JPH01153097A - 油脂類のエステル交換反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、エステル交換反応に適した固定化リパーゼを
用い、比較的高温度で油脂類のエステル交換反応を連続
的に行う方法に関するものである。

〔従来の技術〕

脂質分解酵素の１種であるリパーゼは温和な条件下で反
応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を
有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換
反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパー
ゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系での
み進みうる反応である。一方リパーゼのエステル合成活
性や交換活性を増大せしめるためには、酵素として少量
の水分を特徴とする特開昭５５−７１７９７号公報に開
示された低水分系の反応では、充分な反応速度が得られ
ず、また反応速度を増大させるために必要以上の水分を
与えると、エステルの分解反応が優先的に進行するとい
う問題点がある。また特開昭６０−１９４９５号公報及
び特開昭６０−２０３１９６号公報に開示された、反応
を多水分系の分解工程と、水分を除去する合成工程の二
段階に分けて行う方法の提案もあるが、後者の合成反応
速度は通常のエステル交換速度に比して充分であるとは
言えず、工程操作の複雑化も避けられない。

以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。

リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均
一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを
不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散
可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるため
、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすくな
る。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使用
がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業的
実施においても反応装置の連続化が容易となる点等であ
る。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。

例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｏ
ｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ’５Ｓｏｃ’１ｅｔｙ、第６０巻
、　２９１−２９４（１９８３）にも微量な水分を与え
た場合加水分解反応が進行することが指摘されている。

また、水に代えてグリセリンのような多価アルコールを
添加した場合では加水分解反応はある程度抑制されるが
、エステル合成・交換反応は遅くなる。また、酵素水分
の保持を狙い多孔質担体、高吸水性樹脂をキトサンで包
括結合後、粉砕した担体を用いる方法（特開昭５９−２
１３３９０号公報）によっても固定化酵素のエステル合
成・交換反応と分解反応を両立させるため、二段階反応
法（特開昭６０−２０３１９６号公報）を採用している
。また特開昭６０−９８９８４号公報および特開昭６１
−２０２６８８号公報には耐熱性を持ち８０°Ｃまでの
反応が可能なエステル交換、エステル合成を目的とした
固定化酵素についての開示もあるが、この固定化方法が
有効なのはムコール属の特定のリパーゼのみであり、ム
コール属由来のリパーゼを固定化して用いた場合でも、
６０℃〜８０℃という温度では、ジグリセリドの１．２
位から１．３位への酵素的および非酵素的転移が速く、
カカオ脂に類似したグリセリドの２位にオレイン酸を多
く含有する対称型油脂の製造を目的とする場合には、よ
りエステル交換反応速度の速い固定化酵素の開発が望ま
れる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

以上のようにエステル交換反応においては反応系内の水
分を確実にコントロールするか、またはよりエステル交
換活性の高い固定化酵素の開発が望まれる。

水分コントロールについては先に述べた二段階反応（特
開昭６０−２０３１９６号公報）においても行われてい
るが、装置的にも煩雑であること、また第１段の分解工
程において１．２−ジグリセリドを選択的、高収率で得
ることと、更に第２段で１．２−ジグリセリドから１．
３−ジグリセリドへの転移をさせることなく、選択的に
トリグリセリドを合成することは難しく、特に温度が高
くなるほどこの転移の悪影響を抑える事は難しくなり、
溶剤の使用等が必要となる制約された条件に限られる。

リパーゼのエステル交換活性を増加させる方法として、
特開昭６０−２５１８８４号公報に開示されたリパーゼ
に油脂を加え加水分解反応をさせることにより、油脂と
脂肪酸の共存下で固定化を行う方法や、特開昭６２−１
３４０９０号公報に開示された脂肪酸誘導体の共存下に
乾燥する方法があるが、こうした方法により得られた固
定化リパーゼのエステル交換活性は前述の工業的実施に
あたっては実質的には未だ充分であるとは言えない。

