JPS63214184A - 固定化酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、固定化酵素およびその製造方法に関するもの
である。更に詳しくは、リパーゼによるエステル交換及
びエステル合成反応に適した固定化リパーゼと、その製
造方法に関するものである。

油脂類のエステル交換反応は、マーガリン・ショートニ
ング等の食用加工油脂の改質等に水素添加と並ぶ重要な
技術である。

エステル類の合成反応は、アルコールと脂肪酸からアル
コール脂肪酸エステルの合成、モノグリセリド、ポリグ
リセン脂肪酸エステル、糖エステルといった多価アルコ
ール脂肪酸エステルの合成、ゲラニルブチレイトといっ
た香料の製造方法として重要な技術である。

〔従来の技術及びその問題点〕

油脂類およびエステル類のエステル交換およびエステル
合成反応はリパーゼが穏和な条件下で反応する事、位置
選択性、アルキル選択性等の特徴を持つ事を利用してい
る。しかし、これらの反応はリパーゼ本来の加水分解反
応と異なり、水分の限定された系でのみ進みうる反応で
ある。

一方、リパーゼのエステル交換およびエステル合成活性
を増大せしめるためには、酵素としである程度の水分を
特徴とする特開昭５５−７１７９７号公報に開示された
低水分系のエステル交換反応では、充分な反応速度が得
られず、また反応速度を増大させるために必要以上の水
分を与えると、エステルの分解反応が優先的に進行する
という問題点がある。また特開昭６０−１９４９５号公
報及び特開昭６０−２０３１９６号公報に開示されたエ
ステル交換反応を多水分系の分解工程と、水分を除去す
る合成工程の二段階に分けて行う方法の提案もあるが後
者の合成反応速度は通常のエステル交換速度に比して充
分であるとは言えず、工程操作の複雑化も避けられない
。

リパーゼによるグリセリドおよびエステル類の合成反応
については、岩井、辻坂らの研究（Ｍ。

ｒｗａｉ＋　Ｙ、Ｔｓｕｊｉｓａｋａ、　Ｊ、Ｆｕｋｕ
ｓｏｔｏ＋　Ｊ、Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ＋Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
１．、１０．１３（１９６４））および日本特許第８３
１８３４号、第１０５６７３８号等により知られている
が、加水分解作用と合成作用の平衡関係は反応系内の水
分により支配され、水の存在下では大きく分解に偏り合
成率はおのずと小さくなる。

この点を解決する手段として、特開昭５７−８７８７号
公報に開示された反応を可及的に乾燥した系で行い、か
つ反応により生成する水分を系外に排出させるという方
法の提案もあるが、低水分下では酵素の合成活性は極め
て小さく、合成率の低下および反応の長時間化は避けら
れない。

以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。

リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来、リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に
均一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼ
を不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分
散可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるた
め、低水分下でのエステル交換および合成反応が容易と
なる。また触媒としてなお高価格であるリパーゼの回収
再使用が容易となり、エステル交換またはエステル合成
反応の工業的実施においても反応装置の連続化等が容易
となる点等である。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。

例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏ
ｉｌ　Ｃｈｅ＋＋＋ｉｓｔ’５Ｓｏｃ−＋第６０巻２９
１−２９４　（１９８３）にも微量な水分を与えた場合
、加水分解反応が進行することが指摘されている。

また、水に代えてグリセリンのような多価アルコールを
添加した場合では加水分解反応はある程度抑制されるが
、エステル交換およびエステル合成反応は遅くなる。ま
た特開昭５９−２１３３９０号公報に開示された、酵素
水分の保持を狙い、多孔質担体、高吸水性樹脂をキトサ
ンで包括固定化後、粉砕した担体を用いる方法によって
もエステル化反応ではなお２０時間以上を要し、合成速
度は十分であるとは言えない。

以上のようにリパーゼによる油脂類のエステル交換およ
びエステル合成反応は、前述の化学的な方法に比べ特徴
的かつ有利な点を持つ反面、未だ解決しなければならな
い多くの問題点があり、工業的に実施するにはこれらの
問題点を解決する必要がある。

上記のようにエステル交換反応およびエステル合成反応
においては、固定化酵素の水分を確実にコントロールす
るか、またはよりエステル交換およびエステル合成活性
の高い固定化酵素の開発が望まれる。

