die lipophile aromatische Säure oder das lipophile aliphatische Säurederivat hat bevorzugt 8 bis 18 Kohlenstoffatome. Beispielsweise umfaßt die aliphatische Säure lineare und gesättigte aliphatische Säuren wie Caprinsäure, Laurinsäure und Myristinsäure, ungesättigte aliphatischen Säuren wie Ölsäure und Linolsäure, aliphatische Hydroxysäuren wie Ricinolsäure oder verzweigte aliphatische Säuren wie Isostearinsäure. Das aliphatische Säurederivat umfaßt Ester zwischen C8-18-aliphatischen Säuren und Verbindungen mit einer Hydroxyl-Gruppe, und Beispiele davon umfassen Monoalkohol- (einwertige oder monovalente Alkohol)-Ester, mehrwertige Alkoholester (Polyol oder polyvalente Alkohole), Phospholipide oder Derivate dieser Ester, an die Ethylenoxid addiert ist. Die Monoalkoholester umfassen Methylester, Ethylester und die polyvalenten Alkoholester umfassen Monoglycerid, Diglycerid und Derivate davon oder Polyglycerinfettsäureester, Sorbitanfettsäureester, Sucrosefettsäureester.
  • Bei dem Verfahren ist es gewünscht, daß jede dieser aliphatischen Säuren und Derivate davon bei normaler Temperatur im flüssigen Zustand vorliegt. Sie können alleine oder kombiniert verwendet werden, um weitere Wirkungen zu verursachen. Es wird berücksichtigt, daß diese Derivate in einem wäßrigen Katalysator chemisch zersetzt sind oder mit einem lipolytischen Enzym hydrolysiert werden, unter Bildung von aliphatischen Säuren.
  • Um diese lipophilen aliphatischen Säuren und Derivate davon mit dem porösen Anionenaustauschharz in Kontakt zu bringen, können sie direkt als solches zu Wasser oder einem organischen Lösungsmittel gegeben werden, oder zur Verbesserung des Dispersionsvermögens werden die lipophilen aliphatischen Säuren oder Derivate davon in einem Lösungsmittel dispergiert und aufgelöst, und dann können sie zum porösen Anionaustauschharz, das in Wasser dispergiert ist, gegeben werden. Das bei diesem Schritt verwendete organische Lösungsmittel umfaßt Chloroform, Hexan, Ethanol. Das Verhältnis der lipophilen aliphatischen Säure oder des Derivates davon zum porösen Anionenaustauschharz ist bevorzugt 0,01 bis 1 Gew.% und insbesondere bevorzugt 0,05 bis 0,5 Gew.-Teile der lipophilen aliphatischen Säure oder des Derivats davon im Vergleich zu 1 Gew.-Teil (Trockengewichtbasis) des porösen Anionaustauschharzes. Die Temperatur für den Kontakt ist 0 bis 100°C, bevorzugt 20 bis 60°C. Die Zeit für den Kontakt kann etwa 5 Minuten bis etwa 5 Stunden sein. Nach dieser Behandlung wird das Harz durch Filtration wiedergewonnen und kann zu diesem Zeitpunkt getrocknet werden. Die Temperatur zum Trocknen ist bevorzugt Raumtemperatur bis 100°C, und das Trocknen kann unter vermindertem Druck durchgeführt werden.
  • Das lipolytische Enzym, das erfindungsgemäß verwendet wird, umfaßt Lipasen, die von Mikroorganismen (Mikroben oder Stämmen) der Art Rizopus, Aspergillus, Chromobacterium, Mucor, Pseudomonas, Geotrichum, Penicillium und Candida abgeleitet sind (oder stammen) ebenso wie tierische Lipasen wie pankreatische Lipase. Für den Erhalt von aliphatischen Säuren mit einem hohen Zersetzungsgrad oder für den Erhalt von Triglyceriden bei einem hohen Veresterungsgrad ist eine Lipase (statistischer Typ) ohne Positionsselektivität bevorzugt, und das Enzym, das von den Mikroorganismen stammt, wird bevorzugt aus dem Genus Pseudomonas und Candida ausgewählt.