一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特
開昭５２−８７２９３号公報に開示されたイオン交換樹
脂の有機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する
方法や、特開昭５３−２７７８７号公報に開示された多
糖類の高級脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを固定
化する方法、あるいはＥｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

に記載されたＹ、Ｋｉｍｕｒａ等のイオン交換樹脂にリ
パーゼを単にイオン結合により固定化する方法等の従来
の方法ではいずれも低収率にとどまり、他の夾雑物の共
存下でリパーゼを選択的に固定化することは極めて困難
であると考えられていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らはリパーゼのエステル交換活性を増
大させる因子について鋭意研究を重ねた結果、リパーゼ
に脂肪酸又はその誘導体を共存させることによりエステ
ル交換活性の増大が見られる事実を発見した。更に本発
明者らはこの事実をもとに、脂肪酸又はその誘導体を種
々の不溶性担体上に吸着させる事に応用し、本発明を完
成するに到ったのである。

即ち、本発明は、脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処
理して得た不溶性担体と、リパーゼとを水性媒体中で吸
着固定化し、次いで得られる固定化リパーゼの存在下で
油脂類のエステル交換反応を行うことを特徴とする油脂
類のエステル交換反応方法に係わるものである。

従来、リパーゼと脂肪酸又はその誘導体との関係につい
ては、醗酵生産において誘導基質として添加されたり、
ある種の不飽和脂肪酸または脂肪酸誘導体がある種のリ
パーゼの分解活性を活性化することが報告されているに
すぎない。

詳細には、サツカロマイセス・リポリティカのリパーゼ
の分解活性をオレイン酸（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　４６．２８８５（１９８２））やヒドロ
キシ脂肪酸（３゜５−ジヒドロキシ−７−テトラデセン
酸）が活性化すること（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、＋　５０＋　　２５２３（１９８６））　、ヒ
マ種子中のリパーゼがヒドロキシ脂肪酸誘導体（リシル
レート・テトラマー（Ｒｉ−ｃｉｎｏｌｅａｔｅ　ｔｅ
ｔｒａｍｅｒ））の分解活性発現に必要なことが報告さ
れているにすぎない。

また、リパーゼとリン脂質との関係についても、岩井ら
により１９６９年の日本生化学台において報告されて以
来、多くの報告がなされたが、加水分解反応での基質特
異性の変化についてか、または醗酵生産の安定化、誘導
についてのみであり、エステル交換反応での活性化につ
いての報告は見られない。

これに対し本発明においては、具体的にはリパーゼを含
む溶液に不溶性担体を添加し該担体上にリパーゼを固定
化する際に、予め不溶性担体に脂肪酸又はその誘導体を
吸着させた後、乾燥もしくは乾燥せずそのままりパーゼ
を固定化させる事により、リパーゼの選択的吸着とエス
テル交換活性の著しい上昇が見られたのである。

本発明の方法の最も好ましい点としては、第一に酵素を
含む培養液など他の夾雑蛋白質や他の物質の中から酵素
を短時間かつ高収率に固定化できる点である。

第二にリパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のこ
とながら水と油脂の界面で働（ため、水溶液で使用した
場合には、界面と水溶液中にリパーゼの分散する平衡が
存在すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用
できない。しかし固定化により担体表面上に並べること
ができれば、用いた酵素を効率良（利用する事が可能と
なる。

第三に担体に脂肪酸又はその誘導体を吸着させておくこ
とにより脂質分解酵素を活性化して固定化できる事がわ
かった。これは、前述した様に界面で働く脂質分解酵素
は、界面に配向した時に活性を発現する高次構造をとる
。このため、界面に配向しかつ活性化した状態で酵素を
固定化する事が重要である。この高活性な状態を作り出
すのに必要な水不溶性の物質として脂肪酸又はその誘導
体が非常に良好であることがわかった。またこの様にし
て得られた固定化酵素は従来困難とされていた低水分下
でも十分な活性を発現できる点である。

