DE3428576C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umesterung von Fetten, die Glyceride enthalten, zum Ersatz eines Fettsäurerestes eines Glycerids durch einen anderen Fettsäurerest in Gegenwart von Lipase als Umesterungskatalysator und in Gegenwart von Wasser.

Verfahren zur Umesterung von Fetten, bei denen ein Fettsäurerest eines Glycerids durch einen anderen Fettsäurerest ersetzt wird, sind bereits bekannt. So ist beispielsweise die Umesterung in Gegenwart von Alkalimetallen oder deren Alkylaten oder Hydroxiden als Umesterungskatalysator ebenso bekannt wie die Verwendung von Lipase als Umesterungskatalysator (vgl. JP-A 1 04 506/1977, JB-B 6 480/1982, 27 159/1982 und 28 519/1982).

Die erstgenannten Katalysatoren haben den Nachteil, daß sie zu unspezifisch sind, d. h. bei ihrer Verwendung ist es nicht möglich, an spezifischen Stellen der Glyceride eine Umesterung durchzuführen. Der zuletzt genannte Katalysator erlaubt zwar eine spezifische Umesterung, er hat jedoch den Nachteil, daß er in der bisher eingesetzten Form bei der katalytischen Umesterung verhältnismäßig schnell desaktiviert wird. Das gilt nicht nur dann, wenn die Lipase in freier Form als Katalysator eingesetzt wird, wie in EP-A 00 79 986 beschrieben, sondern auch dann, wenn die Lipase an einen Träger gebunden ist, wie in DE-C 27 05 608 beschrieben.

Die zuerst genannte Druckschrift betrifft ein Verfahren zur Modifizierung eines Fettes oder Öls, bei dem ein Gemisch aus dem Ausgangsfett oder -öl und einer Fettsäure einer selektiven Umesterung unterworfen wird in Gegenwart eines selektiven Umesterungskatalysators, bei dem es sich um Lipase handelt, die aus Mikroorganismen bestimmter Stämme gewonnen wurde. Von der Verwendung von Lipase und Wasser enthaltenden Mikroorganismenzellen selbst als Katalysator bei der Umesterung ist in dieser Druckschrift nicht die Rede.

Aus der letztgenannten Druckschrift ist ein Verfahren zur Umlagerung von Fettsäureresten in Fettsäurereaktionsteilnehmern, die ein Glyceridöl oder -fett umfassen, bekannt, bei dem die Umesterung in Gegenwart von Lipase als Umesterungskatalysator und in Gegenwart von Wasser, das bis zu 10% im Reaktionsgemisch vorhanden ist, durchgeführt wird. Zur Durchführung dieses bekannten Verfahrens wird als Katalysator eine immobilisierte Lipase verwendet, die durch Adsorbieren an Celite als Träger hergestellt worden ist. Auch in dieser Druckschrift ist von der Verwendung von Mikroorganismenzellen, die Lipase und Wasser enthalten, als Umesterungskatalysator keine Rede.

Aus "Agric. Biol. Chem.", 1982, Seiten 2885-2993, ist es bereits bekannt, daß Lipase durch Verwendung eines Induktionsmittels in bestimmten Mikroorganismen, nämlich S. lipolytica, gebildet werden kann. Die dabei erhaltene solubilisierte zellgebundene Lipase wurde auf ihre Hydrolyseaktivität untersucht. Von der Verwendung getrockneter Mikroorganismen, die Lipase zusammen mit Wasser enthalten, als Katalysatoren bei Umesterungsreaktionen ist auch in diesem Falle nicht die Rede.

Aufgabe der Erfindung war es daher, einen Umesterungskatalysator zu finden, der die Nachteile der bekannten Umesterungskatalysatoren nicht aufweist, d. h. die Umesterungsreaktion an spezifischen Stellen des Fettmoleküls katalysiert und diese katalytische Wirkung über einen langen Zeitraum hinweg unverändert beibehält.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß als Umesterungskatalysator nicht Lipase selbst in gereinigter Form oder in einer an einem Träger fixierten Form eingesetzt wird, sondern als Umesterungskatalysator getrocknete Mikroorganismenzellen verwendet werden, die Lipase enthalten und einen Wassergehalt von 1 bis 20 Gew.-% aufweisen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Umesterung von Fetten, die Glyceride enthalten, zum Ersatz eines Fettsäurerestes eines Glycerids, durch einen Fettsäurerest in Gegenwart von Lipase als Umesterungskatalysator und in Gegenwart von Wasser, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Umesterungskatalysator in Form von getrockneten Mikroorganismenzellen, die Lipase enthalten und einen Wassergehalt von 1 bis 20 Gew.-% aufweisen, in das umzuesternde Gemisch einbringt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich gegenüber den bekannten Arbeitsweisen, wie sie beispielsweise aus DE-C 27 05 608 und EP-A 00 79 986 bekannt sind, die folgenden, auch für den Fachmann auf diesem Gebiet nicht vorhersehbaren technischen Vorteile erzielen:

• (a) da die Lipase innerhalb der getrockneten Organismenzellen durch das umgebende Zellgewebe und das Wasser in den Zellgeweben geschützt ist, ist die Geschwindigkeit der Inaktivierung der Lipase während der Umesterungsreaktion gering, und die getrockneten Mikroorganismenzellen können über lange Zeiträume hinweg als wirksamer Katalysator für die Umesterungsreaktion verwendet werden;
• (b) durch Erhöhung des Wassergehaltes der getrockneten Mikroorganismenzellen kann die Enzymaktivität leicht erhöht werden;
• (c) bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Geschwindigkeit der Umesterungsreaktion zwei- bis fünfmal höher als bei der üblichen Verfahrensweise, bei der die gleiche Anzahl von Lipase-Einheiten verwendet wird;
• (d) eine Abnahme der katalytischen Reaktion ist nicht festzustellen, selbst wenn die Umesterung in einem Lösungsmittel wie Hexan durchgeführt wird; und
• (e) die erfindungsgemäß eingesetzten getrockneten Mikroorganismenzellen sind unempfindlich gegen Änderung des pH-Wertes und der Temperatur bei Durchführung der Umesterungsreaktion.

Bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 12.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Zeichnung (Fig. 1) näher erläutert, die in graphischer Darstellung die Änderung der Reaktionsausbeute in Abhängigkeit von der Reaktionszeit bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens (Beispiele 3 und 4) im Vergleich zur bekannten Arbeitsweise (Vergleichsbeispiel) zeigt.

Erfindungsgemäß wird ein übliches tierisches Fett, pflanzliches Fett oder synthetisches Öl als Fett verwendet. Typische Beispiele für ein derartiges Fett oder Öl sind beispielsweise Olivenöl, Palmöl, Sheabutter, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Rindertalg, Speck und Fischtalg.

Die erfindungsgemäß brauchbare Fettsäure ist eine Fettsäure mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen eines natürlichen Produkts. Typische Beispiele für derartige Fettsäuren sind beispielsweise Stearinsäure, Palmitinsäure, Ölsäure und Linolsäure. Wenn eine Fettsäure mit hoher Kohlenstoffatomzahl, die einen hohen Schmelzpunkt von 60 bis 80°C aufweist, verwendet wird, kann als Lösungsmittel zur Auflösung der Fettsäure ein Kohlenwasserstoff wie Hexan oder Heptan; ein Äther wie Ethyläther oder Propyläther; ein Ester wie Methylacetat oder Ethylacetat; Benzol oder Aceton verwendet werden. Die erfindungsgemäß verwendeten getrockneten Mikroorganismenzellen verlieren ihre Aktivität nicht und können als Katalysator in dem vorstehend als Beispiel angegebenen Lösungsmittel wirken.

Die erfindungsgemäß verwendeten getrockneten Mikroorganismenzellen werden aus beliebigem Lipase erzeugenden Mikroorganismen hergestellt. Typische Beispiele für einen derartigen erfindungsgemäß brauchbaren Mikroorganismus sind beispielsweise Mikroorganismen, die dem Genus Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Candida und Geotrichum angehören.

Zur Erzielung der Reaktion des als Beispiele angegebenen als Katalysator wirksamen Mikroorganismus ist es wichtig, den Mikroorganismus derart zu kultivieren, daß der Mikroorganismus eine große Lipasemenge in seinem Körper enthält, und den kultivierten Mikroorganismus derart zu trocknen, daß die Lipase in dem Mikroorganismus leicht mit den Fettsäuren in Kontakt kommen kann.