  • Für den Erhalt eines teilweisen Glycerides wie Monoglycerid und Diglycerid mit einem hohen Veresterungsgrad ist eine Lipase mit einer Positionsselektivität bevorzugt.
  • Die Temperatur zum Durchführen einer Immobilisierung ist 0 bis 60°C, bevorzugt 5 bis 40°C, weil keine Inaktivierung eines Enzyms auftritt, aber die Temperatur kann in Abhängigkeit von den Eigenschaften des verwendeten Enzyms ausgewählt werden. Der pH der Enzymlösung liegt gut in dem Bereich, solange das Enzym nicht denaturiert wird. Der pH von 3 bis 9 ist gewünscht. Der pH kann ebenfalls gleichermaßen wie die Temperatur in Abhängigkeit von den Enzymeigenschaften bestimmt werden. Der Puffer zum Aufrechterhalten des pHs umfaßt Essigsäurepuffer, Phosphorsäurepuffer und Tris-HCl-Puffer, ist aber nicht hierauf beschränkt.
  • In dem Verfahren zur Immobilisierung gemäß dieser Erfindung ist die Konzentration des Enzyms in einer Enzymlösung wünschenswert die Löslichkeit des Enzym oder weniger und ist eine ausreichende Konzentration angesichts der Immobilisierungseffizienz. Falls erforderlich werden unlösliche Enzyme durch Zentrifugation entfernt und dann kann ein Überstand verwendet werden. Das Verhältnis des Enzyms zum Träger für die Immobilisierung ist 0,05 bis 10 Gew.-Teile und besonders bevorzugt 0,1 bis 5 Gew.-Teile des Enzyms im Vergleich zu 1 Gew.-Teile des Trägers für die Immobilisierung.
  • Um das Enzym mit dem Träger, der wie oben beschrieben behandelt ist, zu kontaktieren, ist es möglich, ein Verfahren zum Dispergieren und Rühren eines Trägers in einer Enzymlösung oder ein Verfahren zum Einführen eines Trägers in einen Packturm (oder eine Packsäule) wie eine Säle, etc. einzuführen und eine Enzymlösung durch Gießen unter Verwendung einer Pumpe usw. zu zirkulieren. Irgendein Verfahren kann verwendet werden.
  • Das Verfahren für diesen Schritt bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms zur Hydrolyse von Fetten und ölen kann das gleiche sein wie bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms für die Veresterungsreaktion.
  • Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsbeispiele zur Herstellung des immobilisierten Enzyms für die Hydrolyse von Fetten und ölen beschrieben.
  • Das Reaktionssubstrat, das erfindungsgemäß verwendet wird und mit dem das immobilisierte Enzym nach der Immobilisierung behandelt wird, umfaßt die Fette und öle wie Rapssamenöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Olivenöl, Talg, Fischöl. Obwohl sie nicht beschränkt sind, werden Fette und öle, die tatsächlich hydrolysiert sind, bevorzugt verwendet.
  • Um die Substrate mit dem immobilisierten Enzym nach der Immobilisierung zu kontaktieren, wird das immobilisierte Enzym durch Filtration von der Enzymlösung nach der Immobilisierung wiedergewonnen, dann wird ein überschüssiger Wassergehalt entfernt und ohne Trocknen wird das immobilisierte Enzym mit Fetten und Ölen als Substrat kontaktiert. Der Wassergehalt im immobilisierten Enzym ist, obwohl er in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Trägers variiert, 20 Gew.% oder mehr und bevorzugt im Bereich von 40 bis 60 Gew.%. Das immobilisierte Enzym kann in einen Packbehälter wie eine Säule eingeführt werden, zum Zirkulieren von Fetten und Ölen durch den Packbehälter mit beispielsweise einer Pumpe, oder das immobilisierte Enzym kann in Fetten und Ölen dispergiert sein. Die Temperatur für den Kontakt ist bevorzugt normale Temperatur bis 60°C, und diese Temperatur kann in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Enzyms ausgewählt werden. Weiterhin kann die Kontaktzeit etwa 2 bis etwa 24 Stunden sein. Nach Beendigung dieses Kontaktes erfolgt eine Filtration zur Wiedergewinnung des immobilisierten Enzyms. Durch diesen Vorgang wird die Reaktionsstelle des immobilisierten Enzyms geeignet für die Hydrolyse. Das immobilisierte Enzym hat nach Durchführung dieser Behandlung eine gute Lagerungsstabilität. Dies liegt vermutlich in der Stabilisierung von Lipase durch Fette und Öle.
  • Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsbeispiele zur Herstellung des immobilisierten Enzyms für die Veresterungsreaktion beschrieben.
  • Das Substrat umfaßt aliphatische C2-22-Säuren. Diese können gesättigt oder ungesättigt sein oder eine lineare Kette neben einer verzweigten Kette und/oder einer konjugierten Doppelbindung, etc. enthalten. Weiterhin kann das Substrat strukturelle Isomere davon enthalten und ist nicht besonders beschränkt. Zur Herstellung von Estern mit einer einzelnen aliphatischen Säurekomponente, Teilglyceriden und/oder Triglyceriden können diese aliphatischen Säuren alleine oder als Mischung von zwei oder mehreren Typen davon verwendet werden. Weiterhin können die aliphatischen Säuren vollständig oder teilweise von einem oder mehreren pflanzlichen Ölen und/oder tierischen Fetten zersetzt sein. Auf der anderen Seite umfassen die Alkohole ein- und zwei- oder mehrwertige C1-22-Alkohole. Als Substrat werden die oben beschriebenen aliphatischen Säuren und Alkohole so kombiniert, daß ein gewünschtes verestertes Produkt erzeugt werden kann, und das Substrat ist nicht auf spezifische Verbindungen beschränkt.
  • Das immobilisierte Enzym nach der Immobilisierung durch Adsorption wird von Wasser ausreichend durch ein physikalisches Verfahren befreit und dann mit dem Substrat kontaktiert, zur Bewirkung der Veresterungsreaktion. Der Wassergehalt im immobilisierten Enzym ist 20 Gew.% oder mehr und bevorzugt im Bereich von 40 bis 60 Gew.%, obwohl dies je nach Art des verwendeten Trägers variiert.
  • Bei der Veresterungsreaktion wird die Reaktion durch Verschiebung unter Dehydratisierung durchgeführt, und daher kann, während die Reaktion durchgeführt wird, der überschüssige Wassergehalt, der im immobilisierten Enzym verbleibt, gleichzeitig durch Verwendung eines Dehydratisierungssystems entfernt werden. Nachdem das lipolytische Enzym durch Adsorption auf einem Träger für die Immobilisierung immobilisiert ist, wird die anfängliche Veresterungsreaktion durch direktes Kontaktieren des immobilisierten Enzyms ohne Trocknen mit dem Substrat durchgeführt, und die Entfernung dieses überschüssigen Wassergehaltes in dieser anfänglichen Veresterungsreaktion erfordert zusätzliche Reaktionszeit, kann aber in deutlich kürzerer Zeit durchgeführt werden als sie beim normalen Durchführen des Trocknen des immobilisierten Enzyms erforderlich ist. Weiterhin sind die Zusammensetzung und die Qualitäten eines Produktes, das bei dieser anfänglichen Reaktion erzeugt wird, keineswegs schlechter als die eines Produktes, das in der zweiten oder späteren Reaktion erzeugt wird. Bei dieser anfänglichen Veresterungsreaktion ist die Zeit, die verstrichen ist bis der Wassergehalt ausreichend ist, damit das Enzym seine Aktivität entfaltet, obwohl dies eine Menge des immobilisierten Enzyms und von der Fähigkeit des verwendeten Dehydratisierungssystems abhängt, üblicherweise eine Stunde oder ähnlich. Weil der überschüssige Wassergehalt in der Anfangsreaktion entfernt wurde, ist die Zeit, die für die Entfernung von Wasser in der anfänglichen Reaktion erforderlich ist, in der zweiten oder späteren Reaktion nicht notwendig, bei der das immobilisierte Enzym für die Veresterungsreaktion erhalten werden kann.
