JPH01153091A - 脂質分解酵素および該酵素を用いたエステル合成、交換反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、固定化された脂質分解酵素（リパーゼ、ホス
ホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ等、以後酵素
と略称する場合もある）及びそのエステル合成、交換反
応への利用に関するものである。

〔従来の技術〕

エステル類の合成反応は、脂肪族１価アルコールと脂肪
酸によるワックスエステルの合成、モノグリセリド、ポ
リグリセリン脂肪酸エステル、糖エステルといった多価
アルコールと脂肪酸によるエステル合成、コレステリル
パルミテ−ト等のステロイドエステル類、ゲラニルブチ
レート等のテルペンアルコールエステル類の製造方法と
して重要な技術である。

油脂類のエステル交換反応は、マーガリン・ショートニ
ング等の食用加工油脂の改質等に用いられるものとして
水素添加と並ぶ重要な技術である。

リン脂質についても、通常トランスホスファチシレージ
ョンとして知られる塩基交換反応は有用な生理活性物質
等の製造方法として重要な技術である。

脂質分解酵素の１種であるリパーゼは温和な条件下で反
応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を
有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換
反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパー
ゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系での
み進みうる反応である。一方リパーゼのエステル合成活
性や交換活性を増大せしめるためには、酵素として少量
の水分を特徴とする特開昭５５−７１７９７号公報に開
示された低水分系の反応では、充分な反応速度が得られ
ず、また反応速度を増大させるために必要以上の水分を
与えると、エステルの分解反応が優先的に進行するとい
う問題点がある。また特開昭６０−１９４９５号公報及
び特開昭６０−２０３１９６号公報に開示された、反応
を多水分系の分解工程と、水分を除去する合成工程の二
段階に分けて行う方法の提案もあるが、後者の合成反応
速度は通常のエステル交換速度に比して充分であるとは
言えず、工程操作の複雑化も避けられない。

以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。

リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均
一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを
不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散
可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるため
、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすくな
る。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使用
がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業的
実施においても反応装置の連続化が容易となる点等であ
る。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。

例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｏ
ｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ’５Ｓｏｃｉｅｔｙ、第６０巻、
　２９１−２９４（１９８３）にも微量な水分を与えた
場合加水分解反応が進行することが指摘されている。ま
た、水に代えてグリセリンのような多価アルコールを添
加した場合では加水分解反応はある程度抑制されるが、
エステル合成・交換反応は遅くなる。また、酵素水分の
保持を狙い多孔質担体、高吸水性樹脂をキトサンで包括
結合後、粉砕した担体を用いる方法（特開昭５９−２１
３３９０号公報）によっても固定化酵素のエステル合成
・交換反応と分解反応を両立させるため、二段階反応法
（特開昭６０−２０３１９６号公報）を採用している。

また特開昭６０−９８９８４号公報および特開昭６１−
２０２６８８号公報には耐熱性を持ち８０°Ｃまでの反
応が可能なエステル交換、エステル合成を目的とした固
定化酵素についての開示もあるが、その特徴とする６０
°Ｃ〜８０°Ｃという温度では、ジグリセリドの１，２
位から１．３位への酵素的および非酵素的転移が速く、
カカオ脂に類似したグリセリドの２位にオレイン酸を多
く含有する対称型油脂の製造を目的とする場合には、よ
りエステル交換反応速度の速い固定化酵素の開発が望ま
れる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

以上のようにエステル合成および交換反応においては反
応系内の水分を確実にコントロールするか、またはより
エステル合成および交換活性の高い固定化酵素の開発が
望まれる。

エステル交換反応についてみると、水分コントロールに
ついては先に述べた二段階反応（特開昭６０−２０３１
９６号公報）においても行われているが、装置的にも煩
雑であること、また第１段の分解工程において１，２−
ジグリセリドを選択的、高収率で得ることと、更に第２
段で１，２−ジグリセリドから１，３−ジグリセリドへ
の転移をさせることなく、選択的にトリグリセリドを合
成することは難しく、特に温度が高くなるほどこの転移
の悪影響を抑える事は難しくなり、溶剤の使用等が必要
となる制約された条件に限られる。

またエステル合成反応についてみると、従来の方法では
ほとんどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、
分解と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、
目的とするエステルの収量は低いものにとどまっている
（特開昭５１−７７５４号公報、特開昭６１−１８７７
９５号公報）。