エステル交換反応についてみると、水分コントロールに
ついては先に述べた二段階反応（特開昭６０−２０３１
９６号公報）においても行われているが、装置的に煩雑
であること、また第１段の分解工程において１．２−ジ
グリセリドを選択的、高収率で得ることと、更に第２段
で１．２−ジグリセリドから１．３−ジグリセリドへ転
移させることなく、選択的に目的のトリグリセリドを合
成することは難しい、特に温度が高くなるほどこの転移
の悪影響を抑える事は難しくなる。

またエステル合成反応についてみると、従来の方法では
ほとんどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、
分解と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、
目的とするエステルの収量は低いものにとどまっている
。しかし固定化酵素によって反応を行えば、より低水分
条件下においてもエステル合成が行われ、酵素の回収も
容易であるが、この場合においても通常の化学的方法と
同等の反応速度を得るためには、より高活性な固定化酵
素の開発が望まれる。

以上のような問題点を解決するため、固定化リパーゼの
エステル合成活性及びエステル交換活性を増加させる方
法が種々検討されてきた。

しかし現在迄に、特開昭６０−２５１８８号公報に開示
されたリパーゼに油脂を加え加水分解反応をさせながら
固定化を行う方法以外に何も見つかっていない。

一方、固定化リパーゼを加水分解に用いた系でも、安定
化効果も含めて僅かにＣａ塩の添加が知られているにす
ぎなし）（Ｊ、Ａ＋ｗ、ＯｉＩ　Ｃｈｅｍｉｓｔ’５Ｓ
ｏｃ、、　６１．７７６−７８Ｈ１９８４））。また、
酵素水溶液の状態では、加水分解反応系として、Ｃａ塩
、胆汁酸、各種界面活性剤などを添加すると活性化作用
があることが知られているが、エステル交換およびエス
テル合成反応の系については、はとんど知られていない
のが実状である。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らはリパーゼのエステル交換活性およ
びエステル合成活性を増大させる因子について鋭意研究
を重ねた結果、リパーゼにリン脂質が接触・結合した状
態で、著しいエステル交換およびエステル合成活性の増
大が見られる事を発見した。更に本発明者らはこの事実
をもとに、リン脂質を結合させたリパーゼを種々の不溶
性担体上に固定化する事に応用する事により本発明の完
成に至った。

従来、リパーゼとリン脂質との関係については、岩井ら
により１９６９年の日本生化学会において報告がなされ
て以来、多くの報告がなされたが、いずれも加水分解反
応での基質特異性の変化についてか、または発酵生産の
安定化方法についてのみであり、エステル交換およびエ
ステル合成反応での活性化についての報告は見られない
。

また門田則昭らにより１９８６年４月の日本農芸化学会
で報告された、リン脂質によるミセル内へ酵素を取り込
み反応させる方法がある。さらにこの方法の応用として
のリパーゼを−７０（旧よ水相、０は油相を意味する。

）エマルジョン内へ取り込み、その後このエマルジョン
をＷ１０／Ｗのエマルジツンとして固定化し、多価アル
コール脂肪酸エステルの製造を行ったという報告がある
。この方法は一旦一７０エマルジョンを作り、しかもそ
のエマルジ四ン内に酵素を取り込ませ、次いでそのエマ
ルシヨンを油相中で壊れないように−１０／Ｈにする。

しかも、そのエマルジョン固定化酵素が物理的に不安定
なため、光架橋性樹脂で取り囲むという非常に煩雑な工
程を必要とする。

これに対し本発明は、リパーゼにリン脂質を水相中で接
触・結合させた状態でこれを不溶性担体と結合させるだ
けでより、Ｗ１０エマルジョンといった油相中に分散さ
せる必要もない。具体的にはリン脂質とリパーゼを含有
する溶液中に不溶性担体を添加し、該担体上にリパーゼ
とリン脂質を固定化した後にろ過するだけで良い。

即ち、本発明は、リパーゼとリン脂質を接触・結合させ
た状態で不溶性担体に固定化してなる、エステル交換及
・びエステル合成に適した固定化酵素に関するものであ
る。

また、本発明は、リパーゼを不溶性担体に固定化する前
または固定化時にリン脂質を添加する事によりリパーゼ
のエステル交換活性およびエステル合成活性を増大させ
て固定化することを特徴とする固定化酵素の製造方法に
関するものである。