  • Für das Verfahren für die Veresterungsreaktion ist es möglich, irgendwelche Verfahren anzuwenden, die allgemein bekannt sind, wie die Dehydratisierung unter vermindertem Druck, die Glycerin-Dehydratisierung und die Dehydratisierung unter Verwendung eines Dehydratisierungsmittels wie Molekularsiebe. Weiterhin kann das immobilisierte Enzym in einem Rührreaktor, einem Reaktor mit einer gepackten Säule und einem Fließbettreaktor verwendet werden.
  • Gemäß dieser Erfindung wird die maximale Aktivität des adsorbierten Enzyms verursacht und die Veresterungsreaktion kann effizient stabil für eine lange Zeitperiode durchgeführt werden, indem ein stabiler Zustand beim immobilisierten Enzym verursacht und maximal verhindert wird, daß das Enzym aufgrund des Trocknens inaktiviert wird.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • 10 Duolite A-568 (Diamond Shamrock Co., Ltd.) wurden 1 Stunde in 100 cm3 1/10 N NaOH gerührt. Nach der Filtration wurde dies mit 100 cm3 entionisierten Wasser gewaschen und der pH wurde mit 100 cm3 500 mm-Puffer auf Essigsäure-Basis eingestellt (pH 7). Danach wurde der pH zweimal 2 Stunden mit 100 cm3 50 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis (pH 7) eingestellt. Danach wurde der Träger durch Filtration wiedergewonnen und dann 50 cm3 Ethanol 30 Minuten verwendet, um das Lösungsmittel durch Ethanol zu ersetzen. Nach der Filtration wurden 50 cm3 Ethanol mit 10 g Ricinolsäure zugegeben, und die Ricinolsäure wurde 30 Minuten auf dem Träger adsorbiert. Danach wurde der Träger durch Filtration wiedergewonnen und 4-mal 30 Minuten mit 50 cm3 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis (pH 7) gewaschen, zur Entfernung des Ethanols, und der Träger wurde durch Filtration wiedergewonnen. Danach wurde der Träger 5 Stunden mit einer Enzymlösung mit 10 g kommerzieller Lipase (Lipase OF, Meito Sangyo Co., Ltd.), aufgelöst in 90 cm3 50 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis (pH 7) kontaktiert, wodurch das Enzym auf dem Träger immobilisiert wurde. Das immobilisierte Enzym wurde durch Filtration wiedergewonnen und mit 100 cm3 50 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis (pH 7) gewaschen, zum Waschen des Enzyms und Proteins, die nicht immobilisiert sind. Danach wurden 40 g Sojabohnenöl, das tatsächlich zersetzt werden sollte, zugegeben und 12 Stunden gerührt. All diese Vorgänge wurden bei 20°C durchgeführt. Danach wurde das immobilisierte Enzym durch Filtration vom Öl getrennt. Der Immobilisierungsgrad, gemessen durch den Unterschied zwischen der Restaktivität der Enzymlösung nach der Immobilisierung und der Aktivität der Enzymlösung vor der Immobilisierung war 82 %. Dies ist etwa 20 % höher als der Immobilisierungsgrad durch das konventionelle Verfahren.
  • 2,8 g (1 g auf Trockengewichtsbasis) des immobilisierten Enzyms, das somit erhalten wurde, wurden genau in einem 50 cm3 Erlenmeyer-Kolben gewogen, der mit einer Schraube ausgerüstet war. 10 g Sojabohnenöl und 6 g destilliertes Wasser wurden zugegeben und konnten unter Schütteln bei 200 Upm bei 40°C reagieren. 30 Minuten nach Initiierung der Reaktion war der Zersetzungsgrad 83 %. In der zweistündigen Reaktion erreichte der Zersetzungsgrad 97 %. Als Zersetzungsgrad wird ein Wert als Prozentsatz ausgedrückt, erhalten durch Dividieren des Säurewertes (AV) durch den Verseifungswert (SV). Diese Zersetzungsrate ist der höchste Wert unter denen des immobilisierten Enzyms, hergestellt in den oben angegebenen Verfahren.
  • Beispiel 2
  • Nach Beendigung der Reaktion entsprechend dem in Beispiel 1 gezeigten Verfahren wurde die Gesamtmenge des immobilisierten Enzyms wiedergewonnen, und die Reaktion wurde mit den anfänglich zugegebenen Zusammensetzungen gemäß Beispiel 1 wiederholt. Die Reaktion wurde 5-mal wiederholt, und 2 Stunden nach Initiierung der Reaktion wurden Zersetzungsgrade von 97,0 %. 97,2 %, 96,5 %, 96,8 % und 96,5 % erhalten.