しかし固定化酵素によって反応を行えば、より低水分条
件下においてもエステル合成が行われ、酵素の回収も容
易であるが、この場合においても通常の化学的方法と同
等の反応速度を得るためには、より高活性な固定化酵素
の開発が望まれる。

リパーゼのエステル合成およびエステル交換活性を増加
させる方法として、特開昭６０−２５１８８４号公報に
開示されたリパーゼに油脂を加え加水分解反応をさせる
ことにより、油脂と脂肪酸の共存下で固定化を行う方法
や、特開昭６２−１３４０９０号公報に開示された脂肪
酸誘導体の共存下に乾燥する方法があるが、こうした方
法により得られた固定化リパーゼのエステル合成活性お
よびエステル交換活性は前述の工業的実施にあたっては
実質的には未だ充分であるとは言えない。

一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特
開昭５２−８７２９３号公報に開示されたイオン交換樹
脂の有機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する
方法や、特開昭５３−２７７８７号公報に開示された多
糖類の高級脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを固定
化する方法、あるいはＥｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

に記載されたＹ、　Ｋｉｍｕｒａ等のイオン交換樹脂に
リパーゼを単にイオン結合により固定化する方法等の従
来の方法ではいずれも低収率にとどまり、他の夾雑物の
共存下でリパーゼを選択的に固定化することは極めて困
難であると考えられていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは脂質分解酵素のエステル合成及び
エステル交換活性を増大させる因子について鋭意研究を
重ねた結果、脂質分解酵素にアルコール類、エーテル類
、カルボニル化合物類、ハロゲン化アルキル類から選ば
れた１種もしくは２種以上の油溶性化合物を共存させる
ことにより、分解活性のみならずエステル合成及びエス
テル交換活性の増大が見られる事実を発見した。更に本
発明者らはこの事実をもとに、前記化合物と共に脂質分
解酵素を種々の不溶性担体上に吸着させる事に応用し、
本発明を完成するに到ったのである。

即ち、本発明は、アルコール類、エーテル類、カルボニ
ル化合物類、ハロゲン化アルキル類から選ばれた１種も
しくは２種以上の油溶性化合物の存在下で不溶性担体に
固定化された脂質分解酵素、この脂質分解酵素を用いる
エステル合成反応方法及びエステル交換反応方法に係わ
るものである。

本発明は、具体的には脂質分解酵素を含む溶液に不溶性
担体を添加し該担体上に脂質分解酵素を固定化する際に
、予め脂質分解酵素に前記油溶性化合物を接触結合させ
るか、又は予め不溶性担体に前記油溶性化合物を吸着さ
せた後、乾燥もしくは乾燥せずそのまま酵素を固定化さ
せる事により、酵素の選択的吸着と分解活性のみならず
エステル合成活性およびエステル交換活性の著しい上昇
が見られたのである。

本発明の方法の最も好ましい点としては、第一に前記油
溶性化合物を脂質分解酵素に接触結合させておくことに
より著しく活性化できる点である。これは前述した様に
界面で働く脂質分解酵素は、界面に配向した時に活性を
発現する高次構造をとる。この高活性な状態を作り出す
のに必要な水不溶性の物質として比較的炭素数の大きな
アルコール、エーテル、カルボニル化合物、ハロゲン化
アルキルの様に分子内に疎水基と官能基を併せ持つ物質
が非常に良好であり、かっただ単にパラフィン類のよう
な非極性の界面を作る物質ではその効果がほとんどない
ことがわかった。

第二にリパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のこ
とながら水と油脂の界面で働くため、水溶液で使用した
場合には、界面と水溶液中に酵素の分散する平衡が存在
すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用でき
ない。しかし固定化により不溶性担体表面上に並べるこ
とができれば、用いた酵素を効率良く利用する事が可能
となる。

第三に前記油溶性化合物を予め不溶性担体上に吸着させ
ておくことにより、酵素を含む培養液など他の夾雑蛋白
質や他の物質の中から酵素を短時間かつ選択的に高収率
で固定化できる点である。

すでに本発明者らはこれらの知見を応用して、少量の水
と油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界
面に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成
し特許出願した（特開昭６０−２５１８８４号公報）。