本発明は具体的には次のようである。即ち、リパーゼ溶
液もしくはリパーゼを含む発酵培養液に不溶性担体を加
えリパーゼを固定化するにあたり、固定化する前にリパ
ーゼ溶液もしくはリパーゼを含む発酵培養液に対しリン
脂質又は、リン脂質を分散もしくは溶解させた溶液を添
加することにより、リパーゼとリン脂質を接触・結合せ
しめる。あるいはリン脂質を懸濁もしくは溶解させた水
又は緩衝液中に市販リパーゼを溶解してもよい。次に該
溶液中に不溶性担体を添加し１分〜２０時間、好ましく
は３０分〜２時間接触させ、次いで、該溶液より不溶性
担体をろ過し水により洗浄する。こうして得られた固定
化リパーゼを乾燥させ本発明の固定化リパーゼを得る。

さらに好ましくは、リパーゼ溶液もしくはリパーゼを含
む発酵培養液に、リン脂質と油脂類または脂肪酸類を溶
解したアルコール溶液（好ましくは炭素数８以下の脂肪
族１価アルコール）を添加し攪拌した後、そこへ不溶性
担体を添加し５分ないし２０時間、好ましくは３０分な
いし２時間接触させ、次いで該溶液より不溶性担体をろ
過し、水により洗浄する。こうして得られた固定化リパ
ーゼを乾燥させ本発明の固定化リパーゼを得る。

本発明に用いる固定化リパーゼ用のリパーゼとしては、
位置選択性に優れたリゾプス（Ｒｈｉｚｏ−ｐｕｓ）属
、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、クロ
モバクテリウム（Ｃｈｒｏｗｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｉｅ）属、脂肪酸特異性を有するジオトリケム（
Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、特異性を示さないキャンデ
ィダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の微生物起源のリパーゼ及
びすい臓リパーゼ等の動物リパーゼが挙げられる。これ
らのうち、特に合成活性の高い微生物起源のリパーゼと
して、キャンプ、イダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ　ｃｙｌｉｎ−ｄｒａｃｅａ）　、リゾプス・ジャポ
ニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ムコ
ール・ミーハイ（Ｍｕｃｏｒ　ｎ＋１ｅｈｅ−１）、ク
ロモバクテリウム・ビスカス（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃ−ｔ
ｅｒｉｕｍ　ｖｉｓｃｏｓｕｍ）起源のリパーゼが一層
好ましい。

固定化に用いる担体としては、水、アルコール、各種有
機溶剤、油脂類のいずれにも不溶性の担体なら良く、セ
ライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、パー
ライト、モレキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性炭、
炭酸カルシウム等の無機担体、及びセルロースパウダー
、ポリビニルアルコール、キトサン、イオン交換樹脂、
吸着樹脂等の有機高分子の様な、リパーゼ活性に影響を
与えず、操作上から物理的・化学的に安定なものであれ
ば何れも使用できる。

また担体の形状としては、粉末状、果粒状、繊維状、ス
ポンジ状等、種々あるが、そのいずれでも使用できる。

特に工程操作上の面からは４００〜１０００Ｉ！ｍの粒
径を有し、細孔径１００〜１５００人の多孔性の担体を
用いることが良い。特にこの種の固定化担体としては、
マクロ多孔性フェノールホルムアルデヒド系の吸着樹脂
及びイオン交換樹脂があげられる。

本発明で用いるリン脂質としては、天然に産出する大豆
レシチン、卵黄レシチン等の粗製及び又は精製混合レシ
チン等を用いてもよく、またこれらを分画して得たホス
ファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルグリセロール、カルシオリピン、ホスフ
ァチジン酸等を単独又は混合して用いても良い。また各
種合成法により得た合成リン脂質及びこれらの誘導体も
用いることができる。

操作上低融点のリン脂質としてアルキル基が短鎖または
不飽和であるものが扱い易いがこれに限定されるもので
はない。

リン脂質とリパーゼの接触方法としては、リパーゼ水溶
液に前記リン脂質をそのまま加えても良いが、リン脂質
の水中への分散性を良くするためリパーゼの活性に影響
を与えない溶剤にリン脂質を一旦分散もしくは溶解させ
た後に加えることが一層効果的である。溶剤としては脂
肪族１価アルコール、クロロホルム、ｎ−へキサン等が
あげられるが、水との相溶性の点から炭素数８以下の脂
肪族１価アルコールが好適である。