すでに本出願人はこれらの知見を応用して、少量の水と
油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界面
に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成し
特許出願した（特開昭６０−２５１８８４号公報）。今
回本発明者らは、さらにこれらの事実を解明し、各種の
不溶性担体に脂肪酸又はその誘導体を予め吸着させるこ
とに応用し、該担体と酵素を接触固定化する際に、酵素
を活性化すると同時に短時間でかつ高濃度に該担体上に
固定化が可能となり、高活性な固定化酵素を製造できる
という本発明の完成に至ったものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の方法においては、水不溶性の担体に脂肪酸又は
その誘導体を水もしくは有機溶剤中で接触させる事によ
り該担体上に吸着処理し、必要に応じて液液から濾過し
た後乾燥するか、またはそのまま酵素水性溶液もしくは
酵素を含む培養液と接触させる。接触時間としては１分
〜２０時間、好ましくは３０分〜２時間がよい。次いで
該溶液より不溶性担体を濾過し水または緩衝液により洗
浄する。こうして得られた固定化酵素を水分５％以下、
好ましくは２％以下まで乾燥させ本発明の固定化酵素を
得る。

本発明に用いる酵素としては、リゾプス・ジャバニカス
、リゾプス・デレマー、リゾプス・ニベウス、リゾプス
・ジャバニカス等のリゾプス属由来の微生物リパーゼが
好ましく、トリグリセリドの１，３位にのみ反応する位
置選択性に優れたものが特に好ましい。

本発明に用いられる不溶性の担体としては、水およびア
ルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何
れでも良く、ケイソウ土、セライト、カオリナイト、パ
ーライト、モレキュラーシープ、多孔質ガラス、活性炭
、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、および
セルロースパウダー、ポリビニルアルコール、キトサン
、イオン交換樹脂、吸着樹脂、キレート樹脂等の有機高
分子の様なリパーゼ活性に影響を与えず、操作上から物
理的・化学的に安定なものであれば何れも使用できる。

特に、不溶性担体内に疎水性の部分を持つもの、例えば
樹脂中の−ＧＨｚ一部分の多いもの、官能基にアルキル
基の入ったものが、脂質分解酵素の吸着性や基質として
の脂質との相性からも好ましい。

また担体の疎水性が特に高い場合は、固定化時にアンチ
カオトロピックイオンとなる塩（例えば硫酸アンモニウ
ム等）を加えることにより、固定化収率の向上が見られ
る。また担体の形状としては、粉末状、顆粒状、繊維状
、スポンジ状等種々あるが、そのいずれでも使用できる
。

特に工程操作上の面からは４００〜１０００−の粒径を
有し、細孔径１００〜１５００人の多孔性担体を用いる
ものが好適である。特に好ましい固定化担体としては、
特開昭６０−９８９８４号公報記載のマクロ多孔性弱ア
ニオン交換樹脂があり、市販入手可能なものとしてダイ
ヤモンドジャムロック社のデュオライトＡ−５６８、デ
ュオライトＳ−７６２等のマクロ多孔性の弱アニオン交
換樹脂及び吸着樹脂が挙げられる。

本発明で用いる脂肪酸としては炭素数２〜３６のものが
好ましく、更に好ましくは８〜１８のものであり、例え
ば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等の直鎖飽
和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、
リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、もしくはイソステ
アリン酸等の分岐状の脂肪酸が挙げられる。

本発明に用いられる脂肪酸誘導体としては、炭素数２〜
３６好ましくは８〜１８の脂肪酸と水酸基を有する化合
物とのエステルが挙げられ、１価アルコールエステル、
多価アルコールエステル、リン脂質、あるいはこれらの
エステルにさらにエチレンオキシドを付加した誘導体等
が例示される。１価アルコールエステルとしては、メチ
ルエステル、エチルエステル等が、多価アルコールエス
テルとしては、モノグリセリド、ジグリセリド、および
それらの誘導体、あるいはプロピレングリコール、ポリ
グリセリン等の多価アルコールの脂肪酸エステル、シヨ
糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等が挙げ
られる。