今回本発明者らは、さらにこれらの事実を解明し、各種
の不溶性担体に前記油溶性化合物を予め吸着させること
に応用し、該担体と酵素を接触固定化する際に、酵素を
活性化すると同時に短時間でかつ高濃度に該担体上に固
定化が可能となり、高活性な固定化酵素を製造できると
いう本発明の完成に至ったものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の方法においては、脂質分解酵素にアルコール類
、エーテル類、カルボニル化合物？＝Ｑ、ハロゲン化ア
ルキル類から選ばれた１種もしくは２種以上の油溶性化
合物を水溶液中で接触させて、活性化し、次いで該溶液
に不溶性担体を加えて接触させるか、或いは予め該油溶
性化合物を吸着させた不溶性担体に酵素液を接触させる
ことにより該担体上に酵素を吸着固定化する。

次いで該溶液より不溶性担体を濾過し水または緩衝液に
より洗浄する。こうして得られた固定化酵素を必要に応
じて乾燥させ本発明の固定化酵素を得る。

本発明に用いる脂質分解酵素としては、リパーゼ、ホス
ホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、および各種
のエステラーゼが挙げられる。これらのうちリパーゼと
しては、位置選択性に優れたリゾプス（Ｒｈ　１ｚｏｐ
ｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
属、ムコール（Ｍｕｃｏｕｒ）属、脂肪酸特異性を有す
るジオトリケム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、特異性を
示さないキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シュード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クロモバクテリウム（Ｃ
ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等の微生物起源のリ
パーゼ及び膵臓リパーゼ等の動物リパーゼが挙げられる
。これらのうち、特に合成活性の増加し易いリパーゼと
しては中鎖以上のアルキル基に活性位の強いリゾプス属
、ムコール属、クロぞバクテリウム属起源のリパーゼが
一層好ましい。

コレステロールエステラーゼの例としては、キャンディ
ダ（Ｃａｎｄ　１ｄａ）属等の微生物起源のものが挙げ
られる。また、ホスホリパーゼの例としては、キャベツ
、ビーナツツ、ニンジン等の植物由来のもの、およびス
トレプトマイセス属等の微生物起源のものが挙げられる
。

本発明に用いられる不溶性の担体としては、水およびア
ルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何
れでも良く、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、モ
レキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシ
ウム、セラミックス等の無機担体、およびセルロースパ
ウダー、ポリビニルアルコール、キトサン、イオン交換
樹脂、吸着樹脂等の有機高分子の様なリパーゼ活性に影
響を与えず、操作上から物理的・化学的に安定なもので
あれば何れも使用できる。特に、不溶性担体内に疎水性
の部分を持つもの、例えば樹脂中の−ＣＨ２一部分の多
いもの、官能基にアルキル基の入ったものが、脂質分解
酵素の吸着性や基質としての脂質との相性からも好まし
い。また担体の形状としては、粉末状、顆粒状、繊維状
、スポンジ状等種々あるが、そのいずれでも使用できる
。特に工程操作上の面からは４００〜１０００声〇粒径
を有し、細孔径１００〜１５００人の多孔性の担体を用
いるものが好適である。特にこの種の固定化担体として
、マクロ多孔性の吸着樹脂および弱アニオン交換樹脂が
挙げられる。

′　本発明に用いる油溶性化合物とは、室温でエタノー
ル、アセトン、エーテル、クロロホルム、ｎ−ヘキサン
等の有機溶剤のいずれかに可溶で水に不溶もしくは難溶
の物質をいい、疎水基部分として通常合計炭素数４〜３
６、好ましくは８〜２４の炭化水素基を有する物質をい
う。

本発明で用いる油溶性のアルコールとしては特に規定は
ないが、炭素数４〜３６、好ましくは８〜２４の直鎖も
しくは分岐の脂肪族１価アルコール、例としてはオクチ
ルアルコール、ラウリルアルコール等の飽和アルコール
、オレイルアルコール等の不飽和アルコール、もしくは
５−デカノール、イソステアリルアルコール等の分岐状
のものでもよい。さらにヘキサメチレングリコール等の
２価アルコールや多価アルコールも有効である。