Die erfindungsgemäß verwendeten getrockneten Mikroorganismenzellen, die auf die Beschleunigung der Umesterungsreaktion wirken und die Reaktionsgeschwindigkeit während langer Zeit konstant hoch halten, können erhalten werden durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der Lipase enthält, wobei zu Beginn oder während der Kultivierung ein Glycerid oder eine Fettsäure als Induktor zur Induktion von Lipase, zu 1 bis 80 Gew.-%, in die Kulturlösung gegeben wird, der erhaltene Mikroorganismus mit einem wasserlöslichen Lösungsmittel gewaschen wird und der Mikroorganismus dann bis auf einen Wassergehalt von 1 bis 20 Gew.-% getrocknet wird.

Bei der vorstehenden Kultivierung können Mono-, Di- oder Triglyceride, Fettsäuren mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen oder die Ester davon als Induktor zur Induktion von Lipase verwendet werden. Unter diesen werden Triolein (Olivenöl), Diolein, Monoolein, Ölsäure und Linolsäure, die ihre Form zu flüssigem Zustand bei üblicher Kulturtemperatur (20 bis 40°C) ändern, bevorzugt verwendet. Die zugesetzte Menge des Induktors liegt zweckmäßig so, daß eine Konzentration von 1 bis 80 Gew.-% in der Kulturlösung erzielt wird. Wenn die zugesetzte Menge des Induktors nicht mehr als 1 Gew.-% beträgt, so wird der Lipasegehalt in dem Körper des Mikroorganismus verringert, und die Geschwindigkeit der Umesterungsreaktion wird sehr niedrig. Wenn die zugesetzte Menge des Induktors 1 Gew.-% überschreitet, so beginnt der Lipasegehalt in dem Körper des Mikroorganismus plötzlich anzusteigen und zeigt einen maximalen Lipasegehalt bei einer Induktormenge von 5 bis 10 Gew.-%. Wenn die Menge des Induktors weiter vergrößert wird auf mehr als 40 bis 50 Gew.-%, so bildet das Kultursystem eine W/O-Emulsion, und die Mikroorganismen vervielfältigen sich in Wassertröpfchen und akkumulieren Lipase in ihrem Körper. Die Aktivität der Lipase, die in dem Mikroorganismus enthalten ist, der durch Kultivierung der vorstehend erwähnten W/O-Emulsion erhalten wird, ist noch hoch, und der Mikroorganismus kann in ausreichender Menge zur Umesterungsreaktion verwendet werden. Wenn jedoch die Induktormenge nicht weniger als 80 Gew.-% ist, so wird die Ausbeute an Trockenzellen verringert, da die Kulturlösung verringert wird und sie ist daher nicht für die praktische Anwendung geeignet.

Die Aktivität (der Gehalt) an Lipase in dem Körper des Mikroorganismus ändert sich stark mit der Kultivierungszeit, und es ist notwendig, die Kultivierung zu einem Zeitpunkt zu beenden, wenn die Aktivität einen maximalen Wert erreicht hat. Die den maximalen Aktivitätspeak zeigende Zeit stimmt fast mit der Zeit überein, bei der eine Nährstoffquelle, insbesondere die Kohlenstoffquelle, vollständig verbraucht ist. Daher ist es günstig, die Kultivierung des Mikroorganismus zu stoppen, wenn die Nährstoffquelle verbraucht ist, und die Autolyse des Mikroorganismus beginnt.

Als eine Methode zur Entfernung von Wasser aus dem so erhaltenen Mikroorganismus kann der Mikroorganismus bei einer Temperatur getrocknet werden, die derart liegt, daß in der Regel die Aktivität nicht verloren geht (nicht mehr als 40 bis 60°C).

Wenn jedoch das Wasser einfach verdampft wird, so erfolgt eine Schrumpfung des Zellgewebes, wodurch der Mikroorganismus sehr hart wird und der Kontakt zwischen der Lipase in den Zellgeweben und den Substraten aus den Zellgeweben verhindert wird, und sich die Aktivität der Lipase daher nicht entfalten kann. Wenn dementsprechend der Mikroorganismus getrocknet wird, so ist es notwendig, eine Trocknungsmethode anzuwenden, bei der die Zellgewebe nicht schrumpfen. Zu diesem Zweck wird der Mikroorganismus in ein wasserlösliches Lösungsmittel eingetaucht, beispielsweise in Aceton oder einem niedrigen Alkohol, wie Methylalkohol, Ethylalkohol oder Isopropylalkohol, um das Innere des Zellgewebes durch das Lösungsmittel zu ersetzen, worauf das Lösungsmittel unter Bildung einer Trockenzelle verdampft wird, die an der Schrumpfung der Zellgewebe gehindert wird. In diesem Falle ist als Trocknungsmethode eine Vakuumtrocknung bevorzugt. Wenn dagegen die Verwendung eines Lösungsmittels nicht günstig ist, so kann eine Gefriertrocknung angewendet werden.

Darüber hinaus kann die Schrumpfung des Zellgewebes weiter dadurch verhindert werden, daß die Gewebe durch Eintauchen des Mikroorganismus in eine wäßrige Glutaraldehydlösung mit einer Konzentration von weniger als 5 Gew.-% fixiert wird, bevor er in das Lösungsmittel eingetaucht wird, wodurch eine günstigere Trockenzelle hergestellt werden kann. Wenn die Konzentration der wäßrigen Glutaraldehydlösung nicht weniger als 5 Gew.-% beträgt, wird der Grad der Vernetzung zu groß, und die Geschwindigkeit der Umesterungsreaktion wird verringert, weshalb die Konzentration vorzugsweise weniger als 5 Gew.-% beträgt.

Es ist notwendig, den kultivierten Mikroorganismus derart zu trocknen, daß der Wassergehalt 1 bis 20 Gew.-% in dem Mikroorganismus beträgt, was vom Gesichtspunkt der Inhibierung der Hydrolysereaktion her geschieht. Wenn der Wassergehalt nicht weniger als 20 Gew.-% beträgt, so überwiegt die Hydrolyse vor der Umesterungsreaktion, und die hydrolysierten Produkte, wie Diglycerid, Monoglycerid und Glycerin, nehmen einen größeren Teil der Gesamtprodukte ein. Im Gegensatz hierzu ist der Wassergehalt vorzugsweise so gering wie möglich, so daß die untere Grenze nicht notwendigerweise eingehalten werden muß. Bei einer üblichen Trocknungsmethode jedoch kann der Wassergehalt nicht unter den Gleichgewichts-Wassergehalt des Trocknungsmaterials absinken. In diesem Sinne ist es schwierig, den Mikroorganismus unter Vakuumbedingungen bei Raumtemperatur derart zu trocknen, daß der Wassergehalt nicht mehr als 1 Gew.-% beträgt. Die nach der Methode wie vorstehend beschrieben hergestellten Trockenzellen weisen im allgemeinen einen Wassergehalt von 1 bis 5 Gew.-% auf. Die Steuerung des Wassergehalts kann leicht durch Variieren der Trocknungstemperatur erzielt werden.

Die zu den Reaktionskomponenten (einem Gemisch von Glyzerid und Fettsäure) zugesetzte Menge der so hergestellten Trockenzelle, zur Bildung einer Suspension, ist vorzugsweise eine derartige Menge, daß ein Wassergehalt des Reaktionssystems (ein Gemisch von Glyzerid, Fettsäure und Trockenzelle) von 0,1 bis 10 Gew.-% erzielt wird. Wenn die Menge nicht mehr als 0,1 Gew.-% beträgt, so ist die Lipasemenge in dem Reaktionssystem gering, und die Reaktionsgeschwindigkeit wird verringert, wodurch das Verfahren für die praktische Verwendung nicht geeignet ist. Wenn die Menge nicht weniger als 10 Gew.-% beträgt, so wird die Reaktionsgeschwindigkeit sicher beschleunigt, jedoch wird auch die Viskosität des Reaktionssystems erhöht, so daß der Mischungszustand verschlechtert wird und die Reaktion nicht im Ausmaß zu der zugesetzten Menge beschleunigt wird, und weiter der Trennvorgang zur Gewinnung der Trockenzelle nach der Reaktion erschwert wird. Die zugesetzte Menge ist bevorzugter eine derartige Menge, daß ein Wassergehalt des Reaktionssystems von 1 bis 5 Gew.-% erzielt wird, was im Hinblick auf die Reaktionsgeschwindigkeit und den Betrieb erfolgt.

Bei einer üblichen Verfahrensweise, bei der das Enzym an den Träger adsorbiert ist, kann die Hydrolyse nicht unterdrückt werden, wenn der Wassergehalt in dem Reaktionssystem nicht unter 1 Gew.-% gesteuert wird. Im Gegensatz hierzu hat es sich gezeigt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren die Umesterungsreaktion mit hoher Geschwindigkeit durchgeführt werden kann, wobei die Hydrolyse fast vollständig unterdrückt wird, selbst in einem Reaktionssystem mit einem Wassergehalt von mehr als 1 Gew.-%. Dies bedeutet, daß angenommen werden kann, daß, obwohl der scheinbare Wassergehalt in der Lipase in der Trockenzelle groß ist, die Wassermenge, die an der Reaktion teilnimmt, beträchtlich geringer ist als der scheinbare Wassergehalt. Es ist nicht klar, in welcher Form das Wasser, das an der Reaktion nicht teilnimmt, in der Trockenzelle vorhanden ist, jedoch wird angenommen, daß das Wasser an einer Stabilisierung sowie an einer Aktivierung des Enzyms teilnimmt, da die Inaktivierungsrate des Enzyms Lipase in der erfindungsgemäß verwendeten Trockenzelle darüber hinaus geringer ist als bei üblichen Methoden, und die Trockenzelle zufriedenstellend während langer Zeiträume verwendet werden kann. Es ist wesentlich, daß ein Enzym ein biogener Katalysator ist und Eigenschaften aufweist, die in milden Umgebungen wirken, und leicht seine Aktivität in radikalen Umgebungen verlieren kann. Darüber hinaus ist die Reaktivierung eines bereits inaktivierten Enzyms schwierig. Insbesondere liegt bei einem Öl-Wasser-Phasensystem, wie es bei der vorliegenden Umesterungsreaktion auftreten kann, das Enzym unter Bedingungen vor, bei denen es ständig in Kontakt mit der Ölphase und somit unter strikten Umgebungsbedingungen ist. Gerade in einem derartigen Fall ist es wichtig, ob die Enzymaktivität lange beibehalten werden kann oder nicht. Das erfindungsgemäße Verfahren ist in dieser Hinsicht zufriedenstellend.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens können wie folgt zusammengestellt werden:

• (1) Da die Lipase in der Trockenzelle von den Zellgeweben und dem Wasser in den Geweben geschützt wird, ist die Geschwindigkeit der Inaktivierung der Lipase gering, und die Trockenzelle kann während langer Zeit zur Umesterungsreaktion verwendet werden.
• (2) Die Enzymaktivität kann weiter durch Erhöhen des Wassergehalts in der Trockenzelle vergrößert werden.
• (3) Die Reaktionsgeschwindigkeit der Erfindung ist 2- bis 5mal größer als die der üblichen Verfahrensweise, bei der die gleiche Anzahl von Einheiten des Lipaseenzyms an dem Träger adsorbiert ist. Wahrscheinlich deshalb, da die Lipase in der Trockenzelle oder in deren Nachbarschaft eine Affinität für das Fettsubstrat aufweist.
• (4) Eine Verringerung der Enzymaktivität ist nicht feststellbar, selbst wenn die Reaktion in einem Lösungsmittel, wie Hexan, durchgeführt wird; und
• (5) weist die Trockenzelle eine starke Toleranz gegen eine Änderung des pH-Werts oder der Temperatur auf.

Das Enzym selbst ist hinsichtlich des pH-Wertes und/oder der Temperatur zur Erhaltung seiner Aktivität begrenzt. Beispielsweise wirkt Rhizopus delemar Lipase gut beim pH-Wert von 4 bis 7 und bei einer Temperatur von 30 bis 40°C und die Lipase wird unter anderen Bedingungen inaktiviert oder wird die Aktivität beträchtlich verringert. Dagegen zeigt Lipase in der erfindungsgemäß verwendeten Trockenzelle selbstverständlich eine stabile Aktivität unter den vorstehenden Umgebungsbedingungen und insbesondere wird die Enzymaktivität nicht in einem großen Ausmaß verringert und wird selbst unter anderen Bedingungen beibehalten. Wahrscheinlich liegt der Grund dafür in dem vorstehend erwähnten Vorteil (1). Ein Vorteil, der über den Vorteil (1) hinausgeht, liegt darin, daß die Reaktion durch Erhöhen der Reaktionstemperatur (beispielsweise 50 bis 60°C) beschleunigt werden kann.

Lipase in der erfindungsgemäß verwendeten Trockenzelle weist die vorstehend beschriebenen Vorteile auf. Darüber hinaus kann die Reaktionstemperatur auf 70°C angehoben werden, wenn ein thermostabiler (thermophiler) Stamm als Lipase erzeugender Stamm verwendet wird. Typische Beispiele für einen derartigen thermostabilen Stamm sind Stämme, die dem Genus Rhizopus angehören, beispielsweise Rhizopus chinensis, Rhizopus pseudochinensis und Rhizopus hamillis. Beispielsweise kann ein thermostabiler Stamm, der Rhizopus chinensis angehört, bei einer Temperatur von bis zu 50 bis 60°C wachsen. Wenn eine Trockenzelle aus einem derartigen Stamm durch die erfindungsgemäß angewendete Kultivierungsmethode hergestellt wird, kann die erhaltene Trockenzelle für eine Umesterungsreaktion verwendet werden, die bei einer Temperatur über 70°C durchgeführt wird. Eine Fettsäure, wie Stearinsäure oder Palmitinsäure, hat einen Schmelzpunkt von 68 bis 72°C. Wenn die Reaktion bei einer Temperatur von über 70°C, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt werden kann, so ist es vorteilhaft, daß das Lösungsmittel zur Auflösung der Fettsäure mit einem derartigen Schmelzpunkt weggelassen werden kann.

Wenn ein Mikroorganismus, der Lipase mit 1,3-spezifischer Natur enthält, erfindungsgemäß angewendet wird, so ist es auch möglich, das Glyzerid selektiv in der 1- oder 3-Stellung umzuestern. Typische Beispiele für den Mikroorganismus, der Lipase mit 1,3-spezifischer Natur erzeugt, sind beispielsweise die Mikroorganismen, ausgewählt aus dem Genus Rhizopus, wie Rhizopus delimor oder Rhizopus chinensis; Mucor japonicus; und Aspergillus nigar bzw. Aspergillus niger.

Darüber hinaus vervielfältigt sich bei der Kultivierung des Lipase enthaltenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium bei Zusatz poröser Teilchen mit Durchmessern von 50 bis 2000 µm zu dem Medium in einer Menge von 5 bis 30 Gew.-% vor der Kultur des Lipase erzeugenden Mikroorganismus, der Mikroorganismus in den feinen Porositäten bzw. Poren der Teilchen und zumindest die Oberfläche der Teilchen wird durch den Mikroorganismus bedeckt. Durch Trocknen des so erhaltenen immobilisierten Mikroorganismus kann ein immobilisierter Mikroorganismus der für die Umesterungsreaktion geeignet ist, erzeugt werden. In diesem Fall ist das an das Teilchen fixierte Enzym stabiler, und es ist ein kontinuierlicher Betrieb der Umesterungsreaktion möglich. Beispielsweise ist die Enzymaktivität bei kontinuierlicher Umesterungsreaktion unter Verwendung des immobilisierten Mikroorganismus 1 bis 2 Wochen stabil, und nicht weniger als 60% der Aktivität sind einen Monat später beibehalten.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Rhizopus delemor wurde einer Kultivierung an Luft bei 30°C und einem pH-Wert von 5,6 während 50 Stunden in einem Medium unterworfen, dessen Zusammensetzung in der Tabelle I gezeigt ist und worin das Olivenöl als Induziermittel wirkt.

Bestandteile
Gehalt (%)
Pepton
7
Glucose	2
MgSO₄ · 7 H₂O	0,05
NaNO₃	0,1
KH₂PO₄	0,1
Olivenöl	2

Der erhaltene Mikroorganismus wurde zweimal mit reinem Wasser gewaschen und 10 Minuten in eine 50% wäßrige Acetonlösung und dann 5 Minuten in eine 100% wäßrige Acetonlösung getaucht. Anschließend wurde die Lösung filtriert, und der Mikroorganismus wurde unter Vakuum bei 30°C während 2 Stunden getrocknet. Der Wassergehalt der so erhaltenen Trockenzellen betrug etwa 5 Gew.-%. Die Enzymaktivität betrug 20 000 Einheiten/g Trockenzellen.

Eine Umesterungsreaktion, deren Reaktionssystem in der Tabelle II dargestellt ist, wurde unter Verwendung der erhaltenen Trockenzellen durchgeführt.

Bestandteile des Reaktionssystems
Menge (g)
Hexan
20
Olivenöl	10
Stearinsäure	10
Trockenzelle	10

Die Reaktion wurde bei 40°C während 48 Stunden unter Rühren bis zur Vollendung durchgeführt. Die erhaltenen Produkte sind in der Tabelle III aufgeführt.

Produkte (die Fettsäurebestandteile)
Menge (g)
1,3-Stearo-2-oleotriglyzerid
6,0
1-Stearo-2,3-dioleotriglyzerid	2,0
Olivenöl	1,5

Ölsäurereste in den 1- und 3-Stellungen wurden durch Stearinsäurereste ersetzt, da die Lipase in Rhizopus delemar 1,3-spezifisch wirkt.

Bei 80% des Olivenöls erfolgte die Umesterungsreaktion in der 1-Stellung oder der 1- und 3-Stellung, und 5% des Olivenöls wurden in ein Diglyzerid umgewandelt. Wenn die Wassermenge in der Nähe des Enzyms groß ist, so erfolgt eine Hydrolyse, und das Olivenöl wird zu einem Diglyzerid und weiter zu einem Monoglyzerid zersetzt. Im Gegensatz hierzu wurde im vorstehenden Beispiel die Hydrolyserate auf 5% verringert.

Beispiel 2

Die Verfahrensweise von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch ein thermostabiler Stamm von Rhizopus chinensis statt Rhizopus delemar zur Erzielung von Trockenzellen verwendet wurde. Anschließend wurde die Umesterungsreaktion nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch die Reaktionstemperatur 40°C, 50°C oder 60°C betrug, und die für die Beendigung der Reaktion erforderlichen Reaktionszeiten wurden miteinander verglichen. Es zeigte sich, daß die Reaktionszeit 45 Stunden, 30 Stunden bzw. 24 Stunden betrug, wenn die Reaktionstemperatur 40°C, 50°C bzw. 60°C war, das heißt, die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Temperatur von 60°C war fast 2fach größer als die der Temperatur von 40°C.

Beispiel 3

Die Desaktivierungsrate des Enzyms wurde gemessen durch Durchführung der Umesterungsreaktion in einem kontinuierlichen System (fließenden System) unter Verwendung der im Beispiel 1 erhaltenen Trockenzellen, wobei wie folgt vorgegangen wurde: Die Reaktionskomponenten und die Trockenzellen wurden in den Reaktor wie in der Tabelle II gezeigt beschickt. Ein Substratgemisch, bei dem Stearinsäure in Olivenöl und Hexan gelöst war, mit der gleichen Zusammensetzung wie in der Tabelle II gezeigt, wurde in den Reaktor mit konstanter Strömungsgeschwindigkeit eingeführt, während das Produkt aus dem Reaktor mit der gleichen Strömungsgeschwindigkeit wie die Beschickungsgeschwindigkeit entnommen wurde. Die Beschickungsgeschwindigkeit wurde auch derart gesteuert, daß die mittlere Verweilzeit in dem Reaktor 24 Stunden betrug. Der Ausgang war mit einem Filter versehen, so daß die Trockenzellen nicht ausströmten. Die Reaktionstemperatur betrug 40°C.

Die Zusammensetzung des so erhaltenen flüssigen Produkts wurde gemessen, und das Inaktivierungsausmaß des Enzyms wurde aus den Änderungen der Reaktionsausbeute bestimmt (Ausmaß der Umesterungsreaktion). Das Ergebnis ist in der Fig. 1 gezeigt. Aus der Fig. 1 ist klar ersichtlich, daß ein beständiger Zustand während einer Woche von dem Zeitpunkt an, bei dem die Reaktion den beständigen Zustand erreichte, beibehalten wurde. Anschließend begann die Reaktionsausbeute allmählich abzusinken, und die Enzymaktivität ging nach und nach verloren, jedoch wies das Enzym selbst einen Monat später noch eine Aktivität von nicht weniger als 40% auf.

Beispiel 4

Rhizopus chinensis wurde 50 Stunden in dem Kulturmedium der in der Tabelle I gezeigten Zusammensetzung kultiviert, in dem handelsüblichen, poröse Schwammteilchen suspendiert waren (ein 1-mm-Würfel, Größe der Poren: 50 bis 100 µm, Hohlraumvolumen: etwa 80%). Der Mikroorganismus vervielfältigte sich auch in den Teilchen unter Bedeckung der Teilchenoberfläche. Die erhaltenen Teilchen wurden erfindungsgemäß getrocknet, um die Zellen an den Teilchen zu fixieren, wodurch ein immobilisierter Mikroorganismus erhalten wurde. Die Verfahrensweise von Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei jedoch der immobilisierte Mikroorganismus in einer Menge von 20 Gew.-% des Reaktionssystems anstelle der Trockenzellen des Beispiels 1 verwendet wurde, um das Inaktivierungsmaß des Enzyms zu messen. Die Ergebnisse sind in der Fig. 1 dargestellt. Aus der Fig. 1 ist klar ersichtlich, daß ein beständiger Zustand länger beibehalten wurde als im Beispiel 3, bis nahezu 2 Wochen, und die Inaktivierungsgeschwindigkeit war ebenfalls gering.

Vergleichsversuch

Die Verfahrensweise des Beispiels 3 wurde wiederholt, wobei jedoch ein handelsüblicher Katalysator mit Rhizopus delemar Lipase, adsorbiert an Sellait, anstelle der Trockenzellen des Beispiels 1 verwendet wurde, um das Inaktivierungsausmaß des Systems zu messen. Das Ergebnis ist in der Fig. 1 gezeigt. Aus der Fig. 1 ist deutlich ersichtlich, daß der beständige Zustand nur 2 bis 3 Tage anhielt und die Enzymaktivität 1 Woche später auf 20% abgesunken war.

Zusätzlich zu den in dem Beispiel verwendeten Bestandteilen können andere Bestandteile in den Beispielen, wie in der Beschreibung angegeben, verwendet werden, wobei im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erzielt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind dem Fachmann geläufig und der Öffentlichkeit zugänglich, bzw. handelsüblich.

Claims (12)

1. Verfahren zur Umesterung von Fetten, die Glyceride enthalten, zum Ersatz eines Fettsäurerestes eines Glycerids, durch einen anderen Fettsäurerest in Gegenwart von Lipase als Umesterungskatalysator und in Gegenwart von Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß man den Umesterungskatalysator in Form von getrockneten Mikroorganismenzellen, die Lipase enthalten und einen Wassergehalt von 1 bis 20 Gew.-% aufweisen, in das umzuesternde Gemisch einbringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Menge an trockenen Mikroorganismenzellen so gesteuert wird, daß die Wassermenge im Reaktionssystem 0,1 bis 10 Gew.-% beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Menge an getrockneten Mikroorganismenzellen so gesteuert wird, daß die Wassermenge im Reaktionssystem 1 bis 5 Gew.-% beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die getrockneten Mikroorganismenzellen aus einem Mikroorganismus hergestellt worden sind, der ausgewählt ist aus der Gruppe des Genus Rhizopus, Mucor Aspergillus, Candida und Geotrichum.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die getrockneten Mikroorganismenzellen aus einem Mikroorganismus von thermostabilen Stämmen ausgewählt aus der Gruppe Genus Rhizopus hergestellt worden sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der übrigen vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Lipase mit 1,3-Spezifität enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der übrigen vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Umesterungsreaktion in einem Lösungsmittel durchgeführt wird, das geeignet ist, das Glyzerid und die Fettsäure zu lösen.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die eingesetzte Lipase enthaltenden Mikroorganismenzellen in einer Kulturlösung gezüchtet worden sind, der zu Beginn oder während der Fermentation zur Induktion der Lipase ein Glycerid oder eine Fettsäure in Anteilen von 1 bis 80 Gew.-% zugesetzt worden ist und daß die erhaltenen Mikroorganismenzellen mit einem wasserlöslichen Lösungsmittel gewaschen und auf einen Wassergehalt von 1 bis 20 Gew.-% getrocknet worden sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation zu dem Zeitpunkt gestoppt worden ist, wenn eine Kohlenstoffquelle des Mediums verbraucht war und daß dann die Mikroorganismenzellen gewonnen worden sind.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Induktion der Lipase Triolein, Biolein, Monoolein, Ölsäure, Linolsäure oder ein Gemisch davon eingesetzt worden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß nach Beendigung der Fermentation der Mikroorganismenzellen diese in eine wäßrige Lösung von Glutaraldehyd mit einer Konzentration von weniger als 5 Gew.-% vor dem Waschen eingetaucht worden sind.

12. Verfahren nach Anspruch 8, 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die die Lipase enthaltenden Mikroorganismenzellen in einem Medium kultiviert worden sind, dem vorher poröse Teilchen mit Durchmessern von 50 bis 2000 µm in einer Menge von 5 bis 30 Gew.-% des Mediums zugefügt worden sind und so die Mikroorganismenzellen in den Teilchen vermehrt und vor dem Trocknen an diese gebunden worden sind.