本発明に用いるリン脂質の例としては、市販大豆レシチ
ン、卵黄レシチン等の粗製およびまたは精製混合レシチ
ン等を用いてもよく、−またこれらを分画して得たホス
ファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジン酸、カルシオリピン等を単独または混合
して用いてもよい。また各種合成法により得た合成リン
脂質およびこれらの誘導体も用いることができる。

上記の脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温で液状であ
ることが工程操作上好ましいが、これに限定されるもの
ではない。またこれらは単体で用いてもよいが、適当な
組み合わせにより一層の効果が発揮される。また広範な
脂肪酸誘導体が使用可能なのは、これら誘導体が特に水
性媒体中では化学的に、もしくはリパーゼにより酵素的
に加水分解され、脂肪酸を生成するためと想像される。

脂肪酸又はその誘導体と水不溶性担体との接触方法とし
ては、水もしくは有機溶剤中にこれらの物質をそのまま
加えても良いが、分散性を良くするため溶剤に一旦脂肪
酸又はその誘導体を分散・溶解させた後、水に分散させ
た担体に加えることもよい。適当な有機溶剤としてはク
ロロホルム、ｎ−ヘキサン等が挙げられる。脂肪酸又は
その誘導体と不溶性担体の比率は、不溶性担体１重量部
（乾燥重量）に対し脂肪酸又はその誘導体０．０１〜１
重量部、より好ましくは０．０５〜０．５重量部が適当
であるが、これに限定されるものではない。適当な接触
温度としては０〜１００°Ｃ１好ましくは２０〜６０″
Ｃがよい。適当な処理時間としては５分〜５時間程度で
良く、これらの接触処理した後の担体は必要に応じて該
溶液より濾別した後−旦乾燥する。適当な乾燥温度とし
ては室温〜１００°Ｃが良く、減圧下での乾燥が乾燥速
度の点から好ましいが、これに限定されるものではない
。

本発明において固定化を行う温度としては、酵素の失活
の起きない温度であればよく、０〜６０°Ｃ１好ましく
は２０〜４０゛Ｃがよい。また酵素溶液のｐｔ＋は酵素
の変性が起きないような範囲であればよく、ｐＨ３〜９
、特にｐＨ４〜６とすることがよい。また酵素溶液に用
いる緩衝液の種類は特に規定しないが、−船釣な酢酸緩
衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いること
ができる。

本発明における固定化方法において、水溶液中の酵素濃
度は特に限定されないが、固定化効率の点から前記酵素
の溶解度以下でかつ充分な濃度であることが望ましい。

また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去し、上澄
を使用しても良い。また酵素と固定化担体の使用割合は
固定化担体１重量部に対して、酵素０．０１〜１０重量
部、特に０．０５〜５重量部が好ましいが、特にこれに
限定されるものではない。

本発明において酵素溶液に固定化担体を接触させて固定
化させた後に、該固定化担体を溶液より濾別し、水分５
％以下、好ましくは１，５〜２％に乾燥させることが後
のカラムにおける連続エステル交換反応を行うために有
効である。

乾燥方法としては室温〜６０°Ｃでの減圧乾燥が高いエ
ステル交換活性発現のために好ましいが、これに限定さ
れるものではない。

本発明による固定化酵素は低水分下でも高いエステル交
換活性を発現するため、十分な反応速度の実現と副反応
の抑制が可能となり、目的とするエステル交換脂の収率
及び品質の向上が計れる。

本発明のエステル交換に用いる油脂としては大豆油、オ
リーブ油、パーム油等の植物油脂、牛脂、豚脂、魚油等
の動物油脂が挙げられる。

これらの油脂は単独で用いてもよいが２種以上の油脂を
用いるか、油脂と高級脂肪酸或いは油脂と高級脂肪酸の
低級アルコールエステル間でエステル交換することが好
ましい。特定の油脂と他の油脂、脂肪酸もしくはその誘
導体間でエステル交換する場合、両者の量比は特定の油
脂１重量部に対し、他の油脂、脂肪酸もしくはその誘導
体は０．０５〜２０重量部、好ましくは０．１〜１０重
量部でないと油脂の改質効果は得られにくい。特に好ま
しくは、パーム油等の２位にオレイン酸残基を多く含有
する油脂とステアリン酸とのエステル交換である。この
反応においてはステアリン酸の融点が高く、油脂の粘度
が高いため、カラム反応で連続エステル交換反応を無溶
剤で行うためには、反応系の温度を６０〜９０°Ｃに保
つ必要がある。本発明の固定化酵素はこの目的に好適で
あり、また得られる油脂はチョコレート用として有用な
ものである。

