JPH01174384A - 脂質分解酵素の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、脂質分解酵素（リパーゼ、ホスホリパーゼ、
コレステロールエステラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ
等、以後酵素と略称する場合もある）の固定化方法、お
よび、そのエステル合成、エステル交換への利用に関す
るものである。

エステル類の合成反応は、脂肪族１価アルコールと脂肪
酸によるワックスエステ□ルの合成、モノグリセリド、
ポリグリセリン脂肪酸エステル、糖エステルといった多
価アルコールと脂肪酸によるエステル合成、コレステリ
ルパルミテート等のステロイドエステル類、ゲラニルブ
チレート等のテルペンアルコールエステル類の製造方法
として重要な技術である。

油脂類のエステル交換反応は、マーガリン・ショートニ
ング等の食用加工油脂の改質等に水素添加と並ぶ重要な
技術である。

リン脂質についても通常トランスホスファチシレージョ
ンとして知られる塩基交換反応は有用な生理活性物質等
の製造方法として重要な技術である。

〔従来の技術〕

脂質分解酵素の１種であるリパーゼは温和な条件下で反
応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を
有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換
反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパー
ゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系での
み進みうる反応である。一方リパーゼのエステル合成活
性や交換活性を増大せしめるためには、酵素として少量
の水分を特徴とする特開昭５５−７１７９７号公報に開
示された低水分系の反応では、充分な反応速度が得られ
ず、また反応速度を増大させるために必要以上の水分を
与えると、エステルの分解反応が優先的に進行するとい
う問題点がある。また特開昭６０−１９４９５号公報及
び特開昭６０−２０３１９６号公報に開示された、反応
を多水分系の分解工程と、水分を除去する合成工程の二
段階に分けて行う方法の提案もあるが、後者の合成反応
速度は通常のエステル交換速度に比して充分であるとは
言えず、工程操作の複雑化も避けられない。

以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。

リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均
一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを
不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散
可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるため
、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやずくな
る。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使用
がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業的
実施においても反応装置の連続化が容易となる点等であ
る。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。

例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｏ
ｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ’５Ｓｏｃ＋ｅｔｙ＋　第６０巻
、　２９１−２９４（１９８３）にも微量な水分を与え
た場合加水分解反応が進行することが指摘されている。

また、水に代えてグリセリンのような多価アルコールを
添加ｉ、２だ場合では加水分解反応はある程度抑制され
るが６、ゴースラール合成・交換反応は遅くなる。また
、酵素水分の保持を狙い多孔質担体、高吸水性樹脂をキ
トサンで包括結合後、粉砕した担体を用いる方法（特開
昭５９−２１３３９０号公報）によっても固定化酵素の
エステル合成・交換反応と分解反応を両立させるため、
二段階反応法（特開昭６０−２０３１９６号公報）を採
用している。また特開昭６０−９８９８４号公報および
特開昭６１−２０２６８８号公報には耐熱性を持ち８０
°Ｃまでの反応が可能なエステル交換、エステル合成を
目的とした固定化酵素についての開示もあるが、この固
定化方法が有効なのはムコール属の特定のリパーゼのみ
であり、ムコール属由来のリパーゼを固定化して用いた
場合でも１、その特徴とする６０°Ｃ〜８０’Ｃという
温度では、ジグリセリドの１，２位から１．３位への酵
素的および非酵素的転移が速く、カカオ脂に類似したグ
リセリドの２位にオレイン酸を多く含有する対称型油脂
の製造を目的とする場合には、よりエステル交換反応速
度の速い固定化酵素の開発が望まれる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

以上のようにエステル合成及び交換反応においては反応
系内の水分を確実にコントロールするか、またはよりエ
ステル合成及び交換活性の高い固定化酵素の開発が望ま
れる。

エステル交換反応についてみると、水分コントロールに
ついては先に述べた二段階反応（特開昭６０−２０３１
９６号公報）においても行われているが、装置的にも煩
雑であること、また第１段の分解工程において１，２−
ジグリセリドを選択的、高収率で得ることと、更に第２
段で１，２−ジグリセリドから１，３−ジグリセリドへ
の転移をさせることなく、選択的にトリグリセリドを合
成することは難しく、特に温度が高くなるほどこの転移
の悪影響を抑える事は難しくなり、溶剤の使用等が必要
となる制約された条件に限られる。