このほかに、アルキル置換フェノール等のフェノール化
合物や、コレステロール、スチグマステロール、ブラシ
カステロール、カンペステロール等のステロール類が挙
げられる。又、フィトール、ゲラニオール、ファルネソ
ール、リナロール等のテルペンアルコール類、レチノー
ル、トコフェロール等の脂溶性ビタミン類も有　効であ
る。

エーテルの例としては、ジオクチルエーテル等の長鎖の
エーテル類、チミルアルコール、ハチルアルコール等の
グリセリルエーテル類、またはグリシジルエーテル等の
グリセリド類似化合物、トリエチレングリコールモノメ
チルエーテル、ポリエチレングリコールモノメチルエー
テル等のポリオキシ化合物、前記アルコールのトリメチ
ルシリルエーテル誘導体、ポリメチルシロキサン等のシ
リコン化合物もよい。

カルボニル化合物の例としては、２，４−デカジェナー
ル、デカナール、ヘキサデカナール等の脂肪族アルデヒ
ド類、レチナール等のテルペン系アルデヒド類、２−オ
クタノン、２−デカノン、オクチルデシルケトン等の脂
肪族ケトン類等が挙げられる。

ハロゲン化アルキルの例としては、オレイルクロライド
、オクチルクロライド、オクチルブロマイドのような長
鎖アルキルハライド等が挙げられる。

上記の油溶性の化合物はいずれも常温で液状であること
が工程操作上好ましいがこれに限定されるものではない
。またこれらは単体で用いてもよいが、適当な組み合せ
により一層の効果が発揮される場合もある。

前記油溶性化合物と脂質分解酵素との接触方法としては
、水溶液中にこれらの物質をそのまま加えても良いが、
分散性を良くするため溶剤に油溶性化合物を一旦分散・
溶解させた後に酵素を加えることもよい。適当な溶剤と
してはクロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル
等があげられる。油溶性化合物と酵素の比率は、酵素１
重量部（乾燥型Ｎ）に対し油溶性化合物０．００１−１
、好ましくは０．０１〜０．５重量部が適当であるが、
これに限定されるものではない。

適当な接触温度としては０〜１００°Ｃ１好ましくは５
〜６０°Ｃがよい。適当な処理時間としては５分〜５時
間程度で良い。次いでこれらの接触処理をした後の酵素
液に必要に応じて各種不溶性担体を加えて固定化を行な
う。

本発明の他の方法としては、前記油溶性化合物を各種不
溶性担体に予め吸着させておくことが出来る。吸着方法
としては不溶性担体を水溶液中に分散させ、該水溶液中
に前記油溶性化合物をそのまま加えても良いが、分散性
を良くするため溶剤に一旦分散・溶解させた後に加える
こともよい。適当な溶剤としてはクロロホルム、ｎ−ヘ
キサン、ジエチルエーテル等があげられる。これらの油
溶性化合物と不溶性担体の比率は、担体１重量部（乾燥
重量）に対し油溶性化合物０．００１〜１、好ましくは
０．０１〜０．５重量部が適当であるが、これに限定さ
れるものではない。以上の処理をした担体は必要に応じ
て一旦該溶液より濾過した後乾燥する。こうして処理し
た不溶性担体を、酵素の水性溶液あるいは酵素を含む発
酵液と接触させることにより固定化を行なう。

本発明において、酵素と担体を接触させる時間としては
５分〜２０時間、このましくは３０分〜２時間が適当で
ある。接触処理した移譲溶液より濾別し必要に応じて乾
燥する。適当な乾燥温度としては室温〜８０゛Ｃが良く
、減圧下での乾燥が乾燥速度の点から好ましいが、これ
に限定されるものではない。

本発明において固定化を行う温度としては、酵素の失活
の起きない温度であればよく、０〜６０°Ｃ１好ましく
は２０〜４０°Ｃがよい。また酵素溶液のｐＨは酵素の
変性が起きないような範囲であればよく、ｐＨ３〜９で
あればよい。特に至適ｐｌ（が酸性とされている酵素を
用いる場合に最大の活性を得るには、ｐＨ４〜６とする
ことがよい。

また酵素溶液に用いる緩衝液の種類は特に規定しないが
、−船釣な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液等を用いることができる。

本発明における固定化方法において、水溶液中の酵素濃
度は特に限定されないが、固定化効率の点から前記酵素
の溶解度以下でかつ充分な濃度であることが望ましい。

また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去し、上澄
を使用しても良い。また酵素と固定化担体の使用割合は
固定化担体１重量部に対して、酵素０．０１〜１０、好
ましくは０．０５〜５重量部が適当であるが、特にこれ
に限定されるものではない。