またリパーゼとリン脂質を接触させるにあたり、基質と
しての脂肪酸、油脂類等を共存させることにより更に高
活性の固定化酵素を得ることができる。脂肪酸の種類と
しては炭素数２〜２４の直鎖で通常自然界に存在するも
の、例としてはバルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂
肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸等の不飽和の脂
肪酸を用いることができる。また油脂類としては、一般
的な植物性油脂、動物性油脂もしくは加工油脂、あるい
はこれらの混合油脂があげられる。またこれらの油脂及
び／又は脂肪酸とグリセリンより誘導して得たジグリセ
リド、モノグリセリドを用いても同等の効果が得られる
。

本発明において固定化を行う温度としては、リパーゼの
活性を損なわない温度であればよ（，０〜６０℃好まし
くは２０〜４０℃がよい、またリパーゼ溶液のｐＨはリ
パーゼの変性が起きないような範囲であればよ＜、ｐＨ
３〜９の範囲が好ましい。特に至適ｐＨが酸性とされて
いるリパーゼを用いる場合に最大の活性を得るには、ｐ
Ｈ４〜６とすることがよい。またリパーゼ溶液に用いる
緩衝液の種類は特に規定しないが、−ａ的な酢酸緩衝液
、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いることがで
きる。

本発明における固定化方法において、水溶液中のリパー
ゼ濃度は特に規定しないが、固定化効率の点から前記リ
パーゼの溶解度以下でかつ充分な濃度であることが望ま
しい、また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去し
、上澄を使用しても良い。また、リパーゼとリン脂質と
はリパーゼ１重量部に対しリン脂質０．０１〜１重量部
の割合で接触・結合させるのが好ましい。

更に、リパーゼと固定化担体の使用割合（重量比）とし
ては、固定化担体１重量部に対しリパーゼ０．０１〜１
重量部が好ましいが、特にこれに限定されるものではな
い。

本発明において、固定化前の担体及び／又は固定化終了
後、酵素溶液を分離して得たリパーゼの結合した担体に
、多官能性架橋剤を用いて架橋することにより、固定化
酵素の繰り返し使用における耐久性向上をはかることが
できる。

多官能性の架橋剤としては、グリオキザール、グルタル
アルデヒド、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒド
などのポリアルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジ
チオイソシアネート、Ｎ、　Ｎ’−エチレンビスマレイ
ミドなども使用可能である。また多官能性架橋剤による
架橋は前記の固定化操作中に同時に行ってもよい。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、リパーゼの持つ合成活性を十分に発揮
させる為のものであり、リパーゼのエステル交換活性お
よびエステル合成活性が、リン脂質との結合により著し
く増大することを見いだし、これを固定化に応用した結
果得られたものである。

本発明における固定化リパーゼを用いるエステル交換反
応の例としては、エステルと脂肪酸によるアシドリシス
反応、エステルとアルコールによるアルコリシス反応、
エステル同志によるインターエステル化反応がある。ま
たエステル合成反応の例としては、通常のメタノール、
エタノール、プロパツール等の１価アルコール、又はプ
ロピレングリコール、グリセリン、ソルビトールおよび
ポリグリセリン等の多価のアルコール、又はゲラニオー
ル、シトロネロール、メントール等のテルペンアルコー
ルと炭素数２〜２４の脂肪酸とのエステル化反応があげ
られる。

本発明の効果として、特に位置選択性リパーゼを本発明
の方法で固定化して得た固定化リパーゼは著しい活性を
有し、グリセリドの２位にオレイン酸を多く含有する油
脂と、飽和の脂肪酸とのエステル交換反応により、天然
のカカオ脂に類似した構造を有する対称型の油脂の製造
を目的とした場合に、ジグリセリドの副生および非対称
型への転移とそれに伴う三飽和グリセリドの副生の低減
が可能となる。

