JPH0712310B2 - 脂質分解酵素の固定化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、脂質分解酵素（リパーゼ、ホスホリパーゼ、
コレステロールエステラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ
等、以後酵素と略称する場合もある）の固定化方法、お
よび、そのエステル合成、エステル交換への利用に関す
るものである。

エステル類の合成反応は、脂肪族１価アルコールと脂肪
酸によるワックスエステルの合成、モノグリセリド、ポ
リグリセリン脂肪酸エステル、糖エステルといった多価
アルコールと脂肪酸によるエステル合成、コレステリル
パルミテート等のステロイドエステル類、ゲラニルブチ
レート等のテルペンアルコールエステル類の製造方法と
して重要な技術である。

油脂類のエステル交換反応は、マーガリン・ショートニ
ング等の食用加工油脂の改質等に水素添加と並ぶ重要な
技術である。

リン脂質についても通常トランスホスファチジレーショ
ンとして知られる塩基交換反応は有用な生理活性物質等
の製造方法として重要な技術である。

〔従来の技術〕

資質分解酵素の１種であるリパーゼは温和な条件下で反
応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を
有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換
反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパー
ゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系での
み進みうる反応である。一方リパーゼのエステル合成活
性や交換活性を増大せしめるためには、酵素として少量
の水分を必要とする。特開昭55−71797号公報に開示さ
れた低水分系の反応では、充分な反応速度が得られず、
また反応速度は増大させるために必要以上の水分を与え
ると、エステルの分解反応が優先的に進行するという問
題点がある。また特開昭60−19495号公報及び特開昭60
−203196号公報に開示された、反応を多水分系の分解工
程と、水分を除去する合成工程の二段階に分けて行う方
法の提案もあるが、後者の合成反応速度は通常のエステ
ル交換速度に比して充分であるとは言えず、工程操作の
複雑化も避けられない。

以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。
リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均
一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを
不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散
可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるた
め、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすく
なる。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使
用がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業
的実施においても反応装置の連続化が容易となる点等で
ある。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。例えば、Journal of American oil
Chemist's Society,第60巻,291−294（1983）にも微量
な水分を与えた場合加水分解反応が進行することが指摘
されている。また、水に代えてグリセリンのような多価
アルコールを添加した場合では加水分解反応はある程度
抑制されるが、エステル合成・交換反応は遅くなる。ま
た、酵素水分の保持を狙い多孔質担体、高吸水性樹脂を
キトサンで包括結合跡、粉砕した担体を用いる方法（特
開昭59−213390号公報）によっても固定化酵素のエステ
ル合成・交換反応と分解反応を両立させるため、二段階
反応法（特開昭60−203196号公報）を採用している。ま
た特開昭60−98984号公報および特開昭61−202688号公
報には耐熱性を持ち80℃までの反応が可能なエステル交
換、エステル合成を目的とした固定化酵素についての開
示もあるが、この固定化方法が有効なのはムコール属の
特定のリパーゼのみであり、ムコール属由来のリパーゼ
を固定化して用いた場合でも、その特徴とする60℃〜80
℃という温度では、ジグリセリドの1,2位から1,3位への
酵素的および非酵素的転移が速く、カカオ脂に類似した
グリセリドの２位にオレイン酸を多く含有する対称型油
脂の製造を目的とする場合には、よりエステル交換反応
速度の速い固定化酵素の開発が望まれる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

以上のようにエステル合成及び交換反応においては反応
系内の水分を確実にコントロールするか、またはよりエ
ステル合成及び交換活性の高い固定化酵素の開発が望ま
れる。

エステル交換反応についてみると、水分コントロールに
ついては先に述べた二段階反応（特開昭60−203196号公
報）においても行われているが、装置的にも煩雑である
こと、また第１段の分解工程において1,2−ジグリセリ
ドを選択的、高収率で得ることと、更に第２段で1,2−
ジグリセリドから1,3−ジグリセリドへの転移をさせる
ことなく、選択的にトリグリセリドを合成することは難
しく、特に温度が高くなるほどこの転移の悪影響を抑え
る事は難しくなり、溶剤の使用等が必要となる制約され
た条件に限られる。