本発明のカラムにおける連続エステル交換反応方法とし
ては、水不溶性の担体に脂肪酸又はその誘導体を水もし
くは有機溶剤中で接触させることにより該担体上に吸着
処理し、液液から濾過した後−旦乾燥し、次いでリパー
ゼ水性溶液もしくはリパーゼを含む培養液と接触させた
後、該溶液より不溶性担体を濾過し、水又は緩衝液によ
り洗浄して得られた固定化リパーゼを、水分１．５〜２
％に乾燥させた後、任意の大きさのカラムに充填し、カ
ラム上部又は下部より反応原料を連続的に供給する。反
応原料の組成は、油脂単独でも良いが、２種以上の油脂
を用いるか、油脂と高級脂肪酸あるいは油脂と高級脂肪
酸の低級アルコールエステル、油脂と高級アルコールで
も良い。特定の油脂と他の油脂、脂肪酸もしくはその誘
導体間でエステル交換する場合、両者の量比は特定の油
脂１重量部に対し他の油脂、脂肪酸又は脂肪酸誘導体は
０．０５〜２０重量部、好ましくは０．１〜１０重量部
でないと油脂の改質効果は得られにくい。反応原料の供
給速度はカラム内での平均滞留時間が２時間以内、好ま
しくは１０分〜６０分となるような供給速度とすること
が目的とする油脂の改質効果を得るために必要である。

必要以上に滞留時間を長くした場合、又は活性の不十分
な酵素を用いた場合では、副反応による生成物（飽和ト
リグリセリド、ジグリセリド等）が増加し、目的とする
油脂の改質効果が得にくい。又、反応原料中の水分は０
．０１〜０．２％とし、かつカラム内の反応原料に対す
る水分の合計が１．５〜２．０％となる様に制御するこ
とが望ましいが、これに限定されるものではない。供給
原料中の水分が０．２％以上では副反応の加水分解によ
るジグリセリドの生成が多くなり、製品の品質低下は避
けられない。また、０．０１％以下では工業的実施にあ
たって十分な生産性が得られない。カラムの操作温度と
しては４０〜９０℃、特に融点が６０℃以上の反応原料
を用いる場合には６０〜９０°Ｃで行うことが良い。

本発明において、固定化前の担体に、多官能性試薬を用
いて架橋することにより、固定化酵素の繰り返し使用に
おける耐久性向上をはかることができる。多官能性の架
橋試薬としては、グリオキザール、グルタルアルデヒド
、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒドなどのポリ
アルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジチオイソシ
アネート、Ｎ、Ｎ”−エチレンビスマレイミドなども使
用可能である。また、カルボジイミド類も使用できる。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、リパーゼの持つエステル交換活性を十
分に発揮させる為のものであり、脂肪酸又はその誘導体
を不溶性担体上に予め吸着させておくことにより、酵素
の選択的吸着固定化が可能となり、同時にエステル交換
活性の増大が起こる事を発見した結果から得たものであ
る。

また、特開昭６２−１３４０９０号公報に開示された方
法と異なり、脂肪酸もしくはその誘導体と、担体、酵素
を単に共存させて固定化するのではなく、担体を脂肪酸
又はその誘導体で前処理するため、この前処理段階で幅
広い溶剤の選択が可能となる。すなわちステアリン酸等
の固体脂肪酸をブタノール、ヘキサン等の溶剤に溶解し
、担体への吸着終了後、溶剤を除去し、固定化操作に供
することも可能である。

