DE3784923T2

DE3784923T2 - Verfahren zur herstellung von enzympreparationen.

Info

Publication number: DE3784923T2
Application number: DE8787305053T
Authority: DE
Inventors: Yoshitaka Ebihara; Takaharu Matsuo; Norio Sawamura; Kazunobu Tsumura
Original assignee: Fuji Oil Co Ltd
Current assignee: Fuji Oil Co Ltd
Priority date: 1985-12-07
Filing date: 1987-06-08
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2007-06-09
Also published as: DE3784923D1; JPS62134090A; EP0294520B1; JPH066058B2; US4873194A; EP0294520A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparats. Insbesondere ist das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Enzympräparat brauchbar, um eine Umesterung in Anwesenheit von nur wenig Wasser zu bewirken.
Die Subtratspezifität von Lipase kann vorteilhafterweise für Umesterungsreaktionen genutzt werden.
Man nimmt an, daß Lipase im wesentlichen an der Grenzfläche zwischen Wasser und Lipid reagiert. Daher wird vermutlich aufgrund der Tatsache, daß die Löslichkeit von Wasser in einem Fett oder Öl ungefähr 0,2 % beträgt, die Umesterungsreaktion oftmals in Anwesenheit einer gewissen Menge Wasser zur Aktivierung des Enzyms ausgeführt, d.h. nicht weniger als 0,2 % Wasser, bezogen auf das Substrat (siehe z.B. Japanische Patentschrift Nr. 52-104506). In einem Reaktionssystem, das ein solches Wasser enthält, treten jedoch Schwierigkeiten wie etwa die Bildung einer großen Menge von Diglyceriden auf.
Die Japanische Patentschrift Nr. 56-1278087 der Firma der Anmelderin offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparats mit einer hohen Umesterungsaktivität selbst in Gegenwart von viel weniger Wasser und im Extremfall selbst in einem Reaktionssystem, aus dem Substratfeuchtigkeit soweit wie in einem industriellen Maßstab möglich entfernt wird.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparats zur Verfügung gestellt, welches die Trocknung einer hydrierten Substanz mit Lipaseaktivität umfaßt, während sie eine Fettsäure oder ein Fettsäurederivat enthält.
Der Begriff "Substanz" der hier für "eine Substanz mit Lipaseaktivität" verwendet wird, bedeutet ein lipolytisches Enzym oder ein Präparat davon ("eine Substanz mit Lipaseaktivität" wird im folgenden als Enzym oder Enzympräparat verwendet, soweit nicht anders angegeben). Das Enzympräparat ist nicht auf ein bestimmtes Präparat beschränkt und schließt nicht nur sogenannte immobilisierte Enzyme ein, die durch konventionelle Verfahren wie Sedimentation, physikalische Adsorption, Ionenadsorption, Einschluß, Vernetzung, kovalente Bindung oder ähnliche erhalten werden, sondern auch Endoenzyme und mikrobielle Kulturen. Beispiele eines Trägers für das Enzympräparat schließen ein Diatomeenerde, Aluminiumoxid, Celit, Cellulose und andere Cellulosederivate, poröses Glas, Glasfaser, Silikatgel, Florisil, Ionenaustauscherharze, Titandioxid, Kaolinit, Pearlit und ähnliche, und das Enzympräparat kann wahlweise andere geeignete Zusatzstoffe, wie zwei- oder dreiwertige Alkohole, Polyhydroxyverbindungen, Proteine und ähnliches enthalten.
Es ist notwendig, daß das Enzym oder das Enzympräparat "Lipaseaktivität" aufweist, d.h. eine lipolytische Aktivität in Anwesenheit von Wasser, das zur Bildung einer Grenzfläche ausreicht. Wenn das Enzym oder das Enzympräparat eine solche Aktivität nicht hat, ist es unmöglich, daß sich eine Umesterungsaktivität ergibt oder gesteigert wird. Als Enzym oder Enzympraparat ist beispielsweise ein Enzym mit Spezifität für alpha- und alpha'-Positionen (z.B. ein Enzym, abgeleitet aus Mikroorganismen der Gattungen Rhizopus, Aspergillus und Mucor, Pankreas-Lipase, Reiskleielipase und ähnliches) besonders brauchbar, doch ein Enzym ohne Spezifität für alpha- und alpha'-Positionen (z.B. ein Enzym, abgeleitet von Mikroorganismen der Gattungen Penicillium, Geotrichum, Corynebacterium, Candida und ähnlichen) kann auch verwendet werden.
Im Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es notwendig, den Trocknungsschritt unter Verwendung des Enzyms oder des Enzympräparats in hydriertem Zustand zu beginnen, und die Substanz sollte mit einem Fettsäurederivat zumindest zu Beginn des Trockenschritts in Kontakt gebracht werden.
Der Ausdruck "der hydratisierte Zustand" bedeutet, daß ein wässriges Medium wie Wasser, eine Pufferlösung, wässriges Aceton, wässriger Alkohol oder ähnliches durch die Substanz unter Hydratisierung diffundiert. Bevorzugt ist, daß die Menge an wässrigem Medium sowenig als möglich über der Wasserretentionskapazität des Enzyms oder der enzymhaltigen Substanz liegt (d.i. die Wassermenge, die durch ein physikalisches Verfahren einfach entfernt werden kann), um die für den Trocknungsschritt benötigte Zeit zu verkürzen.
Die Fettsäuren oder deren Derivate, die mit dem Enzym oder dem Enzympräparat im Trocknungsschritt in Kontakt gebracht werden, schließen beispielsweise Fettsäuren ein wie solche mit bis zu 22 Kohlenstoffatomen, Alkalimetallsalze von Fettsäuren, Polycarbonsäuren (z.B. Suberinsäure, Azelainsäure usw.), substituierte Carbonsäuren (z.B. Monochlorölsäure usw.), Hydroxysäuren (z.B. Rhizinolsäure usw.), Aminosäuren (z.B. Glutaminsäure, Glycin usw.), Amide (z.B. Laurylamid, Oleylamid usw.) und Fettsäureester wie niedere Alkoholester von Fettsäuren (z.B. Ethyloleat, Ethyllaurat usw.), höhere Alkoholester von Fettsäuren (z.B. Docosenyleicosanoate, Lauryllaurat usw.), Sorbitanfettsäureester (z.B. Sorbitanmonooleat, Sorbitanmonolaurat usw.), Lecithin, andere oberflächenaktive Mittel (z.B. Glyzerinmonooleat, Propylenglycolmonooleat, Sucrosefettsäureester usw.) und Triglyceride (z.B. Triolein, Trilaurin und andere tierische und pflanzliche Öle wie etwa Sojabohnenöl, Rapsöl, Safloröl, Sonnenblumenöl, Palmöl usw.) und ähnliches.
Obwohl der Mechanismus für die Steigerung der Umesterungsaktivität beim Verfahren der vorliegenden Erfindung unklar ist, vermutet man, daß das Fettsäurederivat vorteilhaft einen bestimmten Teil des Enzyms während seines Kontakts mit dem Enzym oder dem Enzympräparat beeinflußt und dazu beiträgt, daß die Konfiguration des Enzyms oder des Enzympräparats, die für Umesterungen geeignet ist, während des Trocknungsschritts erhalten bleibt.
Die Zeit und das Verfahren zur Zugabe des Fettsäurederivats ist nicht besonders eingeschränkt, mit der Ausnahme, daß die Fettsäure oder das Fettsäurederivat mit dem Enzym oder Enzympräparat während des Trocknens in Kontakt sein sollte. Vorzugsweise kann die Fettsäure oder das Fettsäurederivat eingesetzt werden, indem man es in einer wässrigen Lösung des Enzyms löst oder emulgiert, worin das Enzym mit einem Träger gemischt ist, oder indem man es auf das hydratisierte Enzym oder Enzympräparat aufsprüht, wodurch selbst relativ kleine Mengen eines Fettsäurederivats wirkungsvoll gleichförmig dispergiert werden können.
Um das oben beschriebene Dispergierverfahren anzuwenden, ist es im allgemeinen wünschenswert, daß die Fettsäure oder ihr Derivat wasserlöslich oder flüssig bei Raumtemperatur ist. Außerdem ist es in Abhängigkeit von der speziellen Verwendung des erfindungsgemäß erhaltenen Enzympräparats wünschenswert, eine geeignete Fettsäure oder ein Fettsäurederivat auszuwählen, um Kontamination des Enzymsubstrats zu vermeiden. Nach den Untersuchungen der Erfinder ist ein Ester einer gesättigten Fettsäure mit nicht mehr als 12 Kohlenstoffatomen oder einer ungesättigten Fettsaure mit nicht mehr als 22 Kohlenstoffatomen mit einem einwertigen niederen Alkohol, wie Ethyllaurat, Ethyloleat oder ähnliches, am besten geeignet. Die Erfindung ist jedoch nicht auf solche Fettsäurederivate beschränkt, und Fettsäuren oder andere Derivate davon können eingesetzt werden. Die Derivate schließen Säuren ein, worin die Hydroxylgruppe der Carboxylfunktion durch eine andere Gruppe, z.B. den Rest eines Alkohols oder Ammoniak substituiert ist.
Die Menge der in der vorliegenden Erfindung einzusetzenden Fettsäure oder des Fettsäurederivats beträgt gewöhnlich nicht weniger als 0,02 Gew.%, bezogen auf das Gewicht der Gesamtfeststoffe (einschl. eines Trägers) des Enzyms oder Enzympräparats; andernfalls kann im allgemeinen eine Verstärkung der Umesterungsaktivität nicht erwartet werden. Wenn jedoch die Menge mehr als 10 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Feststoffe beträgt, wird ein weiterer Anstieg der Aktivierung der Umesterungsaktivität kaum erwartet werden können.
Beim Trocknungsschritt ist es im allgemeinen von Wichtigkeit, die Trocknungsgeschwindigkeit zu Beginn niedrig zu halten, d.h. bis die Feuchtigkeit der hydratisierten Substanz auf ein gewisses Maß zurückgegangen ist. Die Trocknungsgeschwindigkeit variiert je nach der besonderen einzusetzenden Substanz, welche das Enzym enthält, dem speziellen Trägertyp und ähnlichem. Sie kann daher nicht einheitlich definiert werden. Jedoch kann sie experimentell leicht wie folgt bestimmt werden: Zunächst wird die gesamte Trocknungsstufe bei verschiedenen Trocknungsgeschwindigkeiten ausgeführt, um eine geeignete Trocknungsgeschwindigkeit herauszufinden. Dann wird die Zeit, wann die Trocknungsrate beschleunigt werden kann, bestimmt. Selbstverständlich kann die Trocknung auch bei einer konstant niedrigen Geschwindigkeit über die gesamte Trocknungsstufe hinweg ohne ein ernsthaftes Problem bezüglich der Produktivität ausgeführt werden. Die anfängliche Trocknungsgeschwindigkeit ist im allgemeinen wünschenswerterweise nicht höher als 0,5, ausgedrückt als Abnahme des Wassergehalts pro Stunde, wobei der Wassergehalt das Verhältnis der Wassermenge im zu trocknenden Stoff und dem Trockengewicht des Stoffes ist, wobei das letztere als 1 genommen wird. Wenn Pulver oder Körnchen mit einer Partikelgröße von ungefähr 2 mm und guten Wasserrückhaltecharakteristika verwendet werden, ist eine Geschwindigkeit von nicht mehr als 0,3 bzw. 0,25 (Abnahme des Wassergehalts pro Stunde) besonders wünschenswert. Bezüglich der Qualität des Enzymprodukts, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, liegt die am meisten bevorzugte Geschwindigkeit nicht höher als 0,1, ausgedrückt als Abnahme des Wassergehalts.
Die Trocknungsarten schließen ein: Trocken unter reduziertem Druck, ebenso wie Trocknen durch Kontaktierung mit Gas von relativ niedriger Feuchtigkeit (z.B. Luft, Stickstoff oder anderen Inertgasen), wie Ventilationstrocknen, Gebläsetrocknen, Permeationstrocknen, Heißlufttrocknen, Trocknen durch Kontaktierung mit Flüssigkeit (eine Flüssigkeit mit einer gewissen Kompatibilität mit Wasser, die das Protein nicht denaturiert, wie Glyzerin, Propylenglycol, Sorbit und ähnliches) mit einem relativ niedrigeren Feuchtigkeitsgehalt, oder eine Kombination davon. Die Mittel zur Kontrolle der Trocknungsgeschwindigkeit schließen eine Kontrolle der Untersättigung der Trocknungsflüssigkeit (d.h. Kontrolle der in der Flüssigkeit enthaltenen Feuchtigkeit), Kontrolle der Wärmeenergie, die der Trocknungsflüssigkeit oder der zu trocknenden Substanz zugeführt wird, und ähnliches ein. Jedoch sollte eine übertriebene Wärmezufuhr während des Trocknens, welche in einer Inaktivierung des Enzyms resultiert, vermieden werden. Zu Beginn des Trocknens beträgt die bevorzugte Temperatur des Mediums im allgemeinen nicht mehr als 50ºC und die bevorzugte Temperatur des Enzyms oder des Enzympräparats beträgt im allgemeinen nicht mehr als 20ºC.
Obwohl der Trocknungsgrad in Abhängigkeit von der besonderen Verwendung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Enzymprodukts variiert, ist es im allgemeinen wünschenswert, daß der Wassergehalt des Produkts auf nicht mehr als ungefähr 10 Gew.% reduziert wird. Insbesondere wenn das Produkt in einem System mit einem geringen Feuchtegehalt verwendet wird, wird das Produkt wünschenswerterweise auf einen niedrigeren Wassergehalt, z.B. auf nicht mehr als 5 Gew.% getrocknet. Die Dehydratisierung des Enzympräparats, das zu einem gewissen Grad getrocknet wurde, kann auch beispielsweise durch Eintauchen des Präparats in ein Substrat, wie etwa Glyceride, ausgeführt werden, um darin Wasser bei der Hydrolyse des Substrats zu verbrauchen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung im Detail, sollen aber ihren Umfang nicht begrenzen. In den Beispielen sind alle "Teile" und "%" Gewichtsteile bzw. Gewichtsprozente, falls nicht anders angegeben.

BEISPIEL 1

Ein Teil einer im Handel erhältlichen Lipase (abgeleitet aus Rhizopus delemar) wurde in 3,5 Teilen gekühltem Wasser dispergiert, und weitere 2,5 Teile Kaolinit wurden in dieser Dispersion dispergiert, wodurch eine Mischung von Lipase und Kaolinit hydratisiert wurde. Dann wurden 0,0005 bis 0,5 Teile Ethyloleat unter Mischen aufgesprüht. Die Mischung wurde auf 20ºC unter reduziertem Druck getrocknet, was ein Enzympräparat mit einem Wassergehalt von 2,5% ergab. Ethyloleat (Teile) (% bezogen auf das getrocknete Enzym) Umesterungsaktivität * Die Daten wurden gemäß dem Verfahren zur Messung des Ka-Werts, beschrieben in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 51-35449, erhalten.
Verschiedene Mengen des Enzympräparats A oder D wurden mit 100 Teilen Substrat umgesetzt, das erhalten wurde, indem man eine mittlere Palmölfraktion und Ethylstearat (1:1) (Feuchtigkeit des Substrats: 0,01 % bei 40ºC; Wassergehalt des Systems: 0,08 %, wenn 3 Teile des Enzympräparats verwendet wurden). Die Zeit (Tage), die erforderlich war, um ungefähr 80 % der Umesterungsreaktionsrate zu erhalten, war wie folgt: Für 80 %ige Reaktionsrate benötigte Tage Enzympräparat Eingesetzte Menge Teile
Darüber hinaus wurde die Umesterungsreaktion unter Verwendung von 2 Teilen des Enzympräparats in einem System, zu welchem Wasser in einer Menge zugegeben wurde, so daß der Wassergehalt des Systems 0,5 % betrug, ausgeführt. Die erforderliche Zeit, um ungefähr 80 % Umesterungsreaktionsrate zu erhalten, betrug 4 Tage für das Präparat A, dagegen 2 Tage für das Präparat D. Es wurde daher eine gute Umesterungsaktivität sogar in einem System gezeigt, das eine relativ große Wassermenge enthielt. Jedoch betrug die gebildete Menge an Diglyceriden nicht mehr als 5 % im ersten System, das 0,08 % Wasser enthielt, während sie ungefähr 18 % im letzteren System betrug, das 0,5 % Wasser enthielt.

BEISPIEL 2

0,5 bis 2,0 Teile im Handel erhältlicher Lipase (erhalten aus Rhizopus nibeus) und 0,05 Teile Ethyllaurat wurden in 3,0 Teilen gekühltem Wasser dispergiert, und 2,5 Teile Diatomeenerde wurden dann in dieser Dispersion dispergiert, wodurch eine hydratisierte Substanz erhalten wurde. Die Substanz wurde in eine Säule gepackt, und Luft mit 50 % Feuchte wurde durch die Säule geschickt, wodurch ein Enzympräparat mit einem Wassergehalt von 1,8 % erhalten wurde.
Die Umesterungsaktivität (Ka-Wert, wie oben beschrieben) und die entsprechende Enzymmenge, die für das resultierende Enzympräparat verwendet wurde (Menge an im Handel erhältlicher Lipase, ohne daß der Carrier enthalten ist) werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Menge an verwendetem Enzym (Teile) Ka-Wert Mit Laurat Ohne Laurat
Ebenfalls wurde Ethylstearat anstelle von Ethyllaurat verwendet. Jedoch war die Dispersion in der Enzymlösung etwas schlechter.

BEISPIEL 3

Auf dieselbe Weise wie beschrieben in Beispiel 1, wurde ein Enzympräparat erhalten, mit der Ausnahme, daß Ölssäure, Sorbitanmonooleat, Natriumlaurat, Glycerinmonooleat, Triolein oder Sucrosefettsäureester mit einem HLB von ungefähr 5 anstelle von Ethyloleat verwendet wurden (0,05 Teile). Die Ka-Werte der Umesterungsaktivität betrugen 32,1, 35,3, 39,2, 33,4, 31,6 bzw. 33,8.
Wie aus dem vorhergehenden ersehen werden kann, wurde die Umesterungsaktivität von erfindungsgemäß erhaltenen Enzympräparaten bemerkenswert verbessert, und die Reaktionszeit der Umesterung kann ebenso wie die zu verwendende Enzymmenge reduziert werden.
In die Erfindung einschlossen sind Enzympräparate, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden, ein Verfahren zur Umesterung von Fett oder Öl, indem man das Fett oder Öl mit einem solchen Präparat in Kontakt bringt, insbesondere bei der Herstellung von Schokolade (welche hergestellt werden kann, indem man umgeesterte Fette oder Öle verwendet).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparats, umfassend die Trocknung einer hydratisierten Substanz mit Lipaseaktivität, während sie mit einer Fettsäure oder einem Fettsäurederivat in Kontakt gebracht wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Substanz mit Lipaseaktivität ein lipolytisches Enzym oder ein lipolytisches Enzympräparat ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Fettsäurederivat eine Fettsäure, ein niederer Alkoholester einer Fettsäure, ein oberflächenaktives Mittel oder ein Triglycerid ist.

4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Fettsaurederivat bei Raumtemperatur flüssig ist.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Menge der eingesetzten Fettsäure oder des Fettsäurederivats 0,02 bis 10 Gew.% beträgt, bezogen auf das Gesamtgewicht der Feststoffe.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Fettsäure 2 bis 22 Kohlenstoffatome hat.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Fettsäure oder das Fettsäurederivat ein Alkalimetallsalz einer Fettsäure, eine Polycarbonsäure, eine substituierte Carbonsäure, eine Hydroxysäure, eine Aminosäure, ein Amid, ein Fettsäureester, ein Sorbitanfettsäureester, Lecithin oder ein anderes oberflächenaktives Mittel, oder ein Triglycerid umfaßt.

8. Enzympräparat, welches getrocknet wurde und Lipaseaktivität hat, dadurch gekennzeichnet, daß sein Wassergehalt nicht mehr als 10 Gew.% beträgt, und daß vor dem Trocknen es 0,02 bis 10 Gew.% einer Fettsäure oder eines Fettsäurederivats enthielt, bezogen auf das Gesamtgewicht der Feststoffe.

9. Verfahren zur Umesterung von Fett oder Öl, umfassend ein Kontaktieren des Fetts oder Öls mit einem Präparat gemäß Anspruch 8.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wenn es bei der Herstellung von Schokolade eingesetzt wird.