またエステル合成反応についてみると、従来の方法では
ほとんどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、
分解と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、
目的とするエステルの収量は低いものにとどまっている
（特開昭51−7754号公報、特開昭61−187795号公報）。
しかし固定化酵素によって反応を行えば、より低水分条
件下においてもエステル合成が行われ、酵素の回収も容
易であるが、この場合においても通常の化学的方法と同
等の反応速度を得るためには、より高活性な固定化酵素
の開発が望まれる。

リパーゼのエステル合成及びエステル交換活性を増加さ
せる方法として、特開昭60−251884号公報に開示された
リパーゼに油脂を加え加水分解反応をさせることによ
り、油脂と脂肪酸の共存下で固定化を行う方法や、特開
昭62−134090号公報に開示された脂肪酸誘導体の共存下
に乾燥する方法があるが、こうした方法により得られた
固定化リパーゼのエステル合成活性およびエステル交換
活性は前述の工業的実施にあたっては実質的には未だ十
分であるとは言えない。

一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特
開昭52−87293号公報に開示されたイオン交換樹脂の有
機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する方法
や、特開昭53−27787号公報に開示された多糖類の高級
脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを固定化する方
法、あるいはEur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.に記載
されたY.Kimura等のイオン交換樹脂にリパーゼを単にイ
オン結合により固定化する方法等の従来の方法ではいず
れも低収率にとどまり、他の挟雑物の共存下でリパーゼ
のみを選択的に固定化することは極めて困難であると考
えられていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは脂質分解酵素の分解活性のみなら
ずエステル合成及びエステル交換活性を増大させる因子
について鋭意研究を重ねた結果、水不溶性揮発性有機溶
剤と不溶性担体とを混合し、この混合物に水性媒体を分
散もしくは溶解した脂質分解酵素を加えて固定化するこ
とによりエステル合成及びエステル交換活性の増大が見
られる事実を発見し、本発明を完成するに到った。

即ち、本発明は、水不溶性揮発性有機溶剤と不溶性担体
とを混合し、この混合物に水性媒体に分散もしくは溶解
させた脂質分散酵素を加え、次いで不溶性担体を分離
し、水分５重量％以下に乾燥することを特徴とする脂質
分解酵素の固定化方法に係わるものである。

本発明においては、不溶性担体上に脂肪酸、脂肪酸誘導
体、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類、
ハロゲン化アルキル類等の油溶性化合物を予め吸着させ
ることにより、分解活性のみならずエステル合成及びエ
ステル交換活性の一層の増大が見られる。従って本発明
者らはこの事実をもとに、更に前記油溶性化合物を水不
溶性揮発性有機溶剤中で脂質分解酵素と共に種々の不溶
性担体上に吸着させる事に応用した。

従来、リパーゼと脂肪酸、脂肪酸誘導体との関係につい
ては、発酵生産において誘導基質として添加されたり、
ある種の不飽和脂肪酸または脂肪酸誘導体がある種のリ
パーゼの分解活性を活性化することが報告されているに
すぎない。詳細には、サッカロマイセス・リポリティカ
のリパーゼの分解活性をオレイン酸（Agric.Biol.Che
m.,46,2885（1982））やヒドロキシ脂肪酸（3,5−ジヒ
ドロキシ−７−テトラデセン酸）が活性化すること（Ag
ric.Biol.Chem.,50,2523（1986））、ヒドロキシ脂肪酸
誘導体（リシノレート・テトラマー（Ricinoleate tetr
amer））がヒマ種子中のリパーゼの分解活性発現に必要
なことが報告されているにすぎない。

また、リパーゼとリン脂質との関係についても、岩井ら
により1969年の日本生化学会において報告されて以来、
多くの報告がだされたが、加水分解反応での基質特異性
の変化についてか、または発酵生産の安定化、誘導につ
いてのみであり、エステル合成及びエステル交換反応で
の活性化についての報告はほとんど見られない。