本発明では位置選択性リパーゼを高い活性を保ったまま
固定化しているため、低水分下でも十分な反応速度を維
持できるため、グリセリドの２位にオレイン酸を多く含
有する油脂と、飽和の脂肪酸とのアシドリシス反応によ
り、天然のカカオ脂に類似した構造を有する対称型の油
脂の製造を目的とした場合に、ジグリセリドの副生およ
び非対称型への転移とそれに伴う三飽和グリセリドの副
生の低減が可能となる。

以上のように本発明により、リパーゼを界面での活性型
にした状態で固定化することにより低水分下でもエステ
ル交換活性が増大することを発見し、簡便かつ廉価に固
定化酵素を製造することができ、効率的なエステル交換
反応の工業的実施が可能となった。

〔実施例〕

以下、本発明のエステル交換反応について、実施例、比
較例をもって詳細に説明する。

実施例１ 市販のマクロ多孔性間アニオン交換樹脂〔フェノールホ
ルムアルデヒド系樹脂、商品名：デュオライト（Ｄｕｏ
ｌｉｔｅ）　Ａ−５６８、ダイヤモンドシャムロツタ社
製〕１０ｇを１００　ｍｌのイオン交換水に加え、次い
でオレイン酸（商品名ニルナック０−ＬＬ、花王株式会
社製）２ｇを加え３０°Ｃで３０分撹拌した。次に該樹
脂を溶液から濾別した後イオン交換水にて洗浄した。

市販のリパーゼ〔リゾプス・ジャポニカス（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ−ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）起源のリパーゼ製剤、商
品名：リリパーゼ・＾１０、大阪細菌研究所株式会社製
、１９．０ＯＯｕｎｉ　ｔ／　ｇ　）　１０　ｇをｐｌ
！　４．５の１０１の酢酸緩衝液１００　ｍＺに溶解し
た。この溶液に先に調整した樹脂を全量加え２時間撹拌
した。

次に該懸濁液より樹脂を濾別し、水で洗浄した。

このとき濾液中のリパーゼ活性より求めた活性収率は９
６．０％となり、加えたリパーゼのほとんどが吸着固定
化されている事が分かった。次いで水分５％となるよう
に常温にて減圧乾燥を行い固定化リパーゼを得た。

このようにして得られた固定化リパーゼを１ｇ用いて、
パーム油中融点部（沃素価３２．５、ジグリセリド含量
４．６％、水分０．０１％以下）１０ｇと市販のステア
リン酸〔商品名ニルナック５−９０、ステアリン酸純度
９３％、水分０．０１％以下、花王株式会社製３１０ｇ
を加えて７０°Ｃで２時間反応を行った。反応後カラム
クロマトグラフィー（固定相フロリジル、フロリジン社
製、展開溶剤：ヘキサン／エチルエーテル−２／３　）
によりグリセリド画分を分離し、グリセリド中に含まれ
るステアリン酸含量をガスクロマトグラフィーにより分
析し、次式で示される平衡値を１００％とした反応率を
算出した。

上の式において、 Ｓｔ：を時間後の油脂中のステアリン酸含量Ｓｏ：原料
油脂中のステアリン酸含量 ＳＯＯ？　１．３ランダム平衡時のステアリン酸含量を
意味する。

比較例１ 実施例１で用いた市販の樹脂をオレイン酸で処理するこ
となく、そのままリパーゼを固定化した以外は実施例１
と同様の方法で固定化リパーゼを得た。このとき、実施
例１と同様に求めたリパーゼの吸着率は６６．２％であ
った。

この固定化リパーゼを用い実施例１と同様にエステル交
換反応を行った。

実施例２ この例では実施例１の樹脂の前処理工程において、オレ
イン酸にかえて、脂肪酸エステルとしてオレイン酸トリ
グリセリド（試薬、東京化成製）、オレイン酸ジグリセ
リド（試薬、東京化成製）、オレイン酸モノグリセリド
（商品名：エキセル０−９５、花王株式会社製）、オレ
イン酸エチル（試薬、東京化成製）をそれぞれ用いた以
外は全く同様の操作を行った。