またエステル合成反応についてみると、従来の方法では
ほとんどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、
分解と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、
目的とするエステルの収量は低いものにとどまっている
（特開昭５１−７７５４号公報、特開昭６１−１８７７
９５号公報）。

しかし固定化酵素によって反応を行えば、より低水分条
件下においてもエステル合成が行われ、酵素の回収も容
易であるが、この場合においても通常の化学的方法と同
等の反応速度を得るためには、より高活性な固定化酵素
の開発が望まれる。

リパーゼのエステル合成及びエステル交換活性を増加さ
せる方法として、特開昭６０−２５１８８４号公報に開
示されたリパーゼに油脂を加え加水分解反応をさせるこ
とにより、油脂と脂肪酸の共存下で固定化を行う方法や
、特開昭６２−１３４０９０号公報に開示された脂肪酸
誘導体の共存下に乾燥する方法があるが、こうした方法
により得られた固定化リパーゼのエステル合成活性およ
びエステル交換活性は前述の工業的実施にあたっては実
質的には未だ十分であるとは言えない。

一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特
開昭５２−８７２９３号公報に開示されたイオン交換樹
脂の有機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する
方法や、特開昭５３−２７７８７号公報に開示された多
Ｉｉ類の高級脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを固
定化する方法、あるいはＥｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

に記載されたＹ、Ｋｉｍｕｒａ等のイオン交換樹脂にリ
パーゼを単にイオン結合により固定化する方法等の従来
の方法ではいずれも低収率にとどまり、他の挟雑物の共
存下でリパーゼのみを選択的に固定化することは極めて
困難であると考えられていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは脂質分解酵素の分解活性のみなら
ずエステル合成及びエステル交換活性を増大させる因子
について鋭意研究を重ねた結果、水不溶性揮発性有機溶
剤と不溶性担体とを混合し、この混合物に水性媒体に分
散もしくは溶解した脂質分解酵素を加えて固定化するこ
とによりエステル合成及びエステル交換活性の増大が見
られる事実を発見し、本発明を完成するに到った。

即ち、本発明は、水不溶性揮発性有機溶剤と不溶性担体
とを混合し、この混合物に水性媒体に分散もしくは溶解
させた脂質分解酵素を加え、次いで不溶性担体を分離し
、水分５重量％以下に乾燥することを特徴とする脂質分
解酵素の固定化方法に係わるものである。

本発明においては、不溶性担体上に脂肪酸、脂肪酸誘導
体、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類、
ハロゲン化アルキル類等の油溶性化合物を予め吸着させ
ることにより、分解活性のみならずエステル合成及びエ
ステル交換活性の一層の増大が見られる。従って本発明
者らはこの事実をもとに、更に前記油溶性化合物を水不
溶性揮発性有機溶剤中で脂質分解酵素と共に種々の不溶
性担体上に吸着させる事に応用した。

従来、リパーゼと脂肪酸、脂肪酸誘導体との関係につい
ては、発酵生産において誘導基質として添加されたり、
ある種の不飽和脂肪酸または脂肪酸誘導体がある種のリ
パーゼの分解活性を活性化することが報告されているに
すぎない。

詳細には、サツカロマイセス・リボリテイカのリパーゼ
の分解活性をオレイン酸（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　４６．２８８５（１９８２））やヒドロ
キシ脂肪酸（３゜５−ジヒドロキシ−７−チトラデセン
酸）が活性化すること（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、、　５（１＋　２５２３（１９８６））　、ヒ
ドロキシ脂肪酸誘導体（リシルレート・テトラマー（Ｒ
４ｃｉｎｏｌｅａｔｅ　ｔｅｔｒａｍｅｒ））がヒマ種
子中のリパーゼの分解活性発現に必要なことが報告され
ているにすぎない。