  • Beispiel 3
  • 10 g Duolite A-568 (Diamond Shamrock Co., Ltd.) wurden 1 Stunde in 100 cm3 1/10 N NaOH gerührt. Nach der Filtration wurde dies mit 100 cm3 entionisiertem Wasser gewaschen und der pH wurde mit 100 cm3 500 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis (pH 7) eingestellt. Danach wurde der pH zweimal 2 Stunden mit 100 cm3 50 mM Acetatpuffer (pH 7) eingestellt. Danach wurde der Träger durch Filtration wiedergewonnen und dann wurden 50 cm3 Ethanol 30 Minuten verwendet, um das Lösungsmittel durch Ethanol zu ersetzen. Nach der Filtration wurden 50 cm3 Ethanol mit 10 g Ricinolsäure zugegeben und die Ricinolsäure wurde auf dem Träger 30 Minuten lang adsorbiert. Danach wurde der Träger durch Filtration wiedergewonnen und 4-mal 30 Minuten mit 50 cm3 50 mM-Puffer auf Essigsäurebasis (pH 5) gewaschen, zur Entfernung des Ethanols, und der Träger wurde durch Filtration wiedergewonnen. Danach wurde der Träger 5 Stunden mit einer Enzymlösung mit 10 g kommerzieller Lipase (Li Lipase, Nagase Sangyo Co., Ltd.), aufgelöst in 90 cm3 50 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis (pH 7), kontaktiert, wodurch das Enzym auf dem Träger immobilisiert wurde. Das immobilisierte Enzym wurde durch Filtration wiedergewonnen und mit 100 cm3 50 mm-Puffer auf Essigsäure-Basis (pH 7) gewaschen, zum Waschen des Enzyms und des Proteins, das nicht immobilisiert war. Alle Vorgänge wurden bei 20°C durchgeführt. Der Immobilisierungsgrad, gemessen durch den Unterschied zwischen der Restaktivität der Enzymlösung nach der Immobilisierung und der Aktivität der Enzymlösung vor der Immobilisierung war 98 %.
  • Dann wurden 100 g aliphatische Säure, gebildet durch Zersetzung von Sojabohnenöl zugegeben und gut gerührt, und 16 g Glycerin wurden zugegeben und die Veresterungsreaktion wurde unter vermindertem Druck (13 Pa oder weniger) bei 40°C durchgeführt.
  • Die DG (Diglycerid)-Ausbeute (Diglycerid-Gehalt + Triglycerid-Gehalt) im Reaktionsöl erreichte in 4 Stunden der Reaktion 63 %. Nach dieser Reaktion wurde das Öl nach der Reaktion durch Filtration getrennt, zur Wiedergewinnung der gesamten immobilisierten Enzyms, und 100 g der Sojabohnenzersetzten aliphatischen Säure und 16 g Glycerin wurden zugegeben, und die gleiche Reaktion wurde noch zweimal durchgeführt. Als Ergebnis war die DG-Ausbeute im Öl nach der Reaktion 62 % innerhalb von 2 Stunden bei jeder zweimal durchgeführten Reaktion. Bei der oben beschriebenen wiederholten Reaktion ist die Zusammensetzung der Komponenten im Reaktionsöl bei der Reaktion bei einer DG-Ausbeute von etwa 62 % in Tabelle 1 gezeigt.
  • Vergleichsbeispiel 1
  • Das immobilisierte Enzym, hergestellt in Beispiel 3, wurde bei 40°C unter vermindertem Druck (133 Pa oder weniger) einen gesamten Tag und Nacht in der Abwesenheit einer Sojabohnenölzersetzten aliphatischen Säure, gezeigt in Beispiel 3, getrocknet. Der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms nach dem Trocknen war etwa 2 %. Unter Verwendung von 10 g dieses immobilisierten Enzyms wurde die Veresterungsreaktion dreimal auf gleiche Weise wie bei Beispiel 3 wiederholt. Als Ergebnis war die DG-Ausbeute bei jeder Reaktion 62 bis 63 % in 3-stündiger Reaktion. Bei der oben beschriebenen wiederholten Reaktion ist die Zusammensetzung der Komponenten im Reaktionsöl aufgrund der Reaktion bei einer DG-Ausbeute von 62 % in Tabelle 1 gezeigt.