実施例１〜２及び比較例１の結果を第１表にまとめて示
した。

いずれの実施例の場合も２時間で十分反応の進行が認め
られ、副生物の生成も少なかった。

又、比較例１では反応はほとんど起こらず、カラムによ
る連続エステル交換反応には供せないものであった。

第　　　　１　　　　表 実施例３ 実施例１の樹脂の前処理工程において、オレイン酸にか
えて、リノール酸、ラウリン酸、ステアリン酸、リシノ
ール酸（以上いずれも試薬、東京化成製）、イソステア
リン酸（商品名；ダイヤドール１０−　ＧＡ、三菱化成
工業型）を用いた以外は全く同様の固定化操作を行った
。ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様に
エステル交換反応を行った。

これらの結果は第２表にまとめて示した。

第　　　　２　　　　表 実施例４ 実施例１の樹脂の前処理工程において、オレイン酸に変
えて脂肪酸誘導体（脂肪酸の多価アルコールエステル）
としてのプロピレングリコールモノオレエート（商品名
：サンソフト２５−０、太陽化学株式会社製）、ソルビ
タンモノオレエート（商品名：エマゾール０−１０、花
王株式会社製）、トリグリセロールペンタオレエート（
商品名：ＰＯ−３１０、阪本薬品株式会社製）、ショ糖
モノオレエート（商品名：リョートーエステルＱ−１５
７０、三菱化成食品株式会社製）を各々用いた以外は実
施例１と全く同様の固定化操作を行った。得られた固定
化酵素を用いて実施例１と同様のエステル交換反応を行
った。

これらの結果は第３表に示した。

第　　　　３　　　　表 実施例５ この例は有機担体についての検索を行った例である。

実施例１で用いた弱アニオン交換樹脂にかえて、マクロ
多孔性弱アニオン交換樹脂としてデュオライトＡ−７、
デュオライトＥＳ−５６２、デュオライトＥｓ−７７１
、デュオライトＡ−３６８、フェノール系吸着樹脂とし
てデュオライ）Ｓ−７６２（以上ダイヤモンドジャムロ
ック社製）、スチレン系マクロ多孔性弱アニオン交換樹
脂としてダイヤイオンＷ＾３０（三菱化成工業型）、有
機高分子としてキトサン（商品名：キトパールＢＧ−３
０００、富士紡績製）をそれぞれ用いた以外は実施例１
と同様の固定化操作を行った。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例１と同
様にエステル交換反応を行った。結果は第４表に示した
。

第　　　　４　　　　表 実施例に の例では無機担体についての検索を行った。

実施例１で用いた弱アニオン交換樹脂にかえて、ケイ酸
カルシウム（商品名：フローライトＲ１徳山曹達株式会
社製）、合成ゼオライト（商品名：ミズ力シーブス５Ａ
、水沢化学製）、シリカビーズ（商品名：　５ｉｌｂｅ
ａｄ　Ｎ、水沢化学製）、球状アルミナ（商品名：　Ｎ
ｅｏｂｅａｄ　Ｄ　、水沢化学製）を用いた以外は実施
例１と同様の固定化操作を行った。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例１と同
様にエステル交換反応を行った。結果は第５表に示した
。

第５表から明らかなようにイオン交換樹脂以外にも多孔
性の吸着樹脂、天然の有機高分子、多孔性の無機担体に
おいても効果が認められた。

第　　　　５　　　　表 実施例７ 実施例１で用いたオレイン酸にかえて市販の大豆レシチ
ン（試薬、和光純薬製）、及びホスファチジルコリン、
ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸を
それぞれ単独で用いた以外は実施例１と同様の固定化操
作を行った。このときリン脂質の分散剤としてブタノー
ルを各々１０＠ｌ用いた。