これに対し本発明の好ましい態様では、脂質分解酵素を
不溶性担体上に固定化する際に、予め前記油溶性化合物
を水不溶性揮発性有機溶剤中で不溶性担体に吸着させた
後、水性媒体に分散もしくは溶解した酵素を接触させる
ことによりエステル合成活性及びエステル交換活性の高
い固定化酵素を得ることが出来る。

この方法の最も好ましい点として、第一に前記油溶性化
合物を脂質分解酵素に接触結合させておくことにより著
しく活性化できる事がわかった。これは、前述した様に
界面で働く脂質分解酵素は、界面に配向した時に活性を
発現する高次構造をとる。この高活性な状態を作り出す
のに必要な物質として水不溶性揮発性有機溶剤の他に油
溶性化合物として比較的炭素数の大きな脂肪酸、脂肪酸
誘導体、アルコール、エーテル、カルボニル化合物、ハ
ロゲン化アルキルの様に分子内に親油基と官能基を併せ
持つ物質が非常に良好であることが分かった。

第二にリパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のこ
とながら水と油脂の界面で働くため、水溶液で使用した
場合には、界面と水溶液中に酵素の分散する平衡が存在
すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用でき
ない。しかし固定化により不溶性担体表面上に並べるこ
とができれば、用いた酵素を効率良く利用する事が可能
となる。

第三に前記油溶性化合物を予め不溶性担体上に吸着させ
ておくことにより、酵素を含む培養液など他の挟雑蛋白
質や他の物質の中から酵素を短時間かつ選択的に高収率
で固定化できる点である。

すでに本出願人はこれらの知見を応用して、少量の水と
油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界面
に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成し
特許出願した（特開昭60−251884号公報） 今回本発明者らは、さらにこれらの事実を解明し、各種
の不溶性担体に前記油溶性化合物を予め吸着させること
に応用し、該担体と酵素を接触固定化する際に、簡便で
しかも高濃度に該担体上に固定化が可能となり、高活性
な固定化酵素を製造できるという本発明の完成に至っ
た。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明においては、水不溶性揮発性有機溶剤と不溶性担
体とを混合し、この混合物に水性媒体に分散もしくは溶
解させた脂質分解酵素を加える際に、好ましくは脂肪
酸、脂肪酸誘導体、アルコール類、エーテル類、カルボ
ニル化合物類、ハロゲン化アルキル類から選ばれた１種
または２種以上の油溶性化合物を、酵素溶液の添加に先
立ち水不溶性揮発性溶剤中で不溶性担体と接触させる事
により該担体に吸着させ、次いで該分散溶液に酸素溶液
を加えて接触攪拌させる事により該担体上に脂質分解酵
素を吸着固定化する。次いで該溶液より不溶性担体を濾
過しイオン交換水または緩衝液により洗浄する。こうし
て得られた固定化酵素は水分５重量％以下に乾燥させ本
発明の固定化酵素を得る。

本発明に用いる脂質分解酵素としては、リパーゼ、ホス
ホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴ
ミエリナーゼ及び各種のエステラーゼが挙げられる。こ
れらのうちリパーゼとしては、位置選択性に優れたリゾ
プス（Rhizopus）属、アスペルギルス（Aspergillus）
属、ムコール（Mucour）属、脂肪酸特異性を有するジオ
トリケム（Geotrichum）属、特異性を示さないキャンデ
ィダ（Candida）属、シュードモナス（Pseudomonas）
属、ペニシリウ（Penicillium）属、クロモバクテリウ
ム（Chromobacterium）属、等の微生物起源のリパーゼ
及びすい臓リパーゼ等の動物リパーゼが挙げられる。こ
れらのうち、特に合成活性の増加し易いリパーゼとして
は中鎖以上のアルキル基に活性位の強いリゾプス属、ム
コール属、クロモバクテリウム属起源のリパーゼが一層
好ましい。