本発明において、固定化前の坦体に、多官能性試薬を用
いて架橋することにより、固定化酵素の繰り返し使用に
おける耐久性向上をはかることができる。多官能性の架
橋試薬としては、グリオキザール、グルタルアルデヒド
、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒドなどのポリ
アルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジチオイソシ
アネート、Ｎ、　Ｎ’−エチレンビスマレイミドなども
使用可能である。また、カルボジイミド類も使用できる
。

本発明における固定化酵素を用いたエステル合成反応の
例として、通常のメタノール、エタノール、プロパツー
ル、オレイルアルコール等の１価アルコール、ないしは
プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトールおよ
びポリグリセリン等の多価アルコール、またはゲラニオ
ール、シトロネロール、メントール等のチルヘンアルコ
ール、あるいはコレステロール等のステロールと、炭素
数２〜２４の脂肪酸とのエステル化反応が挙げられる。

エステル合成反応は２０〜９０°Ｃ１より好ましくは３
０〜８０°Ｃで無溶剤、もしくは炭化水素、エーテル等
の不活性溶剤中で行う。またアルコールと脂肪酸の量は
これらの価数、目的物に応じ適宜調整する。例えばジグ
リセリドの合成を目的とする場合はグリセリン１モルに
対し、脂肪酸約２モル、モノグリセリドの合成を目的と
するときはグリセリン１モルに対し、脂肪酸約１モルを
反応させる。

またエステル交換反応の例としては、エステルと脂肪酸
によるアシドリシス反応、エステルとアルコールによる
アルコリシス反応、エステル同士によるインターエステ
ル化反応、リン脂質と各種アルコールとのトランスホス
ファチシレーシコン等の反応が挙げられる。

本発明のエステル交換反応に用いる油脂としては大豆油
、オリーブ油、パーム油等の植物油脂、牛脂、豚脂、魚
油等の動物油脂が挙げられる。これらの油脂は単独で用
いてもよいが２種以上の油脂を用いるか（インターエス
テル化反応）、油脂と高級脂肪酸（アシドリシス反応）
あるいは油脂と高級脂肪酸の低級アルコールエステル間
（インターエステル化反応）でエステル交換することが
好ましい。特定の油脂と他の油脂、脂肪酸もしくはその
誘導体間でエステル交換する場合、両者の量比は特定の
油脂１重量部に対し他の物質は０．０５〜２０重量部、
好ましくは０．１〜１０重量部でないと油脂の改良効果
は得られにくい。特に好ましいのは、パーム油等の２位
にオレイン酸残基を多く有する油脂とステアリン酸との
エステル交換である。この反応においてはステアリン酸
の融点が高く、油脂の粘度が高いため、カラム反応で連
続エステル交換反応を無溶剤で行うためには、反応系の
温度を６０〜９０°Ｃに保つ必要がある。本発明の固定
化酵素はこの目的に好適であり、また得られる油脂はチ
ョコレート用として有用なものである。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、リバー°ゼ等の脂質分解酵素の持つ合
成活性を十分に発揮させる為のものであり、油溶性のア
ルコール、エーテル、カルボニル化合物、ハロゲン化ア
ルキルから選ばれた１種もしくは２種以上を酵素と接触
結合させるか、或いは不溶性担体上に予め吸着させてお
くことにより、酵素の活性化と選択的吸着固定化が同時
に可能となり、分解活性のみならずエステル交換活性、
合成活性の増大が起こる事を発見した結果から得たもの
である。

本発明の効果として、特に位置選択性リパーゼを本発明
の方法で固定化して得た固定化リパーゼは著しい活性を
有し、グリセリドの２位にオレイン酸を多く含有する油
脂と、飽和の脂肪酸とのアシドリシス反応により、天然
のカカオ脂に類似した構造を有する対称型の油脂の製造
を目的とした場合に、ジグリセリドの副生および非対称
型への転移とそれに伴う三飽和グリセリドの副生の低減
が可能となる。