次いで実施例１と同様のエステル交換反応を行い、結果
を第６表にまとめて示した。

第６表から明らかなように、リン脂質についても顕著な
効果が認められた。

第　　　　６　　　　表 実施例８ 実施例１で得られた固定化リパーゼ５０ｇを水分１．８
％に乾燥したものを１２５−のジャケット付カラムに充
填し、そこに実施例１で用いたパーム油中融点部とステ
アリン酸を等量溶解したもの（水分０．１０％）をカラ
ム内温度７０°Ｃとして１８０　ｇ／ｌｌｒの流量でカ
ラム上部より連続的に供給し、カラム出口での反応率を
調べた。この時のカラム内の平均滞留時間は、約４０分
であり、反応原料に対する水分は１．７５％であり、初
期の反応率は９８％であった。１４００時間後も出口で
の反応率は８５％を維持しており、この間に固定化酵素
１ｋｇあたり約５０００ｋｇの油脂を処理した。

実施例９ 実施例３でリシノール酸前処理して得た固定化酵素を水
分１．８％まで乾燥し、実施例８で用いたものと同様の
ジャケット付カラム（内容量１２５ｄ）に５０ｇ充填し
、そこに実施例１で用いたパーム油中融点部１重量部と
ステアリン酸２重量部の混合物（水分０．１５％）を７
０°Ｃに加温溶解したものを、１６０ｇ／Ｈｒの流量で
カラム上部から連続的に供給し、カラム出口での反応率
を調べた。この時のカラム内の平均滞留時間は、約４７
分であり、反応原料に対する水分は１．８１％であり、
初期の反応率は９５％であった。１２５０時間後も出口
での反応率は８０％を維持しており、この間に固定化酵
素１ｋｇあたり約４０００ｋｇの反応原料を処理した。

これらの結果から本発明の方法による処理固定化酵素は
高活性であるとともに、実用的レベルでも極めて高い耐
久性を有することが確かめられた。

実施例１０ 実施例１で用いたオレイン酸に変えてリシノール酸によ
り樹脂の前処理を行い、リゾプス属由来のリパーゼとし
て、リゾプス・デレマー由来（商品名：リパーゼＤ、天
野製薬株式会社製、８４３８ｕｎｉｔ／ｇ）　、リゾプ
ス・ニベウス由来（商品名：リパーゼＮ、天野製薬株式
会社製、３１２５０ｕｎｉｔ／ｇ）　、リゾプス・ジャ
ワニカス由来（商品名：リパーゼＦ、天野製薬株式会社
製、９７５００ｕｎｉｔ／ｇ）の市販リパーゼをそれぞ
れ１０ｇ用いた以外は実施例１と同様の固定化操作を行
った。

次いで実施例１と同様のエステル交換反応を行った。

比較例２ 実施例１０で用いた市販の樹脂をリシノール酸で処理す
ることなく、そのままリパーゼを固定化した以外は実施
例１０と同様の固定化操作を行った。

ここで得た固定化リパーゼを用い、実施例１と同様のエ
ステル交換反応を行った。

実施例１０及び比較例２の結果は第７表にまとめて示し
た。

第　　　　７　　　　表 これらの結果から本発明の方法はリゾプス属すパーゼ一
般に有効であることが分かった。

出願人代理人　　古　谷　　　馨

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処理して得た不
   溶性担体と、リパーゼとを水性媒体中で吸着固定化し、
   次いで得られる固定化リパーゼの存在下で油脂類のエス
   テル交換反応を行うことを特徴とする油脂類のエステル
   交換反応方法。 ２、不溶性担体がマクロ多孔性担体である特許請求の範
   囲第１項記載のエステル交換反応方法。 ３、リパーゼがリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来の
   ものである特許請求の範囲第１項又は第２項記載のエス
   テル交換反応方法。 ４、固定化リパーゼを水分２％以下に乾燥した後カラム
   に充填し、反応を無溶剤で連続的に行うことを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか一項に記載
   のエステル交換反応方法。 ５、反応原料の水分が０．０１〜０．２％であり、カラ
   ム内の平均滞留時間が２時間以内である特許請求の範囲
   第４項記載のエステル交換反応方法。