コレステロールエステラーゼの例としては、キャンディ
ダ（Candida）属等の微生物起源の物が挙げられる。ま
た、ホスホリパーゼの例としては、キャベツ、ピーナッ
ツ、ニンジン等の植物由来の物、及びストレプトマイセ
ス属等の微生物起源の物、苔類由来の物等が挙げられ
る。

本発明に用いられる不溶性の担体としては、水およびア
ルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何
れでも良く、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、モ
レキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシ
ウム、セラミックス等の無機担体、及びセルロースパウ
ダー、ポリビニルアルコール、キトサン、イオン交換樹
脂、吸着樹脂、キレート樹脂等の有機高分子等の様なリ
パーゼ活性に影響を与えず、操作上から物理的・化学的
に安定なものであれば何れも使用できる。

また担体の形状としては、粉末状、果粒状、繊維状、ス
ポンジ状等種々あるが、そのいずれでも使用できる。特
に工程操作上の面からは400〜1000μｍの粒径を有し、
細孔径100〜1500Åの多孔性の担体を用いる物が好適で
ある。特にこの種の固定化担体として、マクロ多孔性の
吸着樹脂及びイオン交換樹脂、キレート樹脂があげられ
る。

本発明に用いられる水不溶性揮発性有機溶剤としてはク
ロロホルム、四塩化炭素等の有機塩素系溶剤、ｎ−ヘキ
サン、石油エーテル等の炭化水素系溶剤、ジエチルエー
テル、ジメチルエーテル等のエーテル類、ブタノール、
ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール等の低級ア
ルコール類が挙げられる。水不溶性揮発性有機溶剤の使
用量としては前記不溶性担体１重量部に対し１〜100重
量部、水１重量部に対して0.1〜10重量部、好ましくは
0.3〜３重量部が適当であるがこれに限定されるもので
はない。

本発明で用いられる脂肪酸としては特に規定はないが、
通常自然界に存在する炭素数４〜24の直鎖状の飽和脂肪
酸、例としてカプリル酸、ラウリン酸等の他、オレイン
酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、リシノール酸等のヒ
ドロキシ脂肪酸、もしくはイソステアリン酸等の化学的
合成により得られた分岐脂肪酸等が挙げられる。

本発明で用いられる適当な脂肪酸誘導体としては、モノ
グリセリド、ジグリセリド、及びその誘導体、あるいは
プロピレングリコール、ポリグリセリン等の多価アルコ
ール脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等の糖エステ
ル、ソルビタン脂肪酸エステル等の糖アルコールエステ
ル、燐脂質等が挙げられる。またトリグリセリドそのも
のでも良い。

本発明で用いられるアルコール類としては特に規定はな
いが、炭素数８〜24の直鎖脂肪族１価アルコール、例と
してはオクタノール、ラウリルアルコール等の飽和アル
コール、オレイルアルコール等の不飽和アルコール、も
しくは５−デカノール、イソステアリルアルコール等の
分岐状のものでもよい。さらにヘキサメチレングリコー
ル等の２価アルコールや多価アルコールも有効である。

このほかに、アルキル置換フェノール等のフェノール化
合物や、コレステロール、スチグマステロール、ブラシ
カステロール、カンペステロール等のステロール類が挙
げられる。又、フィトール、ゲラニオール、ファルネソ
ール、リナロール等のテルペンアルコール類、レチノー
ル、トコフェロール等の脂溶性ビタミン類も有効であ
る。

本発明で用いられるエーテル類の例としては、ジオクチ
ルエーテル類の長鎖のエーテル類、チミルアルコール、
バチルアルコール等のグリセリルエーテル類、またはグ
リシジルエーテル等のグリセリド類似化合物、トリエチ
レングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリ
コール等のポリオキシ化合物、前記アルコールのトリメ
チルシリルエーテル誘導体、ポリメチルシロキサン等の
シリコン化合物もよい。

本発明で用いられるカルボニル化合物の例としては、2,
4−デカジエナール、デカナール、ヘキサデカナール等
の脂肪族アルデヒド類、レチナール等のテルペン系アル
デヒド類、２−オクタノン、２−デカノン、アクチルデ
シルケトン等の脂肪族ケトン類等が挙げられる。