またエステル類の合成においては、従来の酵素法では反
応の進行に伴って生成する水分により反応が平衡に到達
するため、エステル化が進行しな（なる。そこで反応系
を減圧にする等の脱水操作によってエステル化をさらに
進めようとするが、こうした操作により酵素のエステル
合成活性の低下は避けられない。こうした場合に本発明
の方法による固定化酵素を用いると、低水分条件下にお
いても十分なエステル合成活性を保持しているため、短
時間の間に高いエステル化率が達成され、反応の長時間
化による着色および異臭の生成等、品質の低下が見られ
ないという利点を有する。

以上のように本発明により、脂質分解酵素を界面での活
性型にした状態で固定化することによりエステル合成お
よびエステル交換活性が増大することを発見し、工業的
実施にあたって簡便かつ廉価に固定化酵素を製造するこ
とができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ 市販のリパーゼ〔リゾプス・ジャポニカス（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ−ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）起源のリパーゼ製剤、商
品名：リパーゼ・Ａ１０、大阪細菌研究所株式％式％ の酢酸緩衝液１００　ｍ／に？岩屑した。

該溶液にオクチルアルコール（試薬、東京化成製）２ｇ
を加え、２０°Ｃで３０分間接触させた。

次いで福本等の方法（Ｊ、Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、。

９８．３５３（１９６３）　’）に従い、オリーブ油乳
化液５−と０．１Ｍ燐酸緩衝液４ｍ７に、所定量のリパ
ーゼ溶　　液を加え、３７°Ｃにて３０分間反応したと
きに生成する脂肪酸の量をオレイン酸として１μｍｏｌ
／ｍｉｎに相当するものを１ｕｎｉｔとしてリパーゼ活
性を測定した所、オクチルアルコールを添加処理しない
場合に比べて１．５倍の活性上昇が見られた。

このオクチルアルコールとリパーゼの混合溶液１００Ｌ
Ｉ＋７に、市販の弱アニオン交換樹脂〔フェノールホル
ムアルデヒド系樹脂、商品名：デュオライト（Ｄｕｏｌ
ｉｔｅ）Ａ　　５６Ｂ　、ダイヤモンドジャムロック社
製）１０ｇを加え３０分撹拌する事によりオレイルアル
コールの結合したリパーゼを該担体上に吸着させた。次
ぎに該樹脂を溶液から濾別した後イオン交換水にて洗浄
した。このとき濾液のリパーゼ活性から、９２％のリパ
ーゼが固定化されていた。こうして得られた樹脂を水分
５％となる様に常温にて減圧乾燥して固定化酵素を得た
。

実施例２ 市販の弱アニオン交換樹脂〔フェノールホルムアルデヒ
ド系樹脂、商品名：デュオライト（Ｄｕｏｌｉｔｅ）　
Ａ−５６８、ダイヤモンドシャムロツタ社製〕１０ｇを
１００　ｍＺのイオン交換水に加え、次いでオクチルア
ルコール（試薬、東京化成製）２ｇを加え３０°Ｃで３
０分撹拌した。次ぎに該樹脂を溶液から濾別した後イオ
ン交換水にて洗浄した。

実施例１で用いた市販のリパーゼ１０ｇをｐｕｓ、。

の１０ｍＭの酢酸緩衝液１００　ｍＺに溶解した。この
溶液に先に調整した樹脂を全量加え２時間撹拌した。次
に該懸濁液より樹脂を濾別し、水で洗浄した。このとき
濾液中のリパーゼ活性より求めた活性収率は９６％とな
り、加えたリパーゼのほとんどが吸着固定化されている
事が分かった。

次いで水分５％となるように常温にて減圧乾燥を行い固
定化リパーゼを得た。

比較例１ 実施例２で用いた市販の樹脂をそのまま無処理で用いた
以外は実施例２と同様な方法を行い固定化リパーゼを得
た。

実施例３ 実施例２でオクチルアルコールに代えてオレ。

イルアルコールを用いた以外は全（同様の操作を行い固
定化リパーゼを得た。

実施例４ 実施例１ないし３及び比較例１で得られた固定化リパー
ゼ各々１ｇを、オレイルアルコール（試薬、東京化成製
）　９．８ｇ及びオレイン酸（試薬、東京化成製）１０
．２ｇと混合し、６５°Ｃにて撹拌しながらエステル化
反応を行なった。反応開始１０分後に反応液の一部を試
料として取り出し、基準油脂分析試験法に従って試料の
酸価を測定した。試料の酸価より次式によりエステル化
速度を求めた。