またエステル類の合成においては、従来の酵素法では反
応の進行に伴って生成する水分により反応が平衡に到達
するため、エステル化が進行しなくなる。そこで反応系
を減圧にする等の脱水操作によってエステル化をさらに
進めようとするが、こうした操作により酵素のエステル
合成活性の低下は避けられなかった。こうした場合に本
発明の方法による固定化リパーゼを用いると、低水分条
件下においても十分なエステル合成活性を保持している
ため、短時間の間に高いエステル化率が達成され、反応
の長時間化による着色および異臭の生成等の副反応によ
る品質の低下が見られないという利点を有する。

以上のようにリン脂質とリパーゼの接触・結合によりそ
のエステル交換およびエステル合成活性が増大すること
を発見した事により、工業的実施にあたって簡便かつ廉
価に高活性の固定化リパーゼを製造することが可能とな
った。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ リゾプス・ジャボニカス起源の市販リパーゼ〔商品名〈
リパーゼ・サイケン１００〉大阪細菌研究所株式会社製
、分解活性３５．０００１Ｊｎｉｔ／ｇ）　１０ｇを、
ｐＨ５，０の１０−Ｍの酢酸緩衝液９５ｄに溶解した。

別に５ｄのイオン交換水に市販の大豆レシチン（試薬、
和光純薬工業株式会社製）Ｉｇを懸濁させた液を調製し
、先のリパーゼ溶液に添加し１時間攪拌してリパーゼと
レシチンの懸濁液を得た。このリパーゼとレシチンの懸
濁液に、フェノールホルムアルデヒド透射アニオン交換
樹脂〔商品名〈デエオライト（Ｄｕｏｌ　ｉ　ｔｅ）　
Ｂ５−５６８＞ダイアモンドシャムロフタ社製）１０ｇ
（水分１０％）を加え３０℃で２時間攪拌した。このと
き混合後の液のｐＨを５．０となるように調整した。次
に該懸濁液より弱アニオン交換樹脂をろ別し、水で洗浄
した後、水分５％となるように常温にて減圧乾燥を行い
１０．５　ｇの固定化リパーゼを得た。この時ろ液の分
解活性は１．２９５　Ｕｎｉｔ／ｍ７であった、この結
果から得られた固定化リパーゼには当初用いたリパーゼ
の６３％が固定化されていた。

本実施例で得られた固定化リパーゼを１ｇ用いて、パー
ム油中融点部（沃素価３２，５、ジグリセリド含量４．
６％）１０ｇと市販のステアリン酸〔商品名ルナツク５
−９０．ステアリン酸純度９３％。

花王株式会社製１１０ｇを加え６５℃で５時間反応を行
った。反応後、フロリジル（フロリジン社製：６０〜１
０抛ｅｓｈ　、溶離液ヘキサン：エーテル＝２　：　３
）カラムクロマドグフィーによりグリセリド画分を分離
し基準油脂分析試験法に従いメチルエステルとし、グリ
セリド中に含まれるステアリン酸含量をガスクロマトグ
ラフィーにより分析した。次式で示される平衡値を１０
０χとした反応率を算出した。

上の式において、 Ｓｔ：時間ｔにおける油脂中のステアリン酸含量 Ｓｏ：反応前の原料油脂中のステアリン酸含量Ｓｏｏ：
　１．３ランダム平衡時のステアリン酸含量を意味する
。

その結果は第１表に示した。

比較例１ 実施例１で用いた市販のリパーゼ１０ｇをｐＨ５，０の
１０ｄの酢酸緩衝液１００ｄに溶解し１時間攪拌してリ
パーゼ溶液を得た。このリパーゼ溶液に、デュオライト
Ｂ５−５６８を１０ｇ　（水分１０％）加え３０℃で２
時間攪拌した。このとき混合後の溶液のｐＨを５となる
ように調整した０次に該溶液より樹脂（デュオライトＥ
ｓ−５６８）をろ別し、水で洗浄した後、水分５％とな
るように常温にて減圧乾燥を行い１０．７ｇの固定化リ
パーゼを得た。この固定化リパーゼを用いて実施例１と
同様にエステル交換反応を行った。