  • Figure 00160001
  • Der Anteil der Komponenten im Öl nach der Reaktion in den obigen Beispielen ist ein Ergebnis, erhalten durch Analyse der Probe mit Gaschromatographie nach Trimethylsilylierung.
  • Der Vergleich zwischen Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 1 ergab, daß dann, wenn die Reaktion ohne Trocknen des immobilisierten Enzyms gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wurde, die Reaktionszeit vermindert werden kann, während die Qualitäten des Produktes nicht beeinträchtigt werden. Ein Vergleich zwischen den Veresterungsaktivitäten der jeweiligen Enzyme zeigt, daß das mit dem Reaktionssubstrat behandelte Enzym eine 150%ige Aktivität (verglichen mit dem getrockneten Enzym) entfaltet.

Claims (5)

  1. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms, umfassend folgende Schritte: Immobilisieren eines lipolytischen Enzyms auf ein poröses Anionenaustauschharz für einen Träger durch Adsorption und, ohne Trocknen, direktes Kontaktieren des immobilisierten Enzyms mit Fetten und Ölen oder einem Derivat von Fetten und Ölen, worin der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms 20 Gew.% oder mehr ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Behandlung des Trägerharzes mit einer lipophilen aliphatischen Säure oder einem Derivat einer lipophilen aliphatischen Säure vor dem Immobilisierungsschritt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das immobilisierte Enzym mit Fetten und Ölen kontaktiert wird und das erhaltene immobilisierte Enzym zur Hydrolyse verwendbar ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das immobilisierte Enzym mit dem Derivat von Fetten und Ölen kontaktiert wird und das erhaltene immobilisierte Enzym zur Veresterung verwendbar ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Enzym Lipase ist.
DE69936757T 1998-12-07 1999-12-07 Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms Expired - Lifetime DE69936757T2 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP34682298A JP3720205B2 (ja) 1998-12-07 1998-12-07 部分グリセライドの製造方法
JP34682298 1998-12-07
JP35092098A JP3734972B2 (ja) 1998-12-10 1998-12-10 固定化酵素の調製方法
JP35092098 1998-12-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69936757D1 DE69936757D1 (de) 2007-09-20
DE69936757T2 true DE69936757T2 (de) 2008-04-30

Family

ID=26578369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69936757T Expired - Lifetime DE69936757T2 (de) 1998-12-07 1999-12-07 Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms

Country Status (3)

Country Link
US (1) US6716610B2 (de)
EP (1) EP1008647B1 (de)
DE (1) DE69936757T2 (de)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7141399B2 (en) * 2002-01-15 2006-11-28 Kao Corporation Process for the production of diglycerides
BR0302166A (pt) 2002-07-02 2004-09-08 Kao Corp Processo para preparação de enzima imobilizada
BR0303436A (pt) * 2002-09-06 2004-09-08 Kao Corp Processo de regenaração de enzima imobilizada
JP4220957B2 (ja) * 2004-11-12 2009-02-04 花王株式会社 固定化酵素の製造方法
JP4694938B2 (ja) * 2005-10-06 2011-06-08 花王株式会社 脂肪酸類の製造方法
JP4694939B2 (ja) * 2005-10-06 2011-06-08 花王株式会社 脂肪酸類の製造方法
KR101297957B1 (ko) * 2005-10-06 2013-08-19 카오카부시키가이샤 고정화 리파아제를 사용하는 효소가수분해법 공정 및고온고압가수분해법 공정을 포함하는 유지로부터의지방산류 제조를 위한 2-단계 과정
US9828597B2 (en) 2006-11-22 2017-11-28 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Biofunctional materials