本発明で用いられるハロゲン化アルキルの例としては、
オレイルクロライド、オクチルクロライド、オクチルブ
ロマイドのような長鎖アルキルハライド等が挙げられ
る。

上記の油溶性化合物はいずれも常温で液状であることが
工程操作上好ましいがこれに限定されるものではない。
またこれらは単独で用いてもよいが、適当な組み合せに
より一層の効果が発揮される。

前記油溶性化合物と酵素との接触方法としては、水不溶
性揮発性有機溶剤中にこれらの油溶性化合物を分散もし
くは溶解させた後に不溶性担体を加え、予め前記油溶性
化合物を該担体上に吸着させたのち、該溶液中に酵素を
加えることにより固定化を行なうことが出来る。酵素は
予め水、緩衝溶液等の水性媒体に分散もしくは溶解して
用いる。或いは醗酵液より菌体を除去した濾液をそのま
ま用いることもできる。

前記油溶性化合物と不溶性担体の比率は、不溶性担体１
重量部に対し0.001〜１重量部が適当であることがこれ
らに限定されるものではない。過剰量の前記油溶性化合
物は不溶性担体に吸着されず溶液中に遊離して酵素を吸
着するため、不溶性担体上への固定化収率の低下を引き
起こす事になるため有効ではない。適当な吸着温度とし
ては０〜60℃、好ましくは５〜30℃が適当である。吸着
時間としては５分〜２時間が適当である。以上の温度・
時間は何れもこれに限定される物ではない。

不溶性担体上に固定化する酵素量としては、不溶性担体
１重量部に対し酵素0.001〜１重量部（乾燥重量）が適
当であるが、これに限定されるものではない。

適当な固定化温度としては０〜40℃、好ましくは５〜30
℃がよいがこれに限定されるものではない。適当な接触
時間としては５分〜５時間程度で良い。

こうして得られた固定化酵素は水分５重量％以下に乾燥
する。本固定化酵素を用いてカラム連続反応を行うには
水分１〜２重量％に乾燥することが好ましい。乾燥温度
としては室温〜80℃が良く、減圧下での乾燥が乾燥速度
の点から好ましいが、これに限定されるものではない。
乾燥速度は酵素活性発現上は特に重要ではないが、工程
操作上可能な限り速いことが好ましい。

酵素は各種緩衝液等の水性媒体に分散もしくは溶解して
用いる。この場合に必要に応じて不溶分を遠心分離また
は濾過等の操作により除去することも有効である。

酵素を分散もしくは溶解する溶液のpHは酵素の変性が起
きないような範囲であればよく、pH3〜９であればよ
い。緩衝液の種類は特に規定しないが、一般的な酢酸緩
衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いること
ができる。

本発明において、固定化前の担体に、多官能性試薬を用
いて架橋することにより、固定化酵素の繰り返し使用に
おける耐久性向上をはかることができる。多官能性の架
橋試薬としては、グリオキザール、グルタルアルデヒ
ド、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒドなどのポ
リアルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジチオイソ
シアネート、N,N′−エチレンビスマレイミドなども使
用可能である。また、カルボジイミド類も使用できる。

本発明における固定化酵素を用いたエステル合成反応の
例としては、通常のメタノール、エタノール、プロパノ
ール、オレイルアルコール等の１価アルコール、ないし
はプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール及
びポリグリセリン等の多価アルコール、またはゲラニオ
ール、シトロネロール、メントロール等のテルペンアル
コール、あるいはコレステロール等のステロールと炭素
数２〜24の脂肪酸とのエステル化反応が挙げられる。

また本発明における固定化酵素を用いたエステル交換反
応の例としては、大豆油、オリーブ油、パーム油等の植
物油脂、牛脂、豚脂、魚油などの動物油脂が挙げられ
る。これらの油脂は単独で用いてもよいが、２種以上の
油脂を用いるか、油脂と高級脂肪酸あるいは油脂と高級
脂肪酸の低級アルコールエステル間でエステル交換する
事が好ましい。特定の油脂と他の油脂、脂肪酸もしくは
その誘導体間でエステル交換する場合、両者の量比は特
定の油脂１重量部に対し他の物質は0.05〜20重量部、好
ましくは0.1〜10重量部でないと油脂の改質効果は得ら
れにくい。特に好ましくは、パーム油等の２位にオレイ
ン酸残基を多く有する油脂とステアリン酸とのエステル
交換である。この反応においてはステアリン酸の融点が
高く、油脂の粘度が高いため、カラム反応で連続エステ
ル交換反応を無溶剤で行なうためには、反応系の温度を
60〜90℃に保つ必要がある。本発明の固定化酵素はこの
目的に好適であり、また得られる油脂はチョコレート用
として有用なものである。

本発明による固定化ホスホリパーゼを用いた場合には、
天然リン脂質と各種脂肪族アルコール、多価アルコール
類、テルペンアルコール類、糖類、糖アルコール類、ス
テロール類等の他、グアニン、アデニン、チミン、ラウ
シル等の塩基とのトランスホスファチジレーション等の
反応が挙げられる。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、リパーゼ等の脂質分解酵素の持つ合成
活性を十分に発揮させる為のものであり、水不溶性揮発
性有機溶剤と不溶性担体とを混合し、この混合物に水性
媒体に分散もしくは溶解させた脂質分解酵素を加えて酵
素を固定化することにより、水のみを用いた場合と比較
して乾燥時間を短縮できると同時に活性化された固定化
酵素が得られる。又、特に不溶性担体に酵素を接触させ
固定化する前に、不溶性担体上に脂肪酸、脂肪酸誘導
体、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類、
ハロゲン化アルキル類等の油溶性化合物から選ばれた１
種もしくは２種以上を、水不溶性揮発性有機溶剤中で予
め吸着させておくことにより、酵素の活性化と選択的吸
着固定化が同時に可能となり、分解活性のみならずエス
テル交換活性、合成活性の増大が起こる。

本発明の効果として、特に位置選択性リパーゼを本発明
の方法で固定化して得た固定化リパーゼは著しい活性を
有し、グリセリドの２位にオレイン酸を多く含有する油
脂と、飽和の脂肪酸とのアシドリシス反応により、天然
のカカオ脂に類似した構造を有する対称型の油脂の製造
を目的とした場合に、ジグリセリドの副生および非対称
型への転移とそれに伴う三飽和グリセリドの副生の低減
が可能となる。

またエステル類の合成においては、従来の酵素法では反
応の進行に伴って生成する水分により反応が平衡に到達
するため、エステル化が進行しなくなる、そこで反応系
を減圧にする等の脱水操作によってエステル化をさらに
進めようとするが、こうした操作により酵素のエステル
合成活性の低下は避けられない。こうした場合に本発明
の方法による固定化酵素を用いると、低水分条件下にお
いても十分なエステル合成活性を保持しているため、短
時間の間に高いエステル化率が達成され、反応の長時間
化による着色および異臭の生成等、品質の低下が見られ
ないという利点を有する。

また、固定化操作を水と水不溶性揮発生有機溶剤の混合
系において行うため、水のみを用いた場合と比較して、
乾燥時間を短縮できるという利点がある。

以上のように本発明により、脂質分解酵素を界面での活
性型にした状態で固定化することによりエステル合成お
よびエステル交換活性が増大することを発見し、工業的
実施にあたって簡便かつ廉価に固定化酵素を製造するこ
とができる。

〔実施例〕

以下、本発明について実施例、比較例をもって詳細に説
明する。

実施例１ 市販のリパーゼ〔リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus・
japonicus）起源のリパーゼ製剤、商品名：リリパーゼ
・A10、大阪細菌研究所株式会社製、19,000unit/g〕10g
をpH5.0の10mMの酢酸緩衝液100mlに溶解した。

別に市販の弱アニオン交換樹脂〔フェノールホルムアル
デヒド系樹脂、商品名：デュオライト（Duolite）Ａ−5
68、ダイヤモンドシャムロック社製〕10gを150mlのｎ−
ヘキサンに加え30分攪拌した。この担体分散溶液に、上
記で得た酵素水溶液100mlを少量ずつ滴下して全量加
え、２時間攪拌した。次に該懸濁液より担体の樹脂を濾
別し、水で洗浄した。次いで水分５％以下となるように
常温にて減圧乾燥を行い固定化リパーゼを得た。

本実施例で得られた固定化リパーゼ（水分含量4.6％）
をそれぞれ1g用いて、パーム油中融点部（沃素価32.5、
ジグリセリド含量4.6％）10gと市販のステアリン酸〔商
品名ルナックＳ−90,ステオリン酸純度93％，花王株式
会社製〕10gを加え70℃で５時間反応を行った。反応後
カラムクロマトグラフィー（固定相フロリジル、フロリ
ジン社製、展開溶剤：ヘキサン／エチルエーテル＝2/
3）によりグリセリド画分を分離し、グリセリド中に含
まれるステアリン酸含量をガスクロマトグラフィーによ
り分析し、次式で示される平衡値を100％とした反応率
を算出した。

上の式において、 St:t時間後の油脂中のステアリン酸含量 So:原料油脂中のステアリン酸含量 Ｓ∞:1,3ランダム平衡時のステアリン酸含量を意味す
る。

結果を第１表に示す。

比較例１ 実施例１で用いた市販のリパーゼ10gをpH5.0の10mMの酢
酸緩衝液100mlに溶解した。

この溶液に実施例１で用いた市販の弱アニオン交換樹脂
（デュオライトＡ−568）10gを加え２時間攪拌した。次
に該懸濁液より担体の樹脂を濾別し、イオン交換水で洗
浄した。次いで水分５％以下となるように常温にて減圧
乾燥を行い固定化リパーゼを得た。

得られた固定化リパーゼを用いて実施例１と同様にエス
テル交換反応を行った。結果を第１表に示す。

実施例２ 実施例１で用いた市販のリパーゼ10gをpH5.0の10mMの酢
酸緩衝液100mlに溶解した。

実施例１で用いた市販の弱アニオン交換樹脂（デュオラ
イトＡ−568）10gを150mlのｎ−ヘキサンに加え、次い
でリシノール酸（商品名：リシノレイン酸、伊藤製油株
式会社製）2gを該分散溶液に加え30分攪拌した。この担
体分散溶液に、上記で得た酵素溶液100mlを少量ずつ滴
下して全量加え、２時間攪拌した。次に該懸濁液より担
体の樹脂を濾別し、イオン交換水で洗浄した。次いで水
分５％以下となるように常温にて減圧乾燥を行い固定化
リパーゼを得た。

得られた固定化リパーゼを用いて実施例１と同様にエス
テル交換反応を行った。結果を第１表に示す。

第１表から明らかな如く、本発明の固定化酵素を用いた
場合は５時間で十分な反応の進行が認められ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水不溶性揮発性有機溶剤と不溶性担体とを
   混合し、この混合物に水性媒体に分散もしくは溶解させ
   た脂質分解酵素を加え、次いで不溶性担体を分離し、水
   分５重量％以下に乾燥することを特徴とする脂質分解酵
   素の固定化方法。
2. 【請求項２】不溶性担体上に、脂肪酸、脂肪酸誘導体、
   アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類、ハロ
   ゲン化アルキル類から選ばれた１種もしくは２種以上の
   油溶性化合物を、水不溶性揮発性有機溶剤中で予め吸着
   処理する特許請求の範囲第１項記載の脂質分解酵素の固
   定化方法。
3. 【請求項３】脂質分解酵素がリパーゼ、ホスホリパー
   ゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴミエリナ
   ーゼより選ばれたものである特許請求の範囲第１項又は
   第２項記載の脂質分解酵素の固定化方法。