また、リパーゼとリン脂質との関係についても、岩井ら
により１９６９年の日本生化学会において報告されて以
来、多くの報告がだされたが、加水分解反応での基質特
異性の変化についてか、または発酵生産の安定化、誘導
についてのみであり、エステル合成及びエステル交換反
応での活性化についての報告はほとんど見られない。

これに対し本発明の好ましい態様では、脂質分解酵素を
不溶性担体上に固定化する際に、予め前記油溶性化合物
を水不溶性揮発性有機溶剤中で不溶性担体に吸着させた
後、水性媒体に分散もしくは溶解した酵素を接触させる
ことによりエステル合成活性及びエステル交換活性の高
い固定化酵素を得ることが出来る。

この方法の最も好ましい点として、第一に前記油溶性化
合物を脂質分解酵素に接触結合させておくことにより著
しく活性化できる事がわかった。これは、前述した様に
界面で働く脂質分解酵素は、界面に配向した時に活性を
発現する高次構造をとる。この高活性な状態を作り出す
のに必要な物質として水不溶性揮発性有機溶剤の他に油
溶性化合物として比較的炭素数の大きな脂肪酸、脂肪酸
誘導体、アルコール、エーテル、カルボニル化合物、ハ
ロゲン化アルキルの様に分子内に親油基と官能基を併せ
持つ物質が非常に良好であることが分かった。

第二にリパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のこ
とながら水と油脂の界面で動くため、水溶液で使用した
場合には、界面と水溶液中に酵素の分散する平衡が存在
すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用でき
ない。しかし固定化により不溶性担体表面上に並べるこ
とができれば、用いた酵素を効率良く利用する事が可能
となる。

第三に前記油溶性化合物を予め不溶性担体上に吸着させ
ておくことにより、酵素を含む培養液など他の挟雑蛋白
質や他の物質の中から酵素を短時間かつ選択的に高収率
で固定化できる点である。

すでに本出願人はこれらの知見を応用して、少量の水と
油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界面
に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成し
特許出願した（特開昭６０−２５１８８４号公報） 今回本発明者らは、さらにこれらの事実を解明し、各種
の不溶性担体に前記油溶性化合物を予め吸着させること
に応用し、該担体と酵素を接触固定化する際に、簡便で
しかも高濃度に該担体上に固定化が可能となり、高活性
な固定化酵素を製造できるという本発明の完成に至った
。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明においては、水不溶性揮発性有機溶剤と不溶性担
体とを混合し、この混合物に水性媒体に分散もしくは熔
解させた脂質分解酵素を加える際に、好ましくは脂肪酸
、脂肪酸誘導体、アルコール類、エーテル類、カルボニ
ル化合物類、ハロゲン化アルキル類から選ばれた１種ま
たは２種以上の油溶性化合物を、酵素溶液の添加に先立
ち水不溶性揮発性溶剤中で不溶性担体と接触させる事に
より該担体に吸着させ、次いで該分散溶液に酵素溶液を
加えて接触撹拌させる事により該担体上に脂質分解酵素
を吸着固定化する。次いで該溶液より不溶性担体を濾過
しイオン交換水または緩衝液により洗浄する。こうして
得られた固定化酵素は水分５重量％以下に乾燥させ本発
明の固定化酵素を得る。

本発明に用いる脂質分解酵素としては、リパーゼ、ホス
ホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフインゴ
ミエリナーゼ及び各種のエステラーゼが挙げられる。こ
れらのうちリパーゼとしては、位置選択性に優れたリゾ
プス（Ｒｈｉ−ｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｕｒ）属
、脂肪酸特異性を有するジオトリケム（Ｇｅｏｔｒｉｃ
ｈｕｍ）属、特異性を示さないキャンディダ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）属、ベニシリウ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クロ
モバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
、等の微生物起源のリパーゼ及びすい臓リパーゼ等の動
物リパーゼが挙げられる。これらのうち、特に合成活性
の増加し易いリパーゼとしては中鎖以上のアルキル基に
活性位の強いリゾプス属、ムコール属、クロモバクテリ
ウム属起源のリパーゼが一層好ましい。

コレステロールエステラーゼの例としては、キャンディ
ダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の微生物起源の物が挙げられ
る。また、ホスホリパーゼの例としては、キャベツ、ビ
ーナツツ、ニンジン等の植物由来の物、及びストレプト
マイセス属等の微生物起源の物、苔類由来の物等が挙げ
られる。

本発明に用いられる不溶性の担体としては、水およびア
ルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何
れでも良く、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、モ
レキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシ
ウム、セラミックス等の無機担体、及びセルロースパウ
ダー、ポリビニルアルコール、キトサン、イオン交換樹
脂、吸着樹脂、キレート樹脂等の有機高分子等の様なリ
パーゼ活性に影響を与えず、操作上から物理的・化学的
に安定なものであれば何れも使用できる。

また担体の形状としては、粉末状、果粒状、繊維状、ス
ポンジ状等種々あるが、そのいずれでも使用できる。特
に工程操作上の面からは４００〜１０００−の粒径を有
し、細孔径１００〜１５００人の多孔性の担体を用いる
物が好適である。特にこの種の固定化担体として、マク
ロ多孔性の吸着樹脂及びイオン交換樹脂、キレート樹脂
があげられる。

本発明に用いられる水不溶性揮発性有機溶剤としてはク
ロロホルム、四塩化炭素等の有機塩素系溶剤、ｎ−ヘキ
サン、石油エーテル等の炭化水素系溶剤、ジエチルエー
テル、ジメチルエーテル等のエーテル類、ブタノール、
ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタツール等の低級ア
ルコール類が挙げられる。水不溶性揮発性有機溶剤の使
用量としては前記不溶性担体１重量部に対し１〜１００
重量部、水１重量部に対して０．１〜１０重量部、好ま
しくは０．３〜３重量部が適当であるがこれに限定され
るものではない。

本発明で用いられる脂肪酸としては特に規定はないが、
通常自然界に存在する炭素数４〜２４の直鎖状の飽和脂
肪酸、例としてカプリル酸、ラウリン酸等の他、オレイ
ン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、リシノール酸等の
ヒドロキシ脂肪酸、もしくはイソステアリン酸等の化学
的合成により得られた分岐脂肪酸等が挙げられる。

本発明で用いられる適当な脂肪酸誘導体としては、モノ
グリセリド、ジグリセリド、及びその誘導体、あるいは
プロピレングリコール、ポリグリセリン等の多価アルコ
ール脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等の糖エステ
ル、ソルビタン脂肪酸エステル等の糖アルコールエステ
ル、燐脂質等が挙げられる。またトリグリセリドそのも
のでも良い。

本発明で用いられるアルコール類としては特に規定はな
いが、炭素数８〜２４の直鎖脂肪族１価アルコール、例
としてはオクタツール、ラウリルアルコール等の飽和ア
ルコール、オレイルア ルコール −デカノール、イソステアリルアルコール等の分岐状の
ものでもよい。さらにヘキサメチレングリコール等の２
価アルコールや多価アルコールも有効である。

このほかに、アルキル置換フェノール等のフェノール化
合物や、コレステロール、スチグマステロール、ブラシ
カステロール、カンペステロール等のステロール類が挙
げられる。又、フィトール、ゲラニオール、ファルネソ
ール、リナロール等のテルペンアルコール類、レチノー
ル、トコフェロール等の脂溶性ビタミン類も有効である
。

本発明で用いられるエーテル類の例としては、ジオクチ
ルエーテル等の長鎖のエーテル類、チミルアルコール、
バチルアルコール等のグリセリルエーテル類、またはグ
リシジルエーテル等のグリセリド類似化合物、トリエチ
レングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリ
コール等のポリオキシ化合物、前記アルコールのトリメ
チルシリルエーテル誘導体、ポリメチルシロキサン等の
シリコン化合物もよい。

本発明で用いられるカルボニル化合物の例としては、２
．４−デカジェナール、デカナール、ヘキザデカナール
等の脂肪族アルデヒド類、レチナール等のテルペン系ア
ルデヒド類、２−オクタンン、２−デカノン、オクチル
デシルケトン等の脂肪族ケトン類等が挙げられる。

本発明で用いられるハロゲン化アルギルの例としては、
オレイルクロライド、オクチルクロライド、オクチルブ
ロマイドのような長鎖アルキルハライド等が挙げられる
。

上記の油溶性化合物はいずれも常温で液状であることが
工程操作上好ましいがこれに限定されるものではない。

またこれらは単独で用いてもよいが、適当な組み合せに
より一層の効果が発揮される。

前記油溶性化合物と酵素との接触方法としては、水不溶
性揮発性有機溶剤中にこれらの油溶性化合物を分散もし
くは溶解させた後に不溶性担体を加え、予め前記油溶性
化合物を該担体上に吸着させたのち、該溶液中に酵素を
加えることにより固定化を行なうことが出来る。酵素は
予め水、緩衝溶液等の水性媒体に分散もしくは溶解して
用いる。或いは醗酵液より菌体を除去した濾液をそのま
ま用いることもできる。

前記油溶性化合物と不溶性担体の比率は、不溶性担体１
重量部に対し０．００１〜１重量部が適当であるがこれ
らに限定されるものではない。

過剰量の前記油溶性化合物は不溶性担体に吸着されず溶
液中に遊離して酵素を吸着するため、不溶性担体上への
固定化収率の低下を引き起こす事になるため有効ではな
い。適当な吸着温度としては０〜６０°Ｃ１好ましくは
５〜３０°Ｃが適当である。吸着時間としては５分〜２
時間が適当である。以上の温度・時間は何れもこれらに
限定される物ではない。

不溶性担体上に固定化する酵素量としては、不溶性担体
１重量部に対し酵素０．００１〜１重量部（乾燥型Ｎ）
が適当であるが、これに限定されるものではない。

適当な固定化温度としてはＯ〜４０“Ｃ１好ましくは５
〜３０°Ｃがよいがこれに限定されるものではない。適
当な接触時間としては５分〜５時間程度で良い。

こうして得られた固定化酵素は水分５重量％以下に乾燥
する。本固定化酵素を用いてカラム連続反応を行うには
水分１〜２重量％に乾燥することが好ましい。乾燥温度
としては室温〜８０°Ｃが良く、減圧下での乾燥が乾燥
速度の点から好ましいが、これに限定されるものではな
い。

乾燥速度は酵素活性発現上は特に重要ではないが、工程
操作上可能な限り速いことが好ましい。

酵素は各種緩衝液等の水性媒体に分散もしくは溶解して
用いる。この場合に必要に応じて不溶分を遠心分離また
は濾過等の操作により除去することも有効である。

酵素を分散もしくは溶解する溶液のｐｉは酵素の変性が
起きないような範囲であればよく、ｐ＋＋３〜９であれ
ばよい。緩衝液の種類は特に規定しないが、−船釣な酢
酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いる
ことができる。

本発明において、固定化前の担体に、多官能性試薬を用
いて架橋することにより、固定化酵素の繰り返し使用に
おける耐久性向上をはかることができる。多官能性の架
橋試薬としては、グリオキザール、グルタルアルデヒド
、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒドなどのポリ
アルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジチオイソシ
アネート、Ｎ、Ｎ’−エチレンビスマレイミドなども使
用可能である。また、カルボジイミド類も使用できる。

本発明における固定化酵素を用いたエステル合成反応の
例としては、通常のメタノール、エタノール、プロパツ
ール、オレイルアルコール等の１価アルコール、ないし
はプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール及
びポリグリセリン等の多価アルコール、またはゲラニオ
ール、シトロネロール、メントール等のテルペンアルコ
ール、あるいはコレステロール等のスチロールと炭素数
２〜２４の脂肪酸とのエステル化反応が挙げられる。

また本発明における固定化酵素を用いたエステル交換反
応の例としては、大豆油、オリーブ油、パーム油等の植
物油脂、牛脂、肝脂、魚油などの動物油脂が挙げられる
。これらの油脂は単独で用いてもよいが、２種以上の油
脂を用いるか、油脂と高級脂肪酸あるいは油脂と高級脂
肪酸の低級アルコールエステル間でエステル交換する事
が好ましい。特定の油脂と他の油脂、脂肪酸もしくはそ
の誘導体間でエステル交換する場合、両者の量比は特定
の油脂１重量部に対し他の物質は０．０５〜２０重量部
、好ましくは０．１〜１０重量部でないと油脂の改質効
果は得られにくい。特に好ましくは、パーム油等の２位
にオレイン酸残基を多く有する油脂とステアリン酸との
エステル交換である。この反応においてはステアリン酸
の融点が高く、油脂の粘度が高いため、カラム反応で連
続エステル交換反応を無溶剤で行なうためには、反応系
の温度を６０〜９０゛Ｃに保つ必要がある。本発明の固
定化酵素はこの目的に好適であり、また得られる油脂は
チョコレート用として有用なものである。

本発明による固定化ホスホリパーゼを用いた場合には、
天然リン脂質と各種脂肪族アルコール、多価アルコール
類、テルペンアルコール類、Ｉｉ類、糖アルコール類、
ステロール類等の他、グアニン、アデニン、チミン、ウ
ラシル等の塩基とのトランスホスファチシレージョン等
の反応が挙げられる。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、リパーゼ等の脂質分解酵素の持つ合成
活性を十分に発揮させる為のものであり、水不溶性揮発
性有機溶剤と不溶性担体とを混合し、この混合物に水性
媒体に分散もしくは溶解させた脂質分解酵素を加えて酵
素を固定化することにより、水のみを用いた場合と比較
して乾燥時間を短縮できると同時に活性化された固定化
酵素が得られる。又、特に不溶性担体に酵素を接触させ
固定化する前に、不溶性担体上に脂肪酸、脂肪酸誘導体
、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類、゛
゛ハロゲン化アルキル類等の油溶性化合物から選ばれた
１種もしくは２種以上を、水不溶性揮発性有機溶剤中で
予め吸着させておくことにより、酵素の活性化と選択的
吸着固定化が同時に可能となり、分解活性のみならずエ
ステル交換活性、合成活性の増大が起こる。

本発明の効果として、特に位置ｆ択性リパーゼを本発明
の方法で固定化して得た固定化リパーゼは著しい活性を
有し、グリセリドの２位にオレイン酸を多く含有する油
脂と、飽和の脂肪酸とのアシドリシス反応により、天然
のカカオ脂に類似した構造を有する対称型の油脂の製造
を目的とした場合に、ジグリセリドの副生および非対称
型への転移とそれに伴う三飽和グリセリドの副生の低減
が可能となる。

またエステル類の合成においては、従来の酵素法では反
応の進行に伴って生成する水分により反応が平衡に到達
するため、エステル化が進行しなくなる、そこで反応系
を減圧にする等の脱水操作によってエステル化をさらに
進めようとするが、こうした操作により酵素のエステル
合成活性の低下は避けられない。こうした場合に本発明
の方法による固定化酵素を用いると、低水分条件下にお
いても十分なエステル合成活性を保持しているため、短
時間の間に高いエステル化率が達成され、反応の長時間
化による着色および異臭の生成等、品質の低下が見られ
ないという利点を有する。

また、固定化操作を水と水不溶性揮発性有機溶剤の混合
系において行うため、水のみを用いた場合と比較して、
乾燥時間を短縮できるという利点がある。

以上のように本発明により、脂質分解酵素を界面での活
性型にした状態で固定化することによりエステル合成お
よびエステル交換活性が増大することを発見し、工業的
実施にあたって簡便かつ廉価に固定化酵素を製造するこ
とができる。

〔実施例〕

以下、本発明について実施例、比較例をもって詳細に説
明する。

実施例１ 市販のリパーゼ〔リゾプス・ジャボニカス（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ−ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）起源のリパーゼ製剤、商
品名：リリパーゼ−Ａ１０、大阪細菌研究所株式会社製
、１９，０ＯＯｕｎｉｔ／　ｇ　）　１０ｇをｐ）１５
．０の１０１の酢酸緩衝液１００　ｍ７に溶解した。

別に市販の弱アニオン交換樹脂〔フェノールホルムアル
デヒド系樹脂、商品名：デュオライト（Ｄｕｏｌｉｔｅ
）Ａ−５６８、ダイヤモンドシャムロツタ社製〕１０ｇ
を１５０　ｍＺのｎ−ヘキサンに加え３０分撹拌した。

この担体分散溶液に、上記で得た酵素水溶液１００　＠
Ｚを少量ずつ滴下して全量加え、２時間撹拌した。次に
該懸濁液より担体の樹脂を濾別し、水で洗浄した。次い
で水分５％以下となるように常温にて減圧乾燥を行い固
定化リパーゼを得た。

本実施例で得られた固定化リパーゼ（水分含量４．６％
）をそれぞれ１ｇ用いて、パーム油中融点部（沃素価３
２．５、ジグリセリド含量４．６％）Ｌｏｇと市販のス
テアリン酸〔商品名ルナツク５−９０、ステアリン酸純
度９３％、花王株式会社製〕Ｌｏｇを加え７０°Ｃで５
時間反応を行った。反応後カラムクロマトグラフィー（
固定相フロリジル、フロリジン社製、展開溶剤：ヘキサ
ン／エチルエーテル−２／３）によりグリセリド画分を
分離し、グリセリド中に含まれるステアリン酸含量をガ
スクロマトグラフィーにより分析し、次式で示される平
衡値を１００％とした反応率を算出した。

上の式において、 Ｓｔ：を時間後の油脂中のステアリン酸含量Ｓｏ：原料
油脂中のステアリン酸含量 Ｓω：１．３ランダム平衡時のステアリン酸含量を意味
する。

結果を第１表に示す。

比較例１ 実施例１で用いた市販のリパーゼＬｏｇをｐＨ５，０の
１０ｍＭの酢酸緩衝液１００　＋ｎ７に溶解した。

この溶液に実施例１で用いた市販の弱アニオン交換樹脂
（デュオライトＡ−５６８）　１０　ｇを加え２時間撹
拌した。次に該懸濁液より担体の樹脂を濾別し、イオン
交換水で洗浄した。次いで水分５％以下となるように常
温にて減圧乾燥を行い固定化リパーゼを得た。

得られた固定化リパーゼを用いて実施例１と同様にエス
テル交換反応を行った。結果を第１表に示す。

実施例２ 実施例１で用いた市販のリパーゼＬｏｇをｐｎｓ、。

の１０ｍＭの酢酸緩衝液１００　ｍｌに溶解した。

実施例１で用いた市販の弱アニオン交換樹脂（デュオラ
イトＡ−５６８）　１０　ｇを１５０　ｍｌのｎ−ヘキ
サンに加え、次いでリシノール酸（商品名：リシルイン
酸、伊藤製油株式会社製）２ｇを該分散溶液に加え３０
分撹拌した。この担体分散溶液に、上記で得た酵素溶液
１００　ｍｌを少量ずつ滴下して全量加え、２時間撹拌
した。次に該懸濁液より担体の樹脂を濾別し、イオン交
換水で洗浄した。次いで水分５％以下となるように常温
にて減圧乾燥を行い固定化リパーゼを得た。

得られた固定化リパーゼを用いて実施例１と同様にエス
テル交換反応を行った。結果を第１表に示す。

第１表 第１表から明らかな如く、本発明の固定化酵素を用いた
場合は５時間で十分な反応の進行が認められ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水不溶性揮発性有機溶剤と不溶性担体とを混合し、
   この混合物に水性媒体に分散もしくは溶解させた脂質分
   解酵素を加え、次いで不溶性担体を分離し、水分５重量
   ％以下に乾燥することを特徴とする脂質分解酵素の固定
   化方法。 ２、不溶性担体上に、脂肪酸、脂肪酸誘導体、アルコー
   ル類、エーテル類、カルボニル化合物類、ハロゲン化ア
   ルキル類から選ばれた１種もしくは２種以上の油溶性化
   合物を、水不溶性揮発性有機溶剤中で予め吸着処理する
   特許請求の範囲第１項記載の脂質分解酵素の固定化方法
   。 ３、脂質分解酵素がリパーゼ、ホスホリパーゼ、コレス
   テロールエステラーゼ、スフィンゴミエリナーゼより選
   ばれたものである特許請求の範囲第１項又は第２項記載
   の脂質分解酵素の固定化方法。