US8367389B2 (en) 2009-09-11 2013-02-05 Regents Of The University Of Minnesota Methods, compositions and devices utilizing structurally stable cyanuric acid hydrolase
US10988714B2 (en) 2010-06-21 2021-04-27 Regents Of The University Of Minnesota Methods of facilitating removal of a fingerprint from a substrate or a coating
US11015149B2 (en) 2010-06-21 2021-05-25 Toyota Motor Corporation Methods of facilitating removal of a fingerprint
US9388370B2 (en) 2010-06-21 2016-07-12 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Thermolysin-like protease for cleaning insect body stains
US9121016B2 (en) 2011-09-09 2015-09-01 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains
US8796009B2 (en) 2010-06-21 2014-08-05 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains
US10233437B2 (en) 2015-03-02 2019-03-19 Regents Of The University Of Minnesota Hypochlorite resistant cyanuric acid hydrolases and methods of use thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5292649A (en) * 1983-03-29 1994-03-08 Agency Of Industrial Science & Technology, Ministy Of International Trade & Industry Method for reaction of lipase upon fatty acid
JPH066058B2 (ja) 1985-12-07 1994-01-26 不二製油株式会社 酵素剤の製造法
EP0320132B1 (de) 1987-12-09 1995-06-21 Kao Corporation Immobilisiertes Enzym und Veresterung und Zwischenveresterung mit demselben
US5177013A (en) 1989-07-31 1993-01-05 Ajinomoto Co., Inc. Preparation of an immobilized lipase having a low water content without drying
JPH09257A (ja) 1995-06-16 1997-01-07 Toyo Denka Kogyo Kk 固定化酵素担体及びその製造方法
JP3720194B2 (ja) * 1998-07-09 2005-11-24 花王株式会社 部分グリセリドの製造法
US6258575B1 (en) 1998-11-26 2001-07-10 Kao Corporation Hydrolyzing fats and oils using an immobilized enzyme column and substrate-feeding chamber that separates phases

Also Published As

Publication number Publication date
US20030096383A1 (en) 2003-05-22
EP1008647A2 (de) 2000-06-14
EP1008647A3 (de) 2002-07-24
US6716610B2 (en) 2004-04-06
EP1008647B1 (de) 2007-08-08
DE69936757D1 (de) 2007-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69936757T2 (de) Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms
DE2946565C2 (de)
DE3430944C2 (de)
DE60032337T2 (de) Lipasekatalysierte veresterung von fischoelen
DE3519429A1 (de) Verfahren zur umesterung von fetten und oelen und enzympraeparat
CN102010786A (zh) 甘油酯组合物及其制备方法
EP1838861B1 (de) Herstellung von monoglyceriden aus triglyceriden durch alkoholyse unter verwendung der thermomyces lanuginosus lipase, welche durch alkalische salze aktiviert wird
DE3545056C2 (de)
DE102008063711A1 (de) Verfahren zum Erzeugen von Biodiesel mit verbesserten Filtrationseigenschaften und entsprechend erzeugter Biodiesel
DE3428576C2 (de)
CN100347295C (zh) 固定化酶的制造方法
DE102012103423A1 (de) Verbessertes Verfahren der Enzym-Interveresterung
EP2272954A1 (de) Verfahren zur herstellung immobilisierter enzyme
DE60306055T2 (de) Verfahren zur Regeneration eines immobilisierten Enzyms
EP1931794B1 (de) Zweistufiges verfahren zur herstellung von fettsäuren
JP4220957B2 (ja) 固定化酵素の製造方法
DE10054480A1 (de) Verfahren zur Gewinnung von 12-Hydroxystearinsäure
JP3929890B2 (ja) ジグリセリドの製造方法
JP4012117B2 (ja) 固定化酵素の製造方法
JPH0710233B2 (ja) 固定化酵素およびその製造方法
JP2019054738A (ja) 脂肪酸類の製造方法
DE3815961A1 (de) Verfahren zur enzymatischen umesterung bei einem geringen wassergehalt
JP3720205B2 (ja) 部分グリセライドの製造方法
EP0770685B1 (de) Verfahren zur Herstellung von trans-2, cis-4-Decadiensäureethylester
JP4971018B2 (ja) 分岐脂肪酸を有するジアシルグリセロール含有油脂の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition