JPH0665312B2

JPH0665312B2 - 油脂類のエステル交換反応方法

Info

Publication number: JPH0665312B2
Application number: JP62311551A
Authority: JP
Inventors: 毅安増; 秀季横道; 和広中村; 義治河原
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1987-12-09
Filing date: 1987-12-09
Publication date: 1994-08-24
Anticipated expiration: 2009-08-24
Also published as: JPH01153097A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、エステル交換反応に適した固定化リパーゼを
用い、比較的高温度で油脂類のエステル交換反応を連続
的に行う方法に関するものである。

〔従来の技術〕

脂質分解酵素の１種であるリパーゼは温和な条件下で反
応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を
有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換
反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパー
ゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系での
み進みうる反応である。一方リパーゼのエステル合成活
性や交換活性を増大せしめるためには、酵素として少量
の水分を必要とする。特開昭55−71797号公報に開示さ
れた低水分系の反応では、充分な反応速度が得られず、
また反応速度を増大させるために必要以上の水分を与え
ると、エステルの分解反応が優先的に進行するという問
題点がある。また特開昭60−19495号公報及び特開昭60
−203196号公報に開示された、反応を多水分系の分解工
程と、水分を除去する合成工程の二段階に分けて行う方
法の提案もあるが、後者の合成反応速度は通常のエステ
ル交換速度に比して充分であるとは言えず、工程操作の
複雑化も避けられない。

以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。
リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均
一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを
不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散
可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるた
め、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすく
なる。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使
用がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業
的実施においても反応装置の連続化が容易となる点等で
ある。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。例えば、Journal of American oil
Chemist's Society，第60巻，291−294(1983)にも微量
な水分を与えた場合加水分解反応が進行することが指摘
されている。また、水に代えてグリセリンのような多価
アルコールを添加した場合では加水分解反応はある程度
抑制されるが、エステル合成・交換反応は遅くなる。ま
た、酵素水分の保持を狙い多孔質担体、高吸水性樹脂を
キトサンで包括結合後、粉砕した担体を用いる方法（特
開昭59−213390号公報）によっても固定化酵素のエステ
ル合成・交換反応と分解反応を両立させるため、二段階
反応法（特開昭60−203196号公報）を採用している。ま
た特開昭60−98984号公報および特開昭61−202688号公
報には耐熱性を持ち80℃までの反応が可能なエステル交
換、エステル合成を目的とした固定化酵素についての開
示もあるが、この固定化方法が有効なのはムコール属の
特定のリパーゼのみであり、ムコール属由来のリパーゼ
を固定化して用いた場合でも、60℃〜80℃という温度で
は、ジグリセリドの1,2位から1,3位への酵素的および非
酵素的転移が速く、カカオ脂に類似したグリセリドの２
位にオレイン酸を多く含有する対称型油脂の製造を目的
とする場合には、よりエステル交換反応速度の速い固定
化酵素の開発が望まれる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

以上のようにエステル交換反応においては反応系内の水
分を確実にコントロールするか、またはよりエステル交
換活性の高い固定化酵素の開発が望まれる。

水分コントロールについては先に述べた二段階反応（特
開昭60−203196号公報）においても行われているが、装
置的にも煩雑であること、また第１段の分解工程におい
て1,2−ジグリセリドを選択的、高収率で得ることと、
更に第２段で1,2−ジグリセリドから1,3−ジグリセリド
への転移をさせることなく、選択的にトリグリセリドを
合成することは難しく、特に温度が高くなるほどこの転
移の悪影響を抑える事は難しくなり、溶剤の使用等とが
必要となる制約された条件に限られる。

リパーゼのエステル交換活性を増加させる方法として、
特開昭60−251884号公報に開示されたリパーゼに油脂を
加え加水分解反応をさせることにより、油脂と脂肪酸の
共存下で固定化を行う方法や、特開昭62−134090号公報
に開示された脂肪酸誘導体の共存下に乾燥する方法があ
るが、こうした方法により得られた固定化リパーゼのエ
ステル交換活性は前述の工業的実施にあたっては実質的
には未だ充分であるとは言えない。

一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特
開昭52−87293号公報に開示されたイオン交換樹脂の有
機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する方法
や、特開昭53−27787号公報に開示された多糖類の高級
脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを固定化する方
法、あるいはEur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.に記載
されたY.Kimura等のイオン交換樹脂にリパーゼを単にイ
オン結合により固定化する方法等の従来の方法ではいず
れも低収率にとどまり、他の夾雑物の共存下でリパーゼ
を選択的に固定化することは極めて困難であると考えら
れていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らはリパーゼのエステル交換活性を増
大させる因子について鋭意研究を重ねた結果、リパーゼ
に脂肪酸又はその誘導体を共存させることによりエステ
ル交換活性の増大が見られる事実を発見した。更に本発
明者らはこの事実をもとに、脂肪酸又はその誘導体を種
々の不溶性担体上に吸着させる事に応用し、本発明を完
成するに到ったのである。

即ち、本発明は、脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処
理して得た不溶性担体と、リパーゼとを水性媒体中で吸
着固定化し、次いで得られる固定化リパーゼの存在下で
油脂類のエステル交換反応を行うことを特徴とする油脂
類のエステル交換反応方法に係わるものである。

従来、リパーゼと脂肪酸又はその誘導体との関係につい
ては、醗酵生産において誘導基質として添加されたり、
ある種の不飽和脂肪酸または脂肪酸誘導体がある種のリ
パーゼの分解活性を活性化することが報告されているに
すぎない。詳細には、サッカロマイセス・リポリティカ
のリパーゼの分解活性をオレイン酸（Agric.Biol.Che
m.,46,2885(1982)）やヒドロキシ脂肪酸（3,5−ジヒド
ロキシ−７−テトラデセン酸）が活性化すること（Agri
c.Biol.Chem.,50,2523(1986)）、ヒマ種子中のリパーゼ
がヒドロキシ脂肪酸誘導体（リシノレート・テトラマー
（Ricinoleate tetramer））の分解活性発現に必要なこ
とが報告されているにすぎない。

また、リパーゼとリン脂質との関係についても、岩井ら
により1969年の日本生化学会において報告されて以来、
多くの報告がなされたが、加水分解反応での基質特異性
の変化についてか、または醗酵生産の安定化、誘導につ
いてのみであり、エステル交換反応での活性化について
の報告は見られない。

これに対し本発明においては、具体的にはリパーゼを含
む溶液に不溶性担体を添加し該担体上にリパーゼを固定
化する際に、予め不溶性担体に脂肪酸又はその誘導体を
吸着させた後、乾燥もしくは乾燥せずそのままリパーゼ
を固定化させる事により、リパーゼの選択的吸着とエス
テル交換活性の著しい上昇が見られたのである。

本発明の方法の最も好ましい点としては、第一に酵素を
含む培養液など他の夾雑蛋白質や他の物質の中から酵素
を短時間かつ高収率に固定化できる点である。

第二にリパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のこ
とながら水と油脂の界面で働くため、水溶液で使用した
場合には、界面と水溶液中にリパーゼの分散する平衡が
存在すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用
できない。しかし固定化により担体表面上に並べること
ができれば、用いた酵素を効率良く利用する事が可能と
なる。

第三に担体に脂肪酸又はその誘導体を吸着させておくこ
とにより脂質分解酵素を活性化して固定化できる事がわ
かった。これは、前述した様に界面で働く脂質分解酵素
は、界面に配向した時に活性を発現する高次構造をと
る。このため、界面に配向しかつ活性化した状態で酵素
を固定化する事が重要である。この高活性な状態を作り
出すのに必要な水不溶性の物質として脂肪酸又はその誘
導体が非常に良好であることがわかった。またこの様に
して得られた固定化酵素は従来困難とされていた低水分
下でも十分な活性を発現できる点である。

すでに本出願人はこれらの知見を応用して、少量の水と
油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界面
に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成し
特許出願した（特開昭60−251884号公報）。今回本発明
者らは、さらにこれらの事実を解明し、各種の不溶性担
体に脂肪酸又はその誘導体を予め吸着させることに応用
し、該担体と酵素を接触固定化する際に、酵素を活性化
すると同時に短時間でかつ高濃度に該担体上に固定化が
可能となり、高活性な固定化酵素を製造できるという本
発明の完成に至ったものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の方法においては、水不溶性の担体に脂肪酸又は
その誘導体を水もしくは有機溶剤中で接触させる事によ
り該担体上に吸着処理し、必要に応じて該液から濾過し
た後乾燥するか、またはそのまま酵素水性溶液もしくは
酵素を含む培養液と接触させる。接触時間としては１分
〜20時間、好ましくは30分〜２時間がよい。次いで該溶
液より不溶性担体を濾過し水または緩衝液により洗浄す
る。こうして得られた固定化酵素を水分５％以下、好ま
しくは２％以下まで乾燥させ本発明の固定化酵素を得
る。

本発明に用いる酵素としては、リゾプス・ジャポニカ
ス、リゾプス・デレマー、リゾプス・ニベウス、リゾプ
ス・ジャバニカス等のリゾプス属由来の微生物リパーゼ
が好ましく、トリグリセリドの1,3位にのみ反応する位
置選択性に優れたものが特に好ましい。

本発明に用いられる不溶性の担体としては、水およびア
ルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何
れでも良く、ケイソウ土、セライト、カオリナイト、パ
ーライト、モレキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性
炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、およ
びセルロースパウダー、ポリビニルアルコール、キトサ
ン、イオン交換樹脂、吸着樹脂、キレート樹脂等の有機
高分子の様なリパーゼ活性に影響を与えず、操作上から
物理的・化学的に安定なものであれば何れも使用でき
る。特に、不溶性担体内に疎水性の部分を持つもの、例
えば樹脂中の−CH₂−部分の多いもの、官能基にアルキ
ル基の入ったものが、脂質分解酵素の吸着性や基質とし
ての脂質との相性からも好ましい。また担体の疎水性が
特に高い場合は、固定化時にアンチカオトロピックイオ
ンとなる塩（例えば硫酸アンモニウム等）を加えること
により、固定化収率の向上が見られる。また担体の形状
としては、粉末状、顆粒状、繊維状、スポンジ状等種々
あるが、そのいずれでも使用できる。特に工程操作上の
面からは400〜1000μｍの粒径を有し、細孔径100〜1500
Åの多孔性担体を用いるものが好適である。特に好まし
い固定化担体としては、特開昭60−98984号公報記載の
マクロ多孔性弱アニオン交換樹脂があり、市販入手可能
なものとしてダイヤモンドシャムロック社のデュオライ
トA-568、デュオライトS-762等のマクロ多孔性の弱アニ
オン交換樹脂及び吸着樹脂が挙げられる。

本発明で用いる脂肪酸としては炭素数２〜36のものが好
ましく、更に好ましくは８〜18のものであり、例えば、
カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等の直鎖飽和脂
肪酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、リシ
ノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、もしくはイソステアリ
ン酸等の分岐状の脂肪酸が挙げられる。

本発明に用いられる脂肪酸誘導体としては、炭素数２〜
36好ましくは８〜18の脂肪酸と水酸基を有する化合物と
のエステルが挙げられ、１価アルコールエステル、多価
アルコールエステル、リン脂質、あるいはこれらのエス
テルにさらにエチレンオキシドを付加した誘導体等が例
示される。１価アルコールエステルとしては、メチルエ
ステル、エチルエステル等が、多価アルコールエステル
としては、モノグリセリド、ジグリセリド、およびそれ
らの誘導体、あるいはプロピレングリコール、ポリグリ
セリン等の多価アルコールの脂肪酸エステル、ショ糖脂
肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられ
る。

本発明に用いるリン脂質の例としては、市販大豆レシチ
ン、卵黄レシチン等の粗製およびまたは精製混合レシチ
ン等を用いてもよく、またこれらを分画して得たホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
ルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホ
スファチジン酸、カルジオリピン等を単独または混合し
て用いてもよい。また各種合成法により得た合成リン脂
質およびこれらの誘導体も用いることができる。

上記の脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温で液状であ
ることが工程操作上好ましいが、これに限定されるもの
ではない。またこれらは単体で用いてもよいが、適当な
組み合わせにより一層の効果が発揮される。また広範な
脂肪酸誘導体が使用可能なのは、これら誘導体が特に水
性媒体中では化学的に、もしくはリパーゼにより酵素的
に加水分解され、脂肪酸を生成するためと想像される。

脂肪酸又はその誘導体と水不溶性担体との接触方法とし
ては、水もしくは有機溶剤中にこれらの物質をそのまま
加えても良いが、分散性を良くするため溶剤に一旦脂肪
酸又はその誘導体を分散・溶解させた後、水に分散させ
た担体に加えることもよい。適当な有機溶剤としてはク
ロロホルム、ｎ−ヘキサン等が挙げられる。脂肪酸又は
その誘導体と不溶性担体の比率は、不溶性担体１重量部
（乾燥重量）に対し脂肪酸又はその誘導体0.01〜１重量
部、より好ましくは0.05〜0.5重量部が適当であるが、
これに限定されるものではない。適当な接触温度として
は０〜100℃、好ましくは20〜60℃がよい。適当な処理
時間としては５分〜５時間程度で良く、これらの接触処
理した後の担体は必要に応じて該溶液より濾別した後一
旦乾燥する。適当な乾燥温度としては室温〜100℃が良
く、減圧下での乾燥が乾燥速度の点から好ましいが、こ
れに限定されるものではない。

本発明において固定化を行う温度としては、酵素の失活
の起きない温度であればよく、０〜60℃、好ましくは20
〜40℃がよい。また酵素溶液のpHは酵素の変性が起きな
いような範囲であればよく、pH３〜９、特にpH４〜６と
することがよい。また酵素溶液に用いる緩衝液の種類は
特に規定しないが、一般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝
液、トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。

本発明における固定化方法において、水溶液中の酵素濃
度は特に限定されないが、固定化効率の点から前記酵素
の溶解度以下でかつ充分な濃度であることが望ましい。
また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去し、上澄
を使用しても良い。また酵素と固定化担体の使用割合は
固定化担体１重量部に対して、酵素0.01〜10重量部、特
に0.05〜５重量部が好ましいが、特にこれに限定される
ものではない。

本発明において酵素溶液に固定化担体を接触させて固定
化させた後に、該固定化担体を溶液より濾別し、水分５
％以下、好ましくは1.5〜２％に乾燥させることが後の
カラムにおける連続エステル交換反応を行うために有効
である。乾燥方法としては室温〜60℃での減圧乾燥が高
いエステル交換活性発現のために好ましいが、これに限
定されるものではない。

本発明による固定化酵素は低水分下でも高いエステル交
換活性を発現するため、十分な反応速度の実現と副反応
の抑制が可能となり、目的とするエステル交換脂の収率
及び品質の向上が計れる。

本発明のエステル交換に用いる油脂としては大豆油、オ
リーブ油、パーム油等の植物油脂、牛脂、豚脂、魚油等
の動物油脂が挙げられる。これらの油脂は単独で用いて
もよいが２種以上の油脂を用いるか、油脂と高級脂肪酸
或いは油脂と高級脂肪酸の低級アルコールエステル間で
エステル交換することが好ましい。特定の油脂と他の油
脂、脂肪酸もしくはその誘導体間でエステル交換する場
合、両者の量比は特定の油脂１重量部に対し、他の油
脂、脂肪酸もしくはその誘導体は0.05〜20重量部、好ま
しくは0.1〜10重量部でないと油脂の改質効果は得られ
にくい。特に好ましくは、パーム油等の２位にオレイン
酸残基を多く含有する油脂とステアリン酸とのエステル
交換である。この反応においてはステアリン酸の融点が
高く、油脂の粘度が高いため、カラム反応で連続エステ
ル交換反応を無溶剤で行うためには、反応系の温度を60
〜90℃に保つ必要がある。本発明の固定化酵素はこの目
的に好適であり、また得られる油脂はチョコレート用と
して有用なものである。

本発明のカラムにおける連続エステル交換反応方法とし
ては、水不溶性の担体に脂肪酸又はその誘導体を水もし
くは有機溶剤中で接触させることにより該担体上に吸着
処理し、該液から濾過した後一旦乾燥し、次いでリパー
ゼ水性溶液もしくはリパーゼを含む培養液と接触させた
後、該溶液より不溶性担体を濾過し、水又は緩衝液によ
り洗浄して得られた固定化リパーゼを、水分1.5〜２％
に乾燥させた後、任意の大きさのカラムに充填し、カラ
ム上部又は下部より反応原料を連続的に供給する。反応
原料の組成は、油脂単独でも良いが、２種以上の油脂を
用いるか、油脂と高級脂肪酸あるいは油脂と高級脂肪酸
の低級アルコールエステル、油脂と高級アルコールでも
良い。特定の油脂と他の油脂、脂肪酸もしくはその誘導
体間でエステル交換する場合、両者の量比は特定の油脂
１重量部に対し他の油脂、脂肪酸又は脂肪酸誘導体は0.
05〜20重量部、好ましくは0.1〜10重量部でないと油脂
の改質効果は得られにくい。反応原料の供給速度はカラ
ム内での平均滞留時間が２時間以内、好ましくは10分〜
60分となるような供給速度とすることが目的とする油脂
の改質効果を得るために必要である。必要以上に滞留時
間を長くした場合、又は活性の不十分な酵素を用いた場
合では、副反応による生成物（飽和トリグリセリド、ジ
グリセリド等）が増加し、目的とする油脂の改質効果が
得にくい。又、反応原料中の水分は0.01〜0.2％とし、
かつカラム内の反応原料に対する水分の合計が1.5〜2.0
％となる様に制御することが望ましいが、これに限定さ
れるものではない。供給原料中の水分が0.2％以上では
副反応の加水分解によるジグリセリドの生成が多くな
り、製品の品質低下は避けられない。また、0.01％以下
では工業的実施にあたって十分な生産性が得られない。
カラムの操作温度としては40〜90℃、特に融点が60℃以
上の反応原料を用いる場合には60〜90℃で行うことが良
い。

本発明において、固定化前の担体に、多官能性試薬を用
いて架橋することにより、固定化酵素の繰り返し使用に
おける耐久性向上をはかることができる。多官能性の架
橋試薬としては、グリオキザール、グルタルアルデヒ
ド、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒドなどのポ
リアルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジチオイソ
シアネート、N,N′−エチレンビスマレイミドなども使
用可能である。また、カルボジイミド類も使用できる。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、リパーゼの持つエステル交換活性を十
分に発揮させる為のものであり、脂肪酸又はその誘導体
を不溶性担体上に予め吸着させておくことにより、酵素
の選択的吸着固定化が可能となり、同時にエステル交換
活性の増大が起こる事を発見した結果から得たものであ
る。

また、特開昭62−134090号公報に開示された方法と異な
り、脂肪酸もしくはその誘導体と、担体、酵素を単に共
存させて固定化するのではなく、担体を脂肪酸又はその
誘導体で前処理するため、この前処理段階で幅広い溶剤
の選択が可能となる。すなわちステアリン酸等の固体脂
肪酸をブタノール、ヘキサン等の溶剤に溶解し、担体へ
の吸着終了後、溶剤を除去し、固定化操作に供すること
も可能である。

本発明では位置選択性リパーゼを高い活性を保ったまま
固定化しているため、低水分下でも十分な反応速度を維
持できるため、グリセリドの２位にオレイン酸を多く含
有する油脂と、飽和の脂肪酸とのアシドリシス反応によ
り、天然のカカオ脂に類似した構造を有する対称型の油
脂の製造を目的とした場合に、ジグリセリドの副生およ
び非対称型への転移とそれに伴う三飽和グリセリドの副
生の低減が可能となる。

以上のように本発明により、リパーゼを界面での活性型
にした状態で固定化することにより低水分下でもエステ
ル交換活性が増大することを発見し、簡便かつ廉価に固
定化酵素を製造することができ、効率的なエステル交換
反応の工業的実施が可能となった。

〔実施例〕

以下、本発明のエステル交換反応について、実施例、比
較例をもって詳細に説明する。

実施例１市販のマクロ多孔性弱アニオン交換樹脂〔フェノールホ
ルムアルデヒド系樹脂、商品名：デュオライト（Duolit
e）A-568、ダイヤモンドシャムロック社製〕10ｇを100m
lのイオン交換水に加え、次いでオレイン酸（商品名：
ルナックO-LL、花王株式会社製）２ｇを加え30℃で30分
撹拌した。次に該樹脂を溶液から濾別した後イオン交換
水にて洗浄した。

市販のリパーゼ〔リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus・j
aponicus）起源のリパーゼ製剤、商品名：リリパーゼ・
A10、大阪細菌研究所株式会社製、19,000unit／ｇ〕10
ｇをpH4.5の10mMの酢酸緩衝液100mlに溶解した。この溶
液に先に調整した樹脂を全量加え２時間撹拌した。次に
該懸濁液より樹脂を濾別し、水で洗浄した。このとき濾
液中のリパーゼ活性より求めた活性収率は96.0％とな
り、加えたリパーゼのほとんどが吸着固定化されている
事が分かった。次いで水分５％となるように常温にて減
圧乾燥を行い固定化リパーゼを得た。

このようにして得られた固定化リパーゼを１ｇ用いて、
パーム油中融点部（沃素価32.5、ジグリセリド含量4.6
％、水分0.01％以下）10ｇと市販のステアリン酸〔商品
名：ルナックS-90、ステアリン酸純度93％、水分0.01％
以下、花王株式会社製〕10ｇを加えて70℃で２時間反応
を行った。反応後カラムクロマトグラフィー（固定相フ
ロリジル、フロリジン社製、展開溶剤：ヘキサン／エチ
ルエーテル＝２／３）によりグリセリド画分を分離し、
グリセリド中に含まれるステアリン酸含量をガスクロマ
トグラフィーにより分析し、次式で示される平衡値を10
0％とした反応率を算出した。

上の式において、 St：ｔ時間後の油脂中のステアリン酸含量 So：原料油脂中のステアリン酸含量Ｓ∞：1,3ランダム平衡時のステアリン酸含量を意味する。

比較例１実施例１で用いた市販の樹脂をオレイン酸で処理するこ
となく、そのままリパーゼを固定化した以外は実施例１
と同様の方法で固定化リパーゼを得た。このとき、実施
例１と同様に求めたリパーゼの吸着率は66.2％であっ
た。

この固定化リパーゼを用い実施例１と同様にエステル交
換反応を行った。

実施例２この例では実施例１の樹脂の前処理工程において、オレ
イン酸にかえて、脂肪酸エステルとしてオレイン酸トリ
グリセリド（試薬、東京化成製）、オレイン酸ジグリセ
リド（試薬、東京化成製）、オレイン酸モノグリセリド
（商品名：エキセルO-95、花王株式会社製）、オレイン
酸エチル（試薬、東京化成製）をそれぞれ用いた以外は
全く同様の操作を行った。

実施例１〜２及び比較例１の結果を第１表にまとめて示
した。

いずれの実施例の場合も２時間で十分反応の進行が認め
られ、副生物の生成も少なかった。又、比較例１では反
応はほとんど起こらず、カラムによる連続エステル交換
反応には供せないものであった。

実施例３実施例１の樹脂の前処理工程において、オレイン酸にか
えて、リノール酸、ラウリン酸、ステアリン酸、リシノ
ール酸（以上いずれも試薬、東京化成製）、イソステア
リン酸（商品名：ダイヤドール10−GA、三菱化成工業
製）を用いた以外は全く同様の固定化操作を行った。こ
こで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様にエス
テル交換反応を行った。

これらの結果は第２表にまとめて示した。

実施例４実施例１の樹脂の前処理工程において、オレイン酸に変
えて脂肪酸誘導体（脂肪酸の多価アルコールエステル）
としてのプロピレングリコールモノオレエート（商品
名：サンソフト25-0、太陽化学株式会社製）、ソルビタ
ンモノオレエート（商品名：エマゾールO-10、花王株式
会社製）、トリグリセロールペンタオレエート（商品
名：PO-310、阪本薬品株式会社製）、ショ糖モノオレエ
ート（商品名：リョートーエステルO-1570、三菱化成食
品株式会社製）を各々用いた以外は実施例１と全く同様
の固定化操作を行った。得られた固定化酵素を用いて実
施例１と同様のエステル交換反応を行った。

これらの結果は第３表に示した。

実施例５この例は有機担体についての検索を行った例である。

実施例１で用いた弱アニオン交換樹脂にかえて、マクロ
多孔性弱アニオン交換樹脂としてデュオライトA-7、デ
ュオライトES-562、デュオライトES-771、デュオライト
A-368、フェノール系吸着樹脂としてデュオライトS-762
（以上ダイヤモンドシャムロック社製）、スチレン系マ
クロ多孔性弱アニオン交換樹脂としてダイヤイオンWA30
（三菱化成工業製）、有機高分子としてキトサン（商品
名：キトパールBC-3000、冨士紡績製）をそれぞれ用い
た以外は実施例１と同様の固定化操作を行った。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例１と同
様にエステル交換反応を行った。結果は第４表に示し
た。

実施例６この例では無機担体についての検索を行った。

実施例１で用いた弱アニオン交換樹脂にかえて、ケイ酸
カルシウム（商品名：フローライトＲ、徳山曹達株式会
社製）、合成ゼオライト（商品名：ミズカシーブス5A、
水沢化学製）、シリカビーズ（商品名：Silbead N、水
沢化学製）、球状アルミナ（商品名：Neobead D、水沢
化学製）を用いた以外は実施例１と同様の固定化操作を
行った。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例１と同
様にエステル交換反応を行った。結果は第５表に示し
た。

第５表から明らかなようにイオン交換樹脂以外にも多孔
性の吸着樹脂、天然の有機高分子、多孔性の無機担体に
おいても効果が認められた。

実施例７実施例１で用いたオレイン酸にかえて市販の大豆レシチ
ン（試薬、和光純薬製）、及びホスファチジルコリン、
ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸を
それぞれ単独で用いた以外は実施例１と同様の固定化操
作を行った。このときリン脂質の分散剤としてブタノー
ルを各々10ml用いた。

次いで実施例１と同様のエステル交換反応を行い、結果
を第６表にまとめて示した。

第６表から明らかなように、リン脂質についても顕著な
効果が認められた。

実施例８実施例１で得られた固定化リパーゼ50ｇを水分1.8％に
乾燥したものを125mlのジャケット付カラムに充填し、
そこに実施例１で用いたパーム油中融点部とステアリン
酸を等量溶解したもの（水分0.10％）をカラム内温度70
℃として180ｇ／Hrの流量でカラム上部より連続的に供
給し、カラム出口での反応率を調べた。この時のカラム
内の平均滞留時間は、約40分であり、反応原料に対する
水分は1.75％であり、初期の反応率は98％であった。14
00時間後も出口での反応率は85％を維持しており、この
間に固定化酵素１kgあたり約500kgの油脂を処理した。

実施例９実施例３でリシノール酸前処理して得た固定化酵素を水
分1.8％まで乾燥し、実施例８で用いたものと同様のジ
ャケット付カラム（内容量125ml）に50ｇ充填し、そこ
に実施例１で用いたパーム油中融点部１重量部とステア
リン酸２重量部の混合物（水分0.15％）を70℃に加温溶
解したものを、160ｇ／Hrの流量でカラム上部から連続
的に供給し、カラム出口での反応率を調べた。この時の
カラム内の平均滞留時間は、約47分であり、反応原料に
対する水分は1.81％であり、初期の反応率は95％であっ
た。1250時間後も出口での反応率は80％を維持してお
り、この間に固定化酵素１kgあたり約4000kgの反応原料
を処理した。

これらの結果から本発明の方法による処理固定化酵素は
高活性であるとともに、実用的レベルでも極めて高い耐
久性を有することが確かめられた。

実施例10 実施例１で用いたオレイン酸に変えてリシノール酸によ
り樹脂の前処理を行い、リゾプス属由来のリパーゼとし
て、リゾプス・デレマー由来（商品名：リパーゼＤ、天
野製薬株式会社製、8438unit/g）、リゾプス・ニベウス
由来（商品名：リパーゼＮ、天野製薬株式会社製、3125
0unit/g）、リゾプス・ジャワニカス由来（商品名：リ
パーゼＦ、天野製薬株式会社製、97500unit/g）の市販
リパーゼをそれぞれ10ｇ用いた以外は実施例１と同様の
固定化操作を行った。

次いで実施例１と同様のエステル交換反応を行った。

比較例２実施例10で用いた市販の樹脂をリシノール酸で処理する
ことなく、そのままリパーゼを固定化した以外は実施例
10と同様の固定化操作を行った。

ここで得た固定化リパーゼを用い、実施例１と同様のエ
ステル交換反応を行った。

実施例10及び比較例２の結果は第７表にまとめて示し
た。

これらの結果から本発明の方法はリゾプス属リパーゼ一
般に有効であることが分かった。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処理し
て得た不溶性担体と、リパーゼとを水性媒体中で吸着固
定化し、次いで得られる固定化リパーゼの存在下で油脂
類のエステル交換反応を行うことを特徴とする油脂類の
エステル交換反応方法。
【請求項２】不溶性担体がマクロ多孔性担体である特許
請求の範囲第１項記載のエステル交換反応方法。
【請求項３】リパーゼがリゾプス（Rhizopus）属由来の
ものである特許請求の範囲第１項又は第２項記載のエス
テル交換反応方法。
【請求項４】固定化リパーゼを水分２％以下に乾燥した
後カラムに充填し、反応を無溶剤で連続的に行うことを
特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか一
項に記載のエステル交換反応方法。
【請求項５】反応原料の水分が0.01〜0.2％であり、カ
ラム内の平均滞留時間が２時間以内である特許請求の範
囲第４項記載のエステル交換反応方法。