その結果は第１表に示した。

第　　　１　　　表 第１表に示した結果から、リン脂質処理によるリパーゼ
のエステル交換活性の増大効果が認められる。

実施例２ 実施例１で用いた市販のリパーゼ１０ｇをｐＨ５，０の
１０−Ｍの酢酸緩衝液９５ｗｄに溶解し、１時間攪拌し
てリパーゼ溶液を調整した。別に５−のブタノールに大
豆レシチン１ｇを溶解させた溶液を調製し、これを先の
リパーゼ溶液に添加し１時間撹拌して混合物Ａ（リパー
ゼ、レシチン、ブタノールなどを含有）を得た。この混
合物Ａに実施例１で用いた弱アニオン交換樹脂（デュオ
ライトＢ５−５６８）　１０ｇ　（水分１０％）を混合
し３０℃で２時間攪拌した。このときのｐＨは５に調製
した。次に該混合物から樹脂をろ別し、水で洗浄した後
、水分５％となるように室温にて減圧乾燥を行い１１．
２　ｇの固定化リパーゼを得た。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例１と同
様に＜Ｓち、実施例１で用いたパーム油中融点部Ｌｏｇ
とステアリン酸Ｌｏｇを加え、６５℃で５時間）エステ
ル交換反応を行った。

その結果は第２表に示した。

比較例２ 実施例１で用いた市販のリパーゼ１０ｇをｐｕｓ、。

の１０ｄの酢酸緩衝液９５ｗＬ１に溶解した。このリパ
ーゼ溶液に５ｄのブタノールを添加し１時間攪拌して混
合物Ｂ（リパーゼ、ブタノールを含有、レシチンは含有
しない）を得た。この混合物Ｂに実施例１で用いた弱ア
ニオン交換樹脂（デュオライトｔ！Ｓ−５６８）　１０
ｇ　（水分１０％）を混合し３０℃で２時間攪拌した。

このときのｐＨは５．０に調製した０次に該混合物から
弱アニオン交換樹脂をろ別し、水で洗浄した後、水分５
％となるように室温にて減圧乾燥を行い１０．３　ｇの
固定化リパーゼを得た。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例１と同
様にエステル交換反応を行った。

その結果は第２表に示した。

実施例３ この例ではリン脂質の溶媒についての選択を行った。

即ち、実施例２において、ブタノールに代えてメタノー
ル、エタノール、プロパツール、ペンタノール、ヘキサ
ノール、ヘプタツール、オクタツールをそれぞれ用いた
以外は実施例２の方法と同一の操作を行った。

その結果は第２表に示した。

第２表に示す結果から、リン脂質の分散溶剤として炭素
数８以下のアルコールが有効である事が明らかとなった
。

第２表 実施例４ この例ではリン脂質の種類についての検索を行った。

即ち、実施例２において、市販の大豆レシチンにかえて
、リン脂質としてホスファチジルコリン、ホスファチジ
ルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルセリン（試薬、何れもシグマ社製）をそれ
ぞれ用いた以外は実施例２と全く同一の操作を行った。

ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様にエ
ステル交換反応を行った。結果は第３表に示したが、い
ずれのリン脂質でも十分な効果が認められた。

第３表 実施例５ 実施例１で用いた市販のリパーゼ１０ｇをｐＨ５，０の
１０−Ｈの酢酸緩衝液９５ｄに溶解した。別に５ｍｌの
ブタノールにホスファチジルコリン１ｇとオリーブ油（
局方オリーブ油、和光純薬工業株式会社製）Ｉｇを添加
し、攪拌して均一な混合物を調製し、これを先のリパー
ゼ溶液に添加し１時間攪拌し混合物Ｃ（リパーゼ、ホス
ファチジルコリン、オリーブ油、ブタノールなどを含有
）を得た。該混合物Ｃに実施例１で用いた弱アニオン交
換樹脂（デュオライトＥＳ−５６８）　１０ｇ　（水分
１０％）を混合し３０℃で２時間攪拌した。なお混合時
のｐ旧よ５．０に調整した０次に該混合物から弱アニオ
ン交換樹脂をろ別し、水で洗浄した後、水分５％となる
ように常温にて減圧乾燥を行って固定化リパーゼを得た
。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて実施例１と同様
にエステル交換反応を行った。

その結果は第４表に示した。

比較例３ 実施例１で用いた市販のリパーゼ１０ｇをｐＨ５，０の
１０−Ｍの酢酸緩衝液９５＠１に溶解した。別に５＠１
のブタノールに実施例５で用いたオリーブ油１ｇを添加
し、攪拌して均一な混合物を調製し、先のリパーゼ溶液
に添加し１時間攪拌しリパーゼ、オリーブ油、ブタノー
ルなどを含有する混合物りを得た。該混合物りに実施例
１で用いた弱アニオン交換樹脂（デュオライトＥＳ−５
６８）１０ｇ（水分１０％）を混合し３０℃で２時間攪
拌した。