ここで’＋ｖ　ｒ　ｉｏ骨分後試料の酸価聞：試料の重
量（ｇ） ＥＷ：酵素の重量（ｇ） 一部あられす。

これらの結果は第１表に示した。

第１表 実施例５ この例では実施例２において、オクチルアルコールにか
えて、オレイルクロライド（試薬、東京化成製）を用い
た以外は全く同様の操作を行って固定化酵素を得た。

実施例６ 実施例１〜３．５及び比較例１で得られた固定化リパー
ゼをそれぞれ１ｇ用いて、パーム油中融点部（沃素価３
２．５、ジグリセリド含Ｎ４．６％）１０ｇと市販のス
テアリン酸〔商品名ルナツク５−９０．ステアリン酸純
度９３％、花王株式会社製〕１０ｇを加え７０°Ｃで５
時間反応を行った。

反応後カラムクロマトグラフィー（固定相フロリジル、
フロリジン社製、展開溶剤：ヘキサン／エチルエーテル
＝２／３）によりグリセリド画分を分離し、グリセリド
中に含まれるステアリン酸含量をガスクロマトグラフィ
ーにより分析し、次式で示される平衡値を１００％とし
た反応率を算出した。

Ｓｃｏ　−ＳＯ 上の式において、 Ｓｔ：を時間後の油脂中のステアリ　°、含量Ｓｏ：原
料油脂中のステアリン酸含′ ５（Ｘ）　：　１．３ランダム平衡時のスー°　リン酸
含量を意味する。

結果は第２表にまとめて示した。いずれの実施例の場合
も５時間でほぼ反応が平衡に到達し、副生物の生成も比
較例に比べ少なかった。

第２表 実施例７ 実施例１で用いた市販のリパーゼ１０ｇをｐＨ５の５０
ｍＦＩ酢酸緩衝液１００ｍ１に溶解させた。該溶液に油
ン容性のテＪレペンアルコールとして、ファルネソール
（試薬：和光純薬工業株式会社製）、ゲラニオール（高
砂香料株式会社製）、フィトール（試薬：東京化成株式
会社製）を各々２ｇ加え、２０°Ｃにて３０分間撹拌し
た。次いで実施例■で用いた市販の弱アニオン交換樹脂
１０ｇを前記酵素・油）容性化合物混合溶液中に加え、
２時間撹拌した。次ぎに該溶液より樹脂を直別し、イオ
ン交換水で洗浄した。次いで水分５％となるように常温
にて減圧乾燥を行い固定化リパーゼを得た。

このときの酵素吸着率は第３表に示したが、何れも高収
率で固定化されている事が確かめられた。

こうして得られた固定化酵素を用いて、実施例４及び実
施例６と同様に各々エステル合成反応、エステル交換反
応を行なった結果、何れも高い活性を示した。

各々の結果は第４表及び第５表に示した。

第３表 第４表 第５表 実施例８ 実施例２で用いたオクチルアルコールに代えて、オレイ
ルアルコールのトリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテルを
用いた以外は全く同様の操作を行い固定化リパーゼを得
た。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて実施例６と同様
にエステル交換反応を行なった。結果は第６表に示した
。

第６表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類、
   ハロゲン化アルキル類から選ばれた１種もしくは２種以
   上の油溶性化合物の存在下で不溶性担体に固定化された
   脂質分解酵素。 ２、油溶性化合物の疎水基部分が合計炭素数４〜３６の
   炭化水素基である特許請求の範囲第１項記載の脂質分解
   酵素。 ３、油溶性化合物が不溶性担体上もしくは不溶性担体内
   に予め存在するものである特許請求の範囲第１項又は第
   ２項記載の脂質分解酵素。 ４、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類、
   ハロゲン化アルキル類から選ばれた１種もしくは２種以
   上の油溶性化合物の存在下で不溶性担体に固定化された
   脂質分解酵素を用いることを特徴とするエステル合成反
   応方法。 ５、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類、
   ハロゲン化アルキル類から選ばれた１種もしくは２種以
   上の油溶性化合物の存在下で不溶性担体に固定化された
   脂質分解酵素を用いることを特徴とするエステル交換反
   応方法。