なお混合時のｐＨは５．０に調整した。次にこの混合物
から弱アニオン交換樹脂をろ別し、水で洗浄した後、水
分５％となるように常温にて減圧乾燥を行って固定化リ
パーゼを得た。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて実施例１と同様
にエステル交換反応を行った。

その結果は第４表に示した。

実施例６ 実施例５において、オリーブ油にかえてオレイン酸ジグ
リセリド（試薬、シグマ社製）、オレイン酸モノグリセ
リド（商品名エキセル０−９５、花王株式会社製）、オ
レイン酸（商品名ルナツク０−ＬＬ、花王株式会社製）
をそれぞれ用いた以外は全〈実施例５と同一の操作を行
った。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて実施例１と同様
にエステル交換反応を行った。

その結果は第４表に示した。

実施例５、実施例６及び比較例３の結果、及び実施例４
のホスファチジルコリン単独の結果も第４表に一括表示
したが、之等の結果から、リン脂質とリパーゼの基質と
なる油脂類を共存させる事により効果の増大が認められ
た。

第　　　４　　　表 実施例７ 実施例５において、弱アニオン交換樹脂デュオライトＢ
５−５６８にかえて、デュオライトＢ５−５６２、フェ
ノールホルムアルデヒド吸着樹脂デュオライトＳ−８６
１、ダウエックスＭＷＡ−１０（ダウケミカル社製）、
無機担体としてセライト５４５（マリンビル社製）をそ
れぞれ用いた以外は実施例５と全く同様の操作を行った
。

ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様なエ
ステル交換反応を行った。

その結果は第５表に示したがイオン交換樹脂のみならず
無機担体でも同様な効果が認められた。

第　　　５　　　表 実施例８ 実施例２において、市販リパーゼとしてキャンディダ・
シリンドラッセ起源のリパーゼ〔商品名〈リパーゼＯＦ
＞名糖産業株式会社製、３６万Ｕｎｉｔ／ｇ）　０．９
７ｇを用いた以外は実施例２と全く同様の方法で行った
。

ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様にエ
ステル交換反応を行った。

その結果は第６表に示した。

実施例９ 実施例２において、市販リパーゼとしてリゾプス・デレ
マー起源のリパーゼ〔商品名くタリバーゼ〉田辺製薬■
製、６０００Ｕｎｉ　ｔ／ｇ）　５８　ｇを用いた以外
は実施例２と全く同様の方法で行った。

ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様にエ
ステル交換反応を行った。

その結果は第６表に示した。

実施例１０ 実施例２において、市販リパーゼとしてアスペルギルス
・ニガー起源のリパーゼ〔商品名〈リパーゼＡＰ６＞天
野製薬株式会社製、６万Ｕｎｉｔ／ｇ）　５．８ｇを用
いた以外は実施例２と全く同様の方法で行った。

ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様にエ
ステル交換反応を行った。

その結果は第６表に示した。

実施例１１ 実施例２において、市販リパーゼとしてムコール起源の
市販リパーゼ〔商品名〈リパーゼＡＰ１０〉天野製薬株
式会社製、１万Ｕｎｉｔ／ｇ）　３５ｇを用いた以外は
実施例２と全く同様の方法で行った。

ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様にエ
ステル交換反応を行った。

その結果は第６表に示した。

実施例８〜１１の結果を第６表に一括表示したが、いず
れの微生物起源の酵素を用いても同様の効果が認められ
た。

第　　６　　表 実施例１２ この例では実施例２及び実施例８〜１１で得られた固定
化リパーゼをエステル化に用いた。

即ち、実施例２又は実施例８〜１１で得られた固定化酵
素それぞれ１ｇを、オクチルアルコール６．３　ｇ　（
和光純薬工業株式会社製）及びオレイン酸（商品名ルナ
ツク０−ＬＬ、花王株式会社製）１３．７ｇと混合し、
４０℃にて撹拌しながらエステル合成（エステル化）反
応を行った。経時的に反応液の一部を試料として取り出
し、基準油脂分析試験法に従って試料の酸価を測定した
。試料の酸化より次式によりエステル化率を求めた。

ここで、ＡＶｔ：　を時間後の試料の酸価ＡＶｏ：反応
前の混合試料の酸価 を表す。

その結果は第７表に示した。

比較例４ 実施例２及び実施例８〜１１で用いた市販のリパーゼを
それぞれ３５．０００ｕｎｉｔ／ｇ用いて、実施例１２
と同様にエステル合成反応を行った。

その結果を第７表に示した。

第７表に示される結果から、本発明における固定化酵素
が、エステル合成反応にも適していることが明らかであ
る。

第　　７　　表 実施例１３ 次に上記のようにして得られた固定化酵素についてその
耐久性を調べた。

即ち、実施例２と比較例３で用意した固定化酵素５ｇを
それぞれジャケット付カラムに充填し、７０℃の温水に
て保温した。そこにパーム油中融点部とステアリン酸を
等量混合溶解したものを１８ｇ／Ｈｒの速度で連続的に
通液し活性の低下を調べた。

初期の反応活性に対する半減期は未処理（比較例３）の
場合が約５０時間であるのに対し、リン脂質処理固定化
酵素（実施例２）では約４００時間となり耐久性が向上
している。この間に固定化酵素１ｋｇに対して１４４０
ｋｇの反応液が処理された。

実施例１４ 実施例４で得られた固定化酵素５ｇに２％グルタルアル
デヒド水溶液５−を加え室温で１時間架橋反応を行った
０次にデカンテーシタンにより余剰のグルタルアルデヒ
ドを除去した後、２０ｓ７のイオン交換水により２回水
洗した。濾過後に室温にて水分５％となるように減圧乾
燥し固定化酵素架橋品を得た。ここで得られた固定化酵
素は８１％の活性残存率であった。この固定化酵素を用
いて実施例１３と同様の連続通液試験を行った。初期の
反応活性に対する半減期は約６３０時間となり、架橋に
よる安定化が認められた。この間に固定化酵素１ｋｇあ
たり２３００）ｃｇの反応液が処理された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リパーゼとリン脂質を接触・結合させた状態で不溶
   性担体に固定化してなる、エステル交換及びエステル合
   成に適した固定化酵素。 ２、不溶性担体がマクロ多孔性樹脂であり、固定化が吸
   着固定化である特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素
   。 ３、リパーゼを不溶性担体に固定化する前または固定化
   時にリン脂質を添加する事によりリパーゼのエステル交
   換活性およびエステル合成活性を増大させて固定化する
   ことを特徴とする固定化酵素の製造方法。 ４、リパーゼにリン脂質を添加し、リパーゼとリン脂質
   とを接触させるにあたり、炭素数８以下の脂肪族１価ア
   ルコールを用いることにより、リン脂質とリパーゼとの
   結合を促進させる特許請求の範囲第３項記載の固定化酵
   素の製造方法。 ５、リパーゼを溶解するため、リパーゼに緩衝液を添加
   する特許請求の範囲第３項又は第４項記載の固定化酵素
   の製造方法。 ６、リパーゼを溶解するための緩衝液をｐＨ３〜９に制
   御することにより、リパーゼの失活を抑制する特許請求
   の範囲第５項記載の固定化酵素の製造方法。 ７、リパーゼとリン脂質とを不溶性担体に固定化する際
   に、リパーゼの基質となる油脂類、脂肪酸、又はそれら
   の誘導体（ジグリセリド又はモノグリセリド）を添加し
   、リパーゼの活性部位を保護し失活を抑制する特許請求
   の範囲第３項又は第４項記載の固定化酵素の製造方法。 ８、不溶性担体を、リパーゼ及びリン脂質と接触させる
   前、又は接触中、又は接触させた後に、多官能性架橋剤
   で処理し、然る後、残存する架橋剤を除去する特許請求
   の範囲第３〜７項のいずれか一項に記載の固定化酵素の
   製造方法。 ９、固定化が、マクロ多孔性樹脂への吸着固定化である
   特許請求の範囲第３〜８項のいずれか一項に記載の固定
   化酵素の製造方法。 １０、固定化の温度が０〜６０℃である、特許請求の範
   囲第９項記載の固定化酵